GB 18645-2002-T 动物结核病诊断技术

GB/'r 18645-2002 前 台 本主要是根据世界动物卫生组织[World Organization fo:八nimal Health英),Office Inten tional des Epizootic(法),OIE]1996年颁布的《诊断试验和疫苗标准》(Manual of standards for di- agnostic tests &. vaccines)中3. 2. 3,3. 2. 3. 6的牛结核病和3.6.8的禽结核病部分的内容制定的。考虑 到我国的实际情况，对其中一些在我国还无法进行的检验技术作了删减(如:淋巴细胞增生试验;Y一干扰 素试验) 这样，一方面通过与国际同类要求尽可能一致，以使我国适应国际贸易、技术和经济交流。另一方 面，又考虑到我国的实际情况，使得技术方法具有可行性。 本标准中的生物制品应符合中华人民共和国《兽用生物制品质量标准)))(1992)的要求。 本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录，附录D是提示的附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:中国兽医药品监察所。 本标准卞要韶草人:毛开荣、陈向经、关孚时、罗玉峰。 中华人 民共和 国 国家标 准 动物结核病诊断技术 Gs/T 18645 2002 Diagnostic techniques for tuberculosis of animal 范围 木标准规定厂动物结核病的检测方法和要求 本标准适用于动物结核病检测。 2 定义、符号和缩略语 本标准采用 卜列钧号和缩略语: P(,I);提纯蛋1}衍生物(purified protein derivative) o Ill:IA际iyi位(international unit) 3 细菌学检查 3. 1 li%i料的采集和处理 川于细菌学检查的采自淋巴结及其他组织。当活畜有可疑的呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖 道结核、肠结核时，其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便可作为细菌学检查的材料 对那此结核分枝杆菌PPU皮内变态反应试验阳性，但尸检时无病理学病变的动物，可从下领. uN 后、支产毛4q:、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔及一些肠系膜的淋巴结采集样品送检 样品应封装在无菌的容器内冷藏运送， 为f提高检出结果，样品[if采取消化浓缩法处理，处理方法见附录A(标准的附录) 3.1.1 痰 对牛常可川痰进行细菌学检验。牛咯痰极少，宜在清晨采集 用硬橡胶管自口腔伸人至气管内，外 端连接注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的痰块进行检验。 痰样品稀薄时，可加人等量的4%-6%硫酸(见附录A中Al)处理，如痰样品粘稠时，则加人5倍 星的 1%硫酸处理。充分摇匀后置37 C、作用20 min，以3 000 r/mind 000 r/min离心，沉淀物作染色 镜检、培养和动物试验 也dl用2倍量15 in -20%安替福民(antiformin)溶液(见附录A中A3)处理痰液，将混合物置37 C 作用 11-2h后离心 以灭菌生理盐水冲洗沉淀物几次后，取沉淀物染色镜检、培养和动物试验 11.2 乳 怀疑有乳房结核时、可无菌采集乳汁进行检验(、一般以挤出之最后乳汁含菌量较多，旱晨挤出的乳 'j,含菌量最高)? 将乳汁分置4--6支离心管中，每管10 nil -，以3 000 r/min-4 000 r/min离心20 mm、一30 min,吸 取曰公乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验 乳汁]10 ml.加酒精和乙醚各 10 m工及 15%-2000安替福民溶液30 ml, 摇匀置37Y恒温箱内 1h一2 h,取出加等量灭菌蒸馏水混匀 离心沉淀后弃去卜清，取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验 31. 3 精液和子宫分泌物 中华人民共和国国家质最监督检验检疫总局2002一02-19批准 2002 05一01实施 cB/T 18645--2002 有生殖道结核可疑时，可采集公畜精液、母畜子宫分泌物进行细菌学检杳 处理子宫分泌物，可用15%一20%安替福民溶液，混匀后静置2 h^-3 h,3 000 r/mir、一4 000 r/min 离心20 min，弃上清，加 lo m工蒸馏水于沉淀物中。即可作动物试验，经 1.5一2个月剖检 3门.4 尿 有肾结核可疑时，可采集尿液，一般采集中段尿液，以早晨第一次尿为宜〕 如仅作染色镜检，可将尿液以3 000 r/min-4 000 r/min离心20 min后，取沉淀物涂片 如作培养或动物试验，则应将尿液进行消化浓缩处理，再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果 3.1.5 粪便 有肠结核可疑时，可采集粪便进行细菌学检查，患肺结核的牛只，有时在粪便中亦可检出结核分枝 杆菌。