第十章 甾体激素类药物的分析

null第十章 甾体激素类药物的分析 第十章 甾体激素类药物的分析 null第一节 基本结构和分类 一、基本结构： 主要特点 ：   A环:多数为脂环， 有△4-3-酮，少数为苯环   C3:可能有酮基或烃基;   C10、C13:多数均有角甲基 少数C10上无角甲基   Cll:可能有酮基或羟基;  C17:可能有羟基 、酮基 、甲酮基 、α-醇酮基 、甲基 、乙炔基 等;基本结构：环戊烷骈多氢菲null二、分类 甾体激素 肾上腺皮质激素 雄性激素及 蛋白同化激素 性激素 孕激素 雌激素null1、肾上腺皮质激素 (简称皮质激素) 如氢化可的松、曲安西龙、醋酸地塞米松等。   结构特点： ★具有21个C原子 ★ A环:具有△4-3-酮基 ★ C17:具有α-醇酮基并多数有α-羟基 ★ C10、C13:具有角甲基 ★ C11:具有羟基或酮基 ★具有紫外吸收氢化可的松肾上腺皮质激素肾上腺皮质激素醋酸地塞米松C1、C2和C4、C5之间双键9抗炎作用增强16羟基形成醋酸酯，肌注时可延长作用时间null2、雄性激素及蛋白同化激素 雄性激素：睾酮的衍生物，如甲睾酮、丙酸睾酮、十一酸睾酮等 蛋白同化激素有苯丙酸诺龙 null结构特点： ★雄性激素母核有19个C原子 蛋白同化激素母核有18个C原子 ★A环:具有△4-3-酮基 ★C17:无侧链，多数是一个β—羟基，有些是由它形成的酯 ★具有紫外吸收雄性激素： 丙酸睾酮蛋白同化激素： 苯丙酸诺龙Cl0上无角甲基null3、孕激素 黄体激素或孕酮。典型药物为黄体酮。 中国药典收载有:黄体酮、醋酸甲地孕酮原料及制剂等。 null结构特点： ★母核具有21个C原子; ★A环:具有△4-3-酮基 ★C17:具有甲酮基，有些具有α-羟基，与醋酸、己酸等形成酯 黄体酮醋酸甲地孕酮null4、雌激素（卵泡激素） 收载有：雌二醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇等 结构特点： ★母核具有18个C原子; ★A环:为苯环， ★C3：具有酚羟基且有些形成了酯或醚; ★Cl0:无角甲基 ★C17:具有β-羟基，有些烃基形成了酯，还有些具有乙炔基。炔雌醇雌二醇null第二节 鉴别试验 一、物理常数的测定：熔点、比旋度、吸收系数等 二、化学鉴别法 （一）与强酸的呈色反应 许多甾体激素（母核）能与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色，其中以与硫酸的呈色反应应用较广。 甾体激素类药物呈色H2SO4 H3PO4 HClO4 HClnullnull（二）官能团的反应 1、C17-α-醇酮基 肾上腺皮质激素药物呈色四氮唑盐 OHˉ具还原性氧化剂此外还有斐林试液、多伦试液null甾酮类激素药物腙（黄色）羰基试剂2.酮基的呈色反应: C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼3、甲酮基的呈色反应3、甲酮基的呈色反应具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物呈色亚硝基铁氰化钠 （间二硝基酚、芳香醛）null黄体酮蓝紫色亚硝基铁 氰化钠其他甾体淡橙色 或不显色专属的鉴别反应null有机氟Fˉ有机破坏有机氯Clˉ4、有机卤素的呈色反应茜素氟蓝 硝酸亚铈硝酸—硝酸银AgCl↓ 呈色 null5、酚羟基的呈色反应雌激素类药物红色偶 氮染料重氮苯磺酸null含炔基的甾体激素银盐沉淀硝酸银6、 乙炔基的沉淀反应null三、制备衍生物测定其熔点  与一些试剂反应生成酯、肟、缩氨脲  利用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，然后测定其熔点进行鉴别。 本法虽繁琐费时，但专属性强，目前仍为一些国家药典采用。 null1. 缩氨基脲的生成m.p.约182℃（分解）2. 酯的水解m.p.为150℃~ 156℃null四、紫外分光光度法 分子中有α，β—不饱和酮、苯环和其他的共轭结构，在紫外光区有特征吸收 △４-3-酮 240nm苯环 280nmnull曲安息龙丙酸倍氯米松 溶剂甲醇乙醇20μg/ml浓度20μg/ml结果判断在238nm处有最大吸收在239nm处有最大吸收，A为 0.57～0.60，在239nm与263nm 处的吸收度比值为2.25～2.45null五、红外分光光度法 甾体激素类药物结构复杂，红外吸收光谱是鉴别该类药物有效而可靠的方法 中国药典 载的甾体激素原料，其中大多采用该法鉴别。null结构特征：酚羟基、C17 –OH C17 –乙炔基炔雌醇null1505cm-13505cm-13300cm-11590cm-13610cm-1酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动null六、 TLC法 主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别 方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。null炔诺酮 TLC图 注意点： ★供试品要作前处理； ★显色后要立即检视 null七、高效液相色谱法 在一定的色谱条件下，比较甾体激素样品与其对照品峰的保留时间进行鉴别。 