光谱法研究杀鼠剂溴鼠灵与环糊精超分子体系及分析应用

第30卷，第4期 2010年4月 光谱学与光谱 SpectroscopyandSpectralAnalysis V01．30，No．4，ppl065—1069 April，2010 光谱法研究杀鼠剂溴鼠灵与环糊精超分子体系及分析应用 段云青1’2，段志青1，闵顺耕孙，熊艳梅2，段佳2，叶升峰2，王 冬2 1．山西农业大学文理学院。山西太谷030801 2．中国农业大学理学院，北京 100193 3．中国医学科学院医学生物学研究所，云南昆明650118 摘要利用光谱法研究了伊环糊精与二代抗凝杀鼠剂溴鼠灵的超分子作用，根据Benesi—Hildebrand法确 定二者的包络比为l：1，室温下包络常数为1．048X104L·mol～。实验还考察了二者的包络机理，推测主 要是溴鼠灵结构中的疏水基团联苯基进入了伊环糊精的疏水空腔。同时发现，超分子包络物的形成可以大 大增强溴鼠灵的荧光发射，据此，建立了水溶液中测定溴鼠灵的荧光分析方法。在优化实验条件下，线性范 围8．0×10q～4．OXl0-6tool·L_1(，．=O．9994)，检出限为8．8×10叫mol·L～，并成功地用于环境水中 微量溴鼠灵的测定。 关键词溴鼠灵；p环糊精；荧光分析法；超分子包络物 中图分类号：$482．5文献标识码：A DOI：10．3964／j．issn．1000-0593(2010)04—1065—05 引 言 抗凝药物基于对维生素K的拮抗作用、抑制血液凝同所 必须的凝血酶原的形成，改变毛细血管的渗透性和正常的凝 血功能，而实施其在医药领域及农业生产中的药理及毒理作 用。抗凝杀鼠剂是全世界范围广泛应用的一种慢性毒药。溴 鼠灵(3一E3一(4『-溴一1，1一联苯-4-基一1，2，3，4-四氢-i-萘-4-羟 基香豆素，BI)F)属于第二代4一羟基香豆素类抗凝杀鼠剂 (图1)。目前对溴鼠灵的检测主要采用液相色谱法[1。5]，但是 应用该方法时存在一些限制，如不能用于水体分析，需昂贵 的仪器设备等。 环糊精(CD)是天然的环状低聚糖，由葡萄糖单元通过 1，4一糖苷键相连形成内疏水而外亲水的截顶圆锥形空腔，可 以容纳多种有机及无机客体分子从而形成超分子包络物。引。 常见的有口，卢和y一环糊精，分别含有6，7和8个葡萄糖单 元。环糊精超分子包络物的形成将改变客体分子的光化学及 光物理性质，如增大客体分子的溶解度，增溶增敏提高荧光 量子效率[7’8]。尽管有关环糊精与小分子化合物的研究已有 很多，但是，对于利用超分子作用测定毒物环境残留还鲜有 报道[9_1“。 本实验利用光谱法研究了pCD与溴鼠灵的超分子相互 作用，建立了水溶液中高灵敏度测定溴鼠灵的荧光光度法， 该方法分析时间短、不需特殊试剂、分析成本低廉，且仪器 设备简单，极具应用价值，目前尚未见文献报道。 1实验部分 1．1仪器试剂 日立F-4500荧光分光光度计；普析通用仪器公司U弘 1901型紫外分光光度计；雷磁PHS-3C型酸度计；超声波清 洗机。 溴鼠灵(BDF，农业部药检所)：乙醇溶解后用水定容， 浓度为2．00×10叫mol·L-1(含乙醇1％)，冰箱中4℃保 存，使用时用水稀释；4-羟基香豆素(4-HC，Sigma-Aldrich)： 1．oo×10。tool·L一，冰箱中4℃保存；fl-CD(国药集团化 学试剂有限公司，上海)水溶液(o．015mol·L、1)；硼酸一硼 收稿日期：2009—05—08，修订日期：2009-08—12 基金项目：国家自然科学基金项目(20575076)和山西农业大学引进人才基金项目(20051223)资助 作者简介：段云青，女，1975年生，山西农业大学文理学院副教授e-mail：dddy56@sina．COrn *通讯联系人 e-mail．．minsg@263．net 万方数据 1066 光谱学与光谱分析 第30卷 砂缓冲溶液(pH8．o)；其他试剂均为国产分析纯试剂，实验 用水为二次蒸馏水。 1．2实验方法 1．2．1BDF／fl-CD、4-HC／fl-CD超分子包络比及包络常数的 测定 于一系列lonlL比色管中，固定BDF浓度为2．0X10_5 mol·L-1，依次加入不同量的#CD，硼砂一硼酸缓冲溶液 (pH8．O)，稀释至刻度，摇匀，室温静置10rain。测定其在 276nm／395nlTl处的荧光强度。同样方法测定4-HC与#CD 体系在286nm／380nrn处的荧光强度。 1．2．2KI猝灭试验 于比色管中加入BDF储备液(对照组再加入fl-CD溶液) 和KI溶液，再加入硼砂一硼酸缓冲溶液，稀释至刻度，摇匀， 室温静置10min，记录其荧光光谱。 1．2．