梯度洗脱&RPC

梯度洗脱&RPC 第六章 梯度洗脱 1，引言 2，梯度洗脱的应用 3，梯度洗脱的原理 4，建立梯度分离 5，实验问 6，梯度洗脱方法建立的总结 1，引言 等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变，而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的。梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。其中线性梯度最为常用。 2，梯度洗脱的应用 常规的梯度洗脱分离适合于下列样品： （1）具有较宽k值范围的样品 （2）大分子样品 （3）样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。 （4）溶于弱溶剂的样品称溶液 即使最终有可能使用等度方法，初始试验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立的最佳起点。 2.1 梯度洗脱用于常规分析 （1）样品的保留值范围 选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围。前面谱峰需用较弱流动相，而后面谱峰需用较强流动相。 采用梯度洗脱的另一个原因是，在等度洗脱条件下，k＞20的晚流出峰往往会出现较严重拖尾。 （2）大分子样品组分 大分子量样品（肽、蛋白质、合成聚合物等）一般采用梯度洗脱分离会更好，尤其用反相分离条件时。这类样品的等度保留往往对于流动相组成（%B）的微小改变极其敏感，难以将保留值控制在合适的范围内。 （3）晚流出组分 有些样品采用等度洗脱可很好地分离，但所含有的晚流出干扰组分会污染色谱柱或对后续分离产生干扰。 （4）增强检测灵敏度 梯度洗脱可增强检测，与相应的等度洗脱分离比较，样品峰变窄约两倍（且峰高增大2倍）。 （5）稀样品溶液 对于溶解于弱溶剂中稀样品，梯度洗脱可以采用在体积进样，而不会引起峰展宽。 （6）梯度洗脱的替代方法 有时，即使样品保留值范围超出0.5＜k＜20，仍是采用等度洗脱较好。用极性较强的反相柱（如氰基柱）通常可以缩小保留值范围。极性的弱保留组分易与强级性固定相发生作用，而非极性组分与其作用较弱。 对于某些样品，通过柱切换代替梯度洗脱也很方便。 2.2 梯度洗脱用方法建立 当对组成未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱首先采用梯度洗脱仍有以下益处： A，初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续实验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据。 B，若等度洗脱是较好选择，初始梯度实验可为进一步实验提供最佳%B的估计值。若梯度洗脱更合适，则初始实验可为下一步的梯度洗脱估计出开始和终止%B的最佳值。 C，初始梯度洗脱实验可以使整体样品分离更好、更快（与等度分离相比），对方法建立极为有利。 D，初始梯度实验遗漏早与晚的低浓度组分的可能性不大。 （1）用等度还是梯度分离？ 通过谱图中标出的初峰和末峰的保留时间（tRa和tRz）确定。保留时间差ΔtR=tRz – tRa，则比值ΔtR/tG可以决定等度分离是否可行。最大允许k值范围为0.5＜k＜20，此时ΔtR/tG应小于0.40，也就是说，该样品保留值范围应小地梯度时间的40%。 （2）估计最佳等度条件 如果实验表明采用等度条件较好，则等度实验的最佳%B值可由下表确定。梯度分离中末峰的保留时间tRz可用于估计最佳%B值，该值在样品的等度分离中可使末峰的k值较理想。 由梯度洗脱中末峰保留时间tRz估计出的等度运行的%B（ACN）值 tRz（min） 等度运行中末峰k值对应的%B估计值 k=5 k=10 k=20 5 6 0 — 10 19 12 5 15 29 22 14 20 37 30 22 25 45 38 30 30 53 46 38 35 61 54 46 40 69 62 54 45 77 70 62 50 85 78 70 55 93 86 78 60 100 94 86 65 — 100 94 （3）估计最佳梯度条件 如果实验表明样品更适于梯度条件，可由下表估计分子量小于2000样品的初始和终止%B的最佳值。 基于初始