一般都规定在含量测定项下的高效液相色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。 null1、定义 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体” 其他甾体与甾体激素药物结构相似，也有一定的药理作用而又互不相同. 第三节特殊杂质检查 一、其他甾体null2、来源 原料、中间体、异构体、降解产物 3、特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似 4、方法（具有一定分离能力） TLC法（高低浓度对比法） HPLC法（类似高低浓度对比法） null１、薄层色谱法：中国药典 (2005年版) (1)薄层板 ：硅胶G板，硅胶ＧＦ254或硅胶ＨＦ254。 (2)供试液和对照液的制备 ：分别用溶剂(如氯仿-甲醇或甲醇或氯仿或丙酮)配成一定浓度的溶液。 (3)展开剂系统：各种不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶剂用得较多， (4)显色剂： 碱性四氮唑蓝试液， 硫酸-乙醇 (2:8或1:1或3:7), 20％硫酸， 10％磷钼酸-乙醇液。null(5)检出法： ★碱性四氮唑蓝试液 晾干，１０５℃烘１０分钟放冷，喷以碱性四氮挫蓝试液，立即检 ★硫酸-乙醇 晾干后，先喷显色剂，再在１２０℃烘５分钟 ★ 20％硫酸 晾干后，先喷显色剂，再在１０５℃烘１０分钟 ★ 10％磷钼酸-醋酸 晾干，喷显色剂，在1OO℃加热10一l5min, (6)判定法：按规定的斑点数目和颜色判断 null2、高效液相色谱法 中国药典 (2005年版)所列的色谱条件如下: (1)色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶。 (2)流动相： 各种不同比例的甲醇-水混合溶剂。 (3)检测器：紫外吸收检测器 (241nm、254 nm、28 nm、218 nm、230 nm、288 nm等，视品种而定)。null(4)供试液和对照液的制备：高浓度者为溶液①，低浓度者为溶液②。 (5)判定法：溶液①显示的杂质峰数不得超过1个或数个;各杂质峰面积或其总和不得大于溶液②主峰面积的一定分数。 即按各药品项下规定的杂质峰的数目和面积的要求进行判定。 null例如，黄体酮中"其他甾体"的检查方法如下: 取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成8mg/lm1的溶液①与0.02mg/lml的溶液②。 用含量测定项下的方法和溶液，取5u1注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满标度。 再分别取溶液①和②各10 u1进样。 记录色谱图至主成分峰保留时间的1.5倍。 溶液①显示的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于溶液②主峰面积的3/4。 null≤图A中峰1面积的四分之三 二、硒的检查 来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢剧毒方法原理： 三、甲醇和丙酮 药典规定采用气相色谱法测定时不得出现甲醇峰。该法测定甲醇时检测限为3.1ng。 甲醇 ≤ 0.3％ 丙酮 ≤5.0% 内标法 + 校正因子 null四、游离磷酸 目的：地塞米松磷酸钠在生产和贮存过程中可能引入磷酸盐，需对游离磷酸盐进行检查。 null原理：方法：钼蓝null 地塞米松磷酸钠 检查 游离磷酸 精密称取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20℃放置30～50分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。（对照液 0.0035%KH2PO4）（对照液 0.0035%KH2PO4）null第四节 含量测定 一、高效液相色谱法（48%） 以反相分配色谱用于甾体激素的含量测定最为广泛。 固定相：十八烷基硅烷键合硅胶; 流动相：甲醇和水组成的混合液， 紫外检测器：具有△4-3-酮基和苯环，在240nm或280nm附近有吸收 null示例：黄体酮的含量测定 色谱条件：固定相 ODS，流动相 甲醇-水 （65:35），检测波长254nm， 内标物 己烯雌酚 系统适用性试验：n>1000，R符合规定。 null测定样品：黄体酮原料、注射液。 定量方法：内标法A、对照品B、供试品null二、紫外分光光度法（30% ） 分子中存在△4-3—酮基、苯环和其他共轭系统，因而在紫外光区有特征吸收。 △４-3-酮 240nm（±）肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素 苯环 280nm（±）雌激素null例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查 （1）配制供试液，取10片分别进行测 （2）测定：240nm （3）计算null规格：0.75 mg/片 吸收系数＝357 计算每片以标示量为100％的含量X，求出平均值和差S，差值AA+1.80S≤15.0 合格 A+S>15.0 不合格 A+1.80S>15.0且A+S≤15.0 复试null三、比色法 （一）异烟肼比色法 1、原理肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素 420 nmnull对照品法null2、测定方法 例：醋酸地塞米松软膏的含量测定为例： ★对照品溶液的制备：精密称取醋酸地塞米松对照品25mg，置1OOml量瓶中，加无水乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5m1，用无水乙醇稀释至5Oml，摇匀，甚可得。 ★供试品溶液的制备：取本品适量 (约相当于醋酸地塞米松2·5mg)，精密称定，置烧杯内，加无水乙醇约25m1，置水浴中加热，搅拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷却;滤过，滤液置1OOml量瓶中，同法提取3次，滤液并人量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。null★测定方法：精密量取对照品溶液及供试品溶液各lOmI，分别置具塞容器中，置水浴中蒸去乙醇，残渣中加氯仿lOmI，振摇，使残渣溶解，各精密加0.1%异烟肼甲醇溶液lOml(取异烟肼0·5g，加盐酸0·63m1，加甲醇使溶解成5OOml，即得)，摇匀，置55℃暗处保温45min，取出、放冷至室温，用氯仿稀释至25ml，摇匀，在415nm分别测定吸收度，计算，即得。 本法主要用于甾体激素制剂的测定，如倍他米松软膏、哈西奈德软膏、倍他米松磷酸钠及其注射液等的含量测定。 null3、讨论 (1)溶剂的选择：异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇无水乙醇一般多选用无水乙醇无水甲醇稳定性好 呈色强度高 对植物油的溶解度较小null（2）  酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度： 酸 : 异烟肼 = 2 : 1 酸度↑→ 异烟肼盐↓ 酸度↓→ A↓ ★异烟肼试液（0.5mg/ml， 0·00365mol/ L ） 盐酸浓度为0·0074mol/L 硫酸用0·0037 mol/ L 醋酸 为25%（V/ V）(约4·4mol/ L)。 null（3）水分、温度、光线和氧的影响 含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓ 不挥发溶剂、不吸收水分时→O2与光线无影响 t℃ ↑ → ν↑ （4）关于反应的专属性： ★具有△4-3—酮基的甾体激素在室温不到lh即可定量地与酸性异烟肼反应。 ★其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，例如黄体酮，可的松等反应就很慢 ★ C17-酮化合物也可发生反应并形腙， null★具有共轭双键的另一些甾酮化合物，如△5-7-酮醋酸胆甾醇，在相当长的时间内反应仍不能完全 ★ Cll-酮在上述条件下不发生反应。 C3= O ＞ C17= O 、 C20= O ， C11= O 不反应 本法反应专属性 C3－酮基。 （5）雌激素类药物不能用异烟肼比色法测定含量：A环为苯环，不具有α，β—不饱和酮基。 null（二）四氮唑比色法 1、四氮唑盐的种类 最常用的四氮唑盐有两种: 第一种：2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲臢，λm在480～49Onm， 第二种：蓝四氮唑(BT)，还原产物为暗蓝色的双甲臢，λm在525nm左右。 null 肾上腺皮质激素类C17 -α－醇酮基强还原性2、原理nullOH-分子重排null三苯甲臢↓深红null3、测定方法对照品法null4、 讨论（1） 基团对反应速度的影响C11= O＞ C11－OHC21－OH＞ C21-酯null（2） 溶剂、水分的影响含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10% 含水30%→几无反应— 无水乙醇具有一定还原性null（3）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行 以氢氧化四甲基铵的结果最佳加入顺序：null（4） O2与光线的影响反应过程 反应产物怕光→避光、快速O2影响颜色强度和稳定性→隔绝空气、 快速、充N2甲臢对空气中的氧敏感null（5） 温度与时间t℃↑→ν↑→甲臢分解↑→%↓（6） 特点： 缺点 影响因素太多 优点 测定结果能指示药品的稳定性 （氧化及降解产物无此反应）null1. 原理雌激素nullnull雌二醇-3-甲醚λmax=465λmax=515null2. 特点： 优点 较高的灵敏度 具有一定的选择性 缺点 非化学计量反应 反应应控制条件、 注意平行原则nullUSP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多内标法）特点 ：用样量少，灵敏度高，分离效果好，测定速度快（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）