3方法的建立及水样分析 移取适量的BDF液于10mL比色管中，依次加入 fl-CD溶液，缓冲溶液(pH8．o)，以水稀释至刻度，充分振 荡，室温静置10min，测定其在276nm／395nnl处的荧光强 度，同时做试剂空白，绘制工作曲线。同样方法测定水样。 2结果与讨论 2．1步CD对BDF的荧光增敏作用 fl-CD的加入使BDF溶液的荧光发射显著增强，且随伊 CD浓度的增大而增大，同时伴随着发射峰波长略微蓝移 (398到395nm)，但其激发和吸收光谱却并未因_l争cD的加 入而产生光谱的明显移动，吸收光谱中加入fl-CD后，吸光 度仅略有下降，且不随fl-CD浓度而变化(图2)。这种荧光增 敏作用应该是由于BDF在疏水作用、范德华力及氢键力等 非共价键作用的驱动下，进入fl-CD空腔形成超分子包络物 所致。通常，荧光物质的发射谱峰位置蓝移说明该物质被激 发后能量被更多地吸收并以光子的形式发射出来，转移给周 围介质的能量相对减少[I“。由此推断，当BDF与flCD形成 包络物后，不仅改变了B【)F所处微环境的介电常数，而且在 空腔内BDF的运动自由度以及水分子的松弛效应大大降低， 阻止了碰撞失活，减少了非辐射跃迁的概率，从而导致荧光 量子产率增加，荧光增强；同时，fl-CD的疏水空腔使BDF受 到保护和屏蔽，减少了溶液中水分子、氧等猝灭剂的接触， 也使得荧光甚子产率升高[7,133。 2．2包络物包络比及包络常数的测定 如果小分子配体具有荧光，当其与大分子作用后荧光强 度增大，可利用Benesi—Hilebrand法研究主客体的结合比。 若CD浓度远大于客体分子G浓度(即[CD]》[G])，根据改 进的Benesi-Hildebrand方程[14,151 —F--—F05—[CD]—K．a1十i1l 口 式中Fo和F分别为加入CD前后溶液的荧光强度，口为常 数，[CD]为CD总浓度，K是包络常数。求包络比涉及到选 择参变量，一般地说，纵坐标与荧光强度有关，横坐标与CD 的浓度有关，常为I／[CD]或I／[CD]2，当以1／[CD]为横坐 标作图成直线时，说明包合比是l：1；当以l／leD]2为横坐 标作图成直线时，说明包络比是l：2。 将实验数据整理并将1／(F--Fo)对1／陋CD]作图，得到 一线性关系较好的直线(图3)，拟合方程y一一5．886×101 z一6．171X10～，R2一o．9963，说明fl-CD与BDF的包络比 为l；l。根据茂线的截距和斜率，求得fl-CD／BDF的包络常 数K=1．048×104L·mol1。 360 440 520 Wavelengt州nm n晷2Fluorescenceexcitation(a)，emission(c)andabso驴 tion(b)spectraofBDFafteraddingdifferentamount 伊∞ cBDF一2．0x10—5fflol·I，一1；|：【ex=276rim；C[}-CDincreasedfrom0 to 0．005tool·L一，respectively．Thearrowsindicatethechangesin争 CDconcentration 1／c!B一九) 0 20000 40000 一O．I)f)4 -0．006 e e-0．008 ￥ -0．0l 隐3ThedoublereciprocalplotsofBDF／步CI) c既=2．0X10—5tool·L一1，cPcD=0．005tool·L一1 o．v二ou晴￡o暑一■ 咖 瑚 啪 ∞ 蛐 o aJE§aIorIE 万方数据 第4期 光谱学与光谱分析 1067 2．3 KI猝灭实验 K1是常用的阴离子猝灭剂，可以猝灭许多小分子的荧 光。在动态猝灭过程中，荧光体与猝灭剂分子间的相互作用 可用Stern-Volmer方程进行描述 F0／F=1+KSv[Q¨ 其中Fo与F分别是加入猝灭剂前后的荧光强度，i-Q-I(tool ·L_1)为猝灭剂浓度，Ksv(L·tool一1)为动态猝灭常数。如 图4所示，#-CD存在时，K1对BDF／／}CD体系荧光的猝灭 要比对游离的BDF弱一些，说明fl-CD对BDF的荧光具有保 护作用。这为BDF进入pcD空腔提供了直接证据。 1．4 1．3 k ≥1．2 1．1 l 0 0．02 0．04 0．06 0．08 0．1 c—mol·L一1 №4BDFfluorescencequenchingbyKIin theAhsenceandpresenceofpCD 1：cgco=0；2：cp-cD=0．005mol·L一1 6 5 4 誉3 2 1 0 0 0．002 0．004 0．006 Cp_cr]mol‘L’1 Fig．5Thesensitizationof肛DtoBDFand4-HC 1iCBDF==2．