因牛常将痰液吞咽至消化道内，随粪便排出 尽量采集混有粘液或脓血的粪便。 取粪便 30 g，加15 % 20%安替福民溶液15 m1一和蒸馏水55 ML,混合，经2 h--3 h后， 3 000 r/min-4 000 r/min离心30 min，倾去上清液，加10 m工_蒸馏水于沉淀物中，将此液用纱布过滤 后接种于豚鼠皮下，经1.5-2个月后剖检。 或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎，然后加氯化钠至饱和。当液体中残渣沉淀后(液体完全澄清)， 浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。取出薄膜，用等量的4写氢氧化钠(见附录A中A2)充分棍合，置 37 C中3h，然后离心，取沉淀物用8%盐酸中和后.即可作染色镜检、培养和动物试验 粪便中如有粘液或脓血，可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。 如系纯粪便，取5 g-10 g，加生理盐水约3-4倍棍合后，用细铜纱网过滤，取滤液置室温中自然沉 淀，然后取_L层悬液置于另一大离心管或烧杯内，加消化液约3-4倍量·置37Y温箱1 11-2 h,同士_法 处理后检验。 3门.6 组织器官 尽量采集有结节病灶的部位。猪易患颈部淋巴结结核，亦易患肠系膜淋巴结核，且常呈钙化或「酪 样病变。家禽常在肠、脾、肝发生结核病灶，有时亦可见于肺或卵巢 病变组织需先研磨，制成乳剂，通常取组织乳剂或其他液状病料2 m1,-4 ml，加人等量的5 %,氢氧 化钠溶液，充分振摇5 min-10 min，或摇至发生液化为止，液化后经3 000 r/min-4 000 r/min离心 15 min-30 min，沉淀物加1滴酚红作指示剂，以2 mol/L盐酸中和至淡红色后，作染色镜检、培养和动 物试验 如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织，可直接作染色镜检，往往可以检出众多的结核分枝 杆菌。但得到阴性结果时，应浓缩处理后检验 3. 2 检验方法 3.2.1 染色镜检 3.2.1.1 涂片 先在玻片L涂布一层薄甘油蛋白(鸡蛋白20 m工，甘油20 ml -，水杨酸钠0. 4 g,混匀)，然后吸取标 本滴加其卜，涂布均匀。 如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，可先用二甲苯或乙醚滴加覆盖于涂片之 上，经摇动1 min-2 min脱脂后倾去，再滴加95%酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。 32.1.2 染色 染色液配制方法见附录B(标准的附录)。 妻 尼氏抗酸染色:处理过的被检材料涂片后，经火焰固定，加苯酚复红染色液(见附录B中BI)覆 盖，将玻片在火焰上加热至出现蒸汽(不能产生气泡)，如此热染5 min(如染色液卜涸，须加适量补允) 水洗后滴加3写盐酸酒精(见附录B中B2)脱色30s-60s(至无色素脱下为日_)。水洗后 以骆氏美瓶染 色液(见附录B中B3)复染1 min。水洗，吸干，镜检。抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细苗 与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色 GB/T 18645-2002 3.2.1.3 镜检 结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1. 5 pm-5 [m，宽。. 2 pm-0. 5 pm,在 陈旧培养基匕或一f酪性淋巴结内的菌体，偶尔可见长达10 pm或更长 3.2.2 培养 32.2.1 培养基配制方法见附录C(标准的附录)。 3. 2. 2. 2 被检标本经消化浓缩后吸取其沉淀物作为培养材料。初次分离，可用配氏培养基(见附录c: 巾CD 111 1培养基(见附录c中C2)或青霉素血液琼脂培养基(见附录c中C3)e 3.2.2. 3 将经过处理的标本接种到培养基上(同时作2-4份)，培养一天后，以熔化的石蜡封u，继续 培养。 3.2-2.4 牛型结核分枝杆菌比人型结核分枝杆菌生长要缓慢得多 初次培养牛型结核分枝杆菌时，需 36 C-37 C培养5-y8周方可出现菌落。在固定培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆。 加1%的丙酮酸钠能促进生长，但在健吩 2酸腆(TRH)培养基(见附录C中C4)上不生长 3.22.5 禽f结核分枝杆菌生长需要2-3周 形成湿润、弥漫状，光滑及星光状菌落。最适生长温度 为40 C-42〔、。在T-,H培养基上生长 3.2.2. 6 人型结核分枝杆菌生长需要36 C-37'C'培养3--4周。该菌落干燥、粗糙，呈白色、黄色或橙 色。牢牢附着于培养基。在T,H培养基上生长。 3.2.2.了 作典v分枝杆菌生长快速，大部分(但不是全部)产生白色或具有橙色或黄色色素，常形成黄 色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。