0×10—5mol·L一1；2：c}Hc=2．0X10—5mol·L一1 2．4 a-CD对BDF和4-羟基香豆素增敏包络的对比 BDF是4一羟基香豆素(4-HC)的衍生物，而这一类衍生 物是重要的化学化工及农用化学物质的原料。为此，对比考 察了4一羟基香豆素与pCD的作用，以便_r解BDF与pCD 结合的部位。从图5可以看出，fl-CD对4一羟基香豆素基仅有 微弱的增敏作用(结合常数34．3L·mol～，y=一o．0017x +o．0583，R2=o．9962)，表明4-HC母环不太适合进入伊 CD的空腔中，因为一0H的亲水性不适合邸D的疏水内 腔，这与Dondon等对一些合成的4-HC衍生物与环糊精包 络的研究结果一致[161。考虑到BDF的整体结构，应该主要 是疏水基团溴联苯进入了pCD空洞从而形成了超分子包络 物(图6a)。通过键长等数据估算，溴代联苯基的宽度不超过 0．5nrn，高约0．87nrn，而邸D空腔的内径和深度为0．8 nrn。从空间匹配上看，溴联苯基几乎可以完全进入pCD空 腔内。为了进一步证实，采用CherrdD绘制了包络后分子的 结构示意图，如图6(b)所示。 2．5荧光分析法测定BDF 2．5．1pH对BDF／伊CD体系的影响 环糊精对碱稳定，但在强酸性介质中将分解。成为开环 产物(由葡萄糖组成的混合物)。而BDF在碱性溶液中荧光 强且稳定。本实验考察了pH2．o～13范围内体系荧光强度， 发现pH7．o～lo．0范围内信号强度最大且稳定，所以选择 反应体系pH8．0。 №6TilemclusioncomplexofcompoundBDFwith／to) 2．5．2fl-CD浓度对体系的影响 由图5可以看出，随着fl-CD浓度的增加，体系的荧光强 度显著增大，至1．0×10-3tool·L-1时，荧光强度基本稳 定，继续增大pCD用量，荧光强度增加很缓慢。本实验选择 伊CD浓度为5．O×10_3mo!·L～。 2．5．3稳定时间 放置时间对荧光强度影响不大，室温放置5min后荧光 强度即叮稳定，至少3h不变，本实验选择反应10rain后测 定。 2．5．4共存离子干扰试验 在优化实验条件下，试验考察了一些共存离子对测定的 影响。据报道萘环具有相似的发光性质L1“，故口．萘酚被选择 进行干扰试验，同时还包括一些常见的金属离子。以空白干 扰信号强度的3倍标准差(s)作为判断干扰与否的标准，绝 大多数离子不会对测定产生干扰，实验结果见表l。 2．5．5工作曲线 按实验方法，BI)F在8．0X10_8～4．0×10_6mol·L．1 范围内与荧光强度呈线性关系，线性回归方程为y=2．179X 107z+o．4426(tool·L_1)，相关系数0．9994，检测限为 8．8×10哪tool·L～。与文献报道的方法相比较，该荧光分 万方数据 1068 光谱学与光谱分析 第30卷 析法具有较高的灵敏度(表2)。 2．5．6水样中BDF含量的测定 利用建立的荧光光度法对京密引水渠中的BDF含量进 行了测定。取渠水样品按1=作曲线方法进行测定，为评价样 品提取过程和测定方法的准确度，同时进行标准加入回收实 验，结果见表3。 Table1 InfluenceofconcomitantsubstanceonBDFfluorescencesignal(c哪-----IX10一‘moi·L一1) Note：a：F0andFisthefuorescenceintensityof#CD-BDFsystemintheabsenceandpresentofconcomitantspecies，respectively． b：△FisthefluorescencesignalchangeofflCD-BDFsystemintheabsenceandpresentofconcomitantspecies 3S／Fo=o．062。as△F腰o>o．062．interferenceoccurs． Table2 C咖肼—is姐ofcharacteristicsoftheproposedmethodandothermethods Table3 TheamountofBDFinconduitwatersamples a：RSD：Relativestandarddeviationofthreereplicationdetermination 3结论 [1] [2] [3] [4] E5] [6] [7] [8] E9] E10] Eli] 实验结果表明，BDF能与pCD形成1：1型的超分子包 络物，从而大大增强BDF水溶液的荧光发射强度。据此，建 立了高灵敏度与高选择性测定水体中BDF的荧光分析法， 线性范围8．0×101～4．