大多数非典型种类的生长速度比牛或人型结核分 枝杆菌块 3.2.3 动物试验 本试验是确诊结核病的重要依据，如能与涂片镜检和培养同时进行，则结果更为可靠 3.2.3.1 试验 3.2.3.2 3.2,3. 3 试验动物在试验前，应进行牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应 豚鼠对牛型和人型结核分枝杆菌敏感，对禽型结核分枝杆菌有抵抗力，常只能形成局部病灶 家免对禽型结核分枝杆菌高度敏感。对牛型结核分枝杆菌敏感。人型结核分枝杆菌虽可使其 肺部形成少量病灶，但可趋于痊愈而不致死。 32.3.4 处理过的病料约I ml,-3 ml，皮下或肌肉或腹腔内注射，每份病料至少接种2只同种动物 接种后30 d左右，进行禽型结核分枝杆菌PPD和牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验，如有阳性 反应，可剖检其巾的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检 观察。如果为阴性反应，可于40 d左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半 继续观察至3个月再刑检观察 3.2.4 牛型、禽酬和人型结核分枝杆菌鉴定方法见附录D(提示的附录) 4 结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 ‘一飞)AMM}fi#1:Fm PI' PPI)皮内变态反应试验 1)进行的皮内变态反应试验对检查活畜结核病是很有用的。该试验用牛型结核 分枝杆菌MID进行 4.1.1 牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 出生后20 d的牛即可用本试验进行检疫。 4.1-1.1 操作方法 。)注射部位及术前处理;将牛只编号后在颈侧中部上三分之一处剪毛(或提前一天剃毛)， 以内的犊牛，也可在肩脚部进行，直径约10 cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。沮:意， 三个月 术部应 无明I的病变 Gs/'r 18645-2002 b)注射剂量;不论大小牛只，一律皮内注射。.1 mL(含20001U)。即将牛型结核分枝杆菌Pill〕稀 释成每毫升含2万IU后，皮内注射0. 1 m工 冻于PPD稀释后当天用完。 c)注射方法:先以75%酒精消毒术部，然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌Pill)，注射后局部 应出现小疤，如对注射有疑问时，应另选15 cm以外的部位或对侧重作 d)注射次数和观察反应:皮内注射后经 72 h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以 卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另 一侧以同一批PPD同 一剂量进行第二回 皮内注射，再经72 h观察反应结果。 对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96 h和120 h再分别观察一次，以防个别牛出现较晚的迟发型 变态反应 4门门.2 结果判定 a)阳性反应:局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4. 0 mm b)疑似反应:局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2. 0 mm、小于4. 0 mm 。)阴性反应:无炎性反应。皮厚差在2. 0 mm以下。 凡判定为疑似反应的牛只，于第一次检疫60 d后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经60 d再复 检，如仍为疑似反应，应判为阳性。 4. 1.2 其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 参照牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行 4.2 禽$'4结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最广泛使用于家禽的试验。牛及其他哺乳动物也可用 牛刑结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行，以区分特异性和非特异性 变态反应 4.2.1 禽的禽t结核分枝杆菌PPI〕皮内变态反应试验 42.1.1 操作方法 用 10 mmX0. 5 mm钊头肉垂皮内注射。. 1 mL(0. 25万IU )禽型结核分枝杆菌PPD,48 1:后观察 ft,'Tu4.2.1.2 结果判定 阳性反应为接种部位肿胀，从5. 0 mm直径的小硬结到扩展至其他肉垂与颈部的广泛性水肿。火鸡 肉垂的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验，没有家禽的试验那样可靠。其他禽类也可用翼蹼作试验， 但结果一般不理想。水禽可接种脚蹼，但试验不敏感并经常与接种部位的感染相棍淆 4.2.2 牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验 4.2.2.1 操作方法 与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同，只是禽型结核分枝杆菌PPI)的剂量为每头 0.1 m1，含。. 25万IU。即将禽型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2. 5万工U后，皮内注射0. 1 nil 42.2.2 结果判定 a)对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性(局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于 4.0 mm)，并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应，二者皮差在 2. 0 mm以卜，判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。 对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2. 0 mm以下，甚至对牛型 结核分枝杆菌PPI〕的反应略小于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应(反应差小于或等于2. 0 mm)，只要 对牛型结核分枝杆菌PPI)的反应在2. 0 mm以上，也应判定为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应 试验阳性牛。 b)对禽刮结核分枝杆菌PPI)的反应大于对牛型结核分枝杆菌PPI)的反应 两者的皮差在2. 0 mm 以卜，判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性 cB/e 18645-2002 对已经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2. 0 mm 以 卜，甚至对禽型结核分枝杆菌Pill)的反应略小于对牛型结核分枝杆菌 PPD的反应(不超过 2. 0 mm)，只要对禽型结核分枝杆菌Pill)的反应在2. 0 mm以上，也应判为禽型结核分枝杆菌Pill)皮 内变态反应试验阳性牛。 GB/T 18645一2002 附 录 A (标准的附录) 标本消化浓缩法 痰液或乳汁等样品，山于含菌量较少，如直接涂片镜检往往是阴性结果 此外，在培养或作动物试验 时，常因污染杂菌生长较快，使病原结核分枝杆菌被抑制。下列儿种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白 质溶解、杀火污染杂菌，而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡，并得到浓缩 A1 硫酸消化法 用4Y,,-6%硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1:5之比例加人混合，然后置3 7 C,作用I h- 2 h.经3 000 r/min--4 000 r/min离心30 min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫 酸消化浓缩后。在沉淀物中加人300氢氧化钠中和，然后抹片镜检、培养和接种动物 A2 氢氧化钠消化法 取氢氧化钠35g^ 40g，钾明矶2 g,嗅藤香草酚蓝20 mg(预先用60写酒精配制成。.4写浓度，应用 时按比例加人)，蒸馏水1 000 m工混合，即为氢氧化钠消化液 将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1:5的比例加人氢氧化钠消化液中，混匀后，37 C作用2h- 3h，然后无菌滴加500^ 1000盐酸溶液进行中和，使标本的pH调到6. 8左右(此时显淡黄绿色)，以 3 000 r/min-4 000 r/min离心15 min-20 min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物 在病料中加人等量的4%氢氧化钠溶液，充分摇荡5 min - 10 min，然后用3 000 r/min离心 15 min-20 mm，弃L清，加1滴酚红指示剂于沉淀物中，用2 mol/L盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物 涂片镜检、培养和接种动物。 在痰液或小脓块中加人等量的1%氢氧化钠溶液，充分振摇 15 min，然后用3 000 r/min离心 30 mm，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物 对痰液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法:取I mol/I(或,t%,)氢氧化钠水溶液50 m工， 0.