0×10_6mol·L～，检测限8．8× 10-9mol·L一，并成功用于水样分析。 参 考 文 献 VandenbrouckeV，DesmetN．DeBackerP。etaLJ．Chromatogr．B，2008，869,101． MesmerMZ，FturerR八J．Chromatogr．Sci．，2001，39：49． JINMi-cong，CHENXiao-hong，LIXiao-ping(金米聪，陈晓红，李小平)．ChineseJournalofChromatography(色谱)，2007，25(2)： 214． PalazogluMG。TorER，HolstegeDM。etaLJ．Agr．FoodChem．，1998，46：4260． JinMC。ChenXH。ZhuY．J．Chromatogr．A，2007，1155：57． CHENYuan-yuan，LIUJia-jia。TANGSe-wal(陈圆圆，刘佳佳，唐课文)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)。 2008，28(10)：2380． TangB。MaL，MaCTalanta，2002，58：841． MaL。TangB，ChuCA阻LChim．Acta，2002，469：273． Garcia-SanchezF。CedazoM，LoviIioJ，etaLTalanta，1996，43：1327． MunozdelaPenaA，SalinasF。GomezMJ，etaLJ．Inelus．Phenom．MoLRecogn．Chem．，1993，15：131． LIUWen-li，TANG130(刘文莉，唐波)．ChineseJournalofAnalyticalLaboratory(分析试验室)，2005，24(1)：33． 万方数据 第4期 光谱学与光谱分析 1069 [12]HUANGChun-hui，LIFu-you，HUANGYan-yi(黄春辉·李富友，黄岩谊)．UltrathinFilmsforOpticsandEledronies(光电功能超薄 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generation．wasstudiedbyspectroscopy．Theresultsshowedthatbrodifacoumandfl-cyclodextrincouldformaninclusioncorn- plexwithanas$ociationconstantof1．048×104L·mol一1anda1 l 1 stoichiometrybasedonBenesi-HildebrandequatiomThe inclusionmechanismwasproposedtoexplaintheinclusionmode．Itwasindicatedthatthehydrophohiegroupofbrodifacoum molecule，biphenyl，emeredintothecavityoffl-cyelodextrin．Atthesametime，itwasalsoobservedthesignificantenhancement offluorescenceofbrodifacoumafterforminginclusioncomplex．AccordingtOthefluorescenceenhancementphenomenon，aspee- trofluorimetricmethodofdetectingbrodihcouminaqueousmediawasestablishedwiththelinearrangeof8．O×10-s_4．0X10～6 in01．L-1andthecorrelationcoefficientof0．9994．mdetectionIimitofthemethodwas8．8×10—9脚卜L-1．Theproposed methodwassuccessfullyappliedtodeterminethetraceamountofbrodifacouminenvironmentwaterandtherecoverywasinthe rangeof87．30Ato103．90A． KeywordsBrodifacoum；fl-cyclodextrin；Spectrofluorimetricmethod；Supramolecularinclusion g-Correspondingauthor (ReceivedMay8，2009；acceptedAug．12，2009) 万方数据