、 148 hmol/I柠檬酸钠50 mL,N一乙酞-L一半胧氨酸。. 5 g,混合。取痰一份，加上述溶液2份·作用24 h- A3 ，以3 000 r/min离心15 min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物 安替福民(antiformin)沉淀浓缩法 溶液A:碳酸钠12 g,漂白粉8 g,蒸馏水80 ml。 溶液Ii:氢氧化钠15 g,蒸馏水85 m工。 应用时A,1‘两液等量混合，再用蒸馏水稀释成15%-20%后使用，该溶液须存放于棕色瓶内。 将被检样品置于试管中，加人3-4倍量的15%-20%安替福民溶液，充分摇匀后37 C作用1h，加 1-2币音量的火菌蒸馏水，摇匀，3 000 r/min-4 000 r/min离心20 min-30 min，弃上清沉淀物加蒸馏 水恢复原量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。 附 录 B (标准的附录) 垂一尼氏抗酸染色液配制方法 B1 苯酚复红染色液 碱性复红饱和酒精溶液(每100 m工95 酒精加3g碱性复红)10 ml?5%苯酚溶液90 ml，一者棍 GB/T 18645-2002 合后用滤纸滤过。 B2 3%盐酸酒精脱色液 浓盐酸3 mI_,95%酒精 97 ml-,混匀。 B3 骆氏美蓝染色液 甲液:美蓝。.3 g,95%酒精30 m工。 乙液:0.01%氢氧化钾溶液100 ml。 将甲乙两液相棍合 附 录 C (标准的附录) 培养基配制方法 c1 配氏(Petragnane)培养基 Cl.1 成分 新鲜脱脂牛奶450 ml，马铃薯淀粉18g，天门冬素(或蛋白陈 2. 6 g，去皮马铃薯225 g，鸡蛋15个 (除去3个蛋清)，甘油40 g,2%孔雀绿水溶液30 m工。 CI- 2 制法 将马铃薯去皮擦成丝，加入马铃薯淀粉、天门冬素(或蛋白陈)、脱脂牛奶置烧杯中水浴煮沸 40 min-60 min，并不时搅拌均匀，使成糊状。待冷却至50'C时加人打碎的鸡蛋(蛋壳先用75%酒精消 毒洗净)，混匀后用四层纱布过滤除渣。最后加人甘油和孔雀绿水溶液搅拌均匀，分装于灭菌的试管中。 将分装培养基的试管置血清凝固器(或流通蒸汽锅)内，间歇灭菌3次，每天一次，第一天65 C灭菌 mm,第二、只天75'C -80 C灭菌30 min. .3 用途 分离培养结核分枝杆菌用。 LA (Lowenstein-Jensen)培养基 ? ?? ，1 成分 无水磷酸二氢钾(KH2PO,)2. 4 g,硫酸镁(MgSO, " H,0)0. 24 g,构椽酸镁0. 6 g , DI一天门冬素 ? ? ? ?? ? ? (DI,-Asparagin)3. 6 g,甘油12 g,蒸馏水600 mI，马铃薯粉30 g，鸡蛋(约30个)1 000 ml_ 2%孔雀绿 水溶液20 nil。 C2.2 制法 将磷酸二氢钾、硫酸镁、拘椽酸镁、甘油和蒸馏水混合，加热使溶解。取马铃薯粉加人上述溶液内，随 加随搅拌，水浴煮沸1h。鸡蛋用75写酒精消毒外壳后，打开，将蛋清和蛋黄充分搅匀，4层纱布过滤。待 I述加马铃薯粉的盐溶液冷却至50'C时，加人鸡蛋液和孔雀绿，并充分搅匀。 分装,S0〔灭菌30 min后，37 C培养48 h，若无杂菌污染即可使用。 CZ.3 用途 供培养结核分枝杆菌用 C3 青霉素血液琼脂培养基 C3.1 成分 】吕1 Gs/T 18645-2002 琼脂1.5 g，中性甘油I mL,蒸馏水74 mL，兔全血(或牛全血)25 ml-，青霉素((2 000 IU/m工) 1. 85 ml。 C3.2 制法 将琼脂、中性甘油及蒸馏水混合，经103. 4 kPa 15 min灭菌。待冷却到50℃时加人兔全血(或牛全 血)与青霉素，混合后分装，经37℃培养48 h，无杂菌污染即可使用。 C3.3 用途 供培养结核分枝杆菌用。 C4 唾吩-2酸麟(T2H)培养基 C4.1 成分 1.-J培养基，TRH C4. 2 制法 取L-]培养基(见C2)100 mL，水浴煮沸，加TRH 1 mg，充分搅匀。分装;80℃灭菌30 min后，37 C 培养48h，若无杂菌污染即可使用。 C4. 3 用途 供结核分枝杆菌生化鉴定用。 附 录 D (提示的附录) 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定，主要依据生化试验和动物试验。 D1 生化试验 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验特性见D1, 表 Dl 生化试验类型 烟酸试验 Tween-80 水解试验 耐热接触酶试验硝酸盐还原试验 尿素酶试验 T,H抗性试验 牛型结核分枝杆菌 + 禽型结核分枝杆菌 + + 人型结核分枝杆菌 + 士 + + 朴 D1.1 烟酸试验 Dl. 1.1 试验方法 以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15 min-30 min，洗下。每个培养物分装人2支试管中，每 管。. 4 ml，再加人3环联苯胺乙醇溶液0. 2 mL。然后向其中一管加人Io%滨化佩溶液(此液剧毒，应在 通风橱内操作))0. 2 mL. Dl. 1.2 结果判定 凡含1o%澳化氛溶液的试管出现桃红色沉淀，另一管只产生无色沉淀者判为阳性;两支试管都为 产生无色沉淀者判为阴性。 GB/T 18645-2002 01. 2 吐温-80(Tween-80)水解试验 U1.2.1 试验方法 向100 ml磷酸缓冲液(1/15 mol/L,pH 7. 0)中加人0. 5 ml, Tween一 80, 2 mI. 0. 2%中性红溶液。 经112 kPa灭菌20 min，分装于试管中，每管2 mL。在4'C-10 C可保存2周 取上述试管，加人lo m目ml的菌液。. 5 mI?37-C培养，3 d-5 d观察结果。 D1.2.2 结果判定 试管内由原来的玻拍色变为桃红色或红色者判为阳性。无颜色变化为阴性。 D1. 3 耐热接触酶试验 D1. 3.1 试验方法 用生理盐水配制出5 mg/mL^-10 mg/mL的菌液，分装试管，每管。. 5 mL，以68C水浴20 min，冷 却后加人0. 5 ml，过氧化氢(H202)和Tween-80混合液(10 %Tween-80加等量30%H202)。观察结果。 D1.12 结果判断 肉眼观察，如有多量小气泡自管底升起，即为阳性。否则为阴性 n1. 4 硝酸盐还原试验 u1.4.1 试验方法 在100 ml, pH7. 0的磷酸盐缓冲液中，加入硝酸钠(NaNO ·H,0)85 mg，经112 kPa灭菌20 min 后分装，每管2m工 向上述溶液中加人10 mg/mL的菌液，经37 C水浴2h后，加人1滴2倍稀释的盐酸，2滴。.2%氨 苯磺胺，2滴。. 1%N一甲基盐酸二氨基乙烯。在4'C ^-10℃存放2周后判断结果。 D1.4.2 结果判定 呈粉红色至紫红色者为阳性。无色或淡粉色为阴性。 D1. 5 尿素酶试验 D1.5.1 试验方法 将被检材料接种尿素培养基 37 C培养。 D1.5.2 结果判定 在尿素培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落)，并且使培养基变成红色，即为阳性。培养基不变 色为阴性。 D1.6 TRH抗性试验 D1.6.1 试验方法 将被检材料接种T2H培养基和I_-J培养基。37 C培养。 D1. 6.2 结果判定 在上述两种培养基上长出结核分枝杆菌菌苔(或菌落)即为阳性。若在L-J培养基上生长，而在TRH 培养基上不生长，则为阴性。 D2 动物试验 牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验特性见表D2o 表 D2 试验动物 豚鼠 兔 鸡 牛型结核分枝杆菌 易感 易感 不易感 禽型结核分枝杆菌 不易感 易感 易感 人型结核分枝杆菌 易感 不易感 不易感 ca/r 18645-2002 X2.1 试验方法 试验动物在试验前，应进行结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD 检测;鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;兔用牛型和禽型结核分枝杆菌PPD检测。 将处理过的病料约1 mL-3 ml，选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物，每份病料至少接种2 只同种试验动物。 接种后30 d左右，对豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测;对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测;对 兔用牛型结核和禽型结核分枝杆菌PPD检测 如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、 细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应，可于40 d左右剖检其中 的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。 D2.2 结果判定 D2.2. 1 牛型结核分枝杆菌感染 鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。 同时从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌。或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并 观察到典型病理变化。 D2.2-2 禽型结核分枝杆菌感染 豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆 菌。同时，从兔和鸡检测到结核分枝杆菌 或兔或鸡的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并 观察到典型病理变化。 D2. 2.3 人型结核分枝杆菌感染 仅从豚鼠检测到结核分枝杆菌。或仅豚鼠的牛结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到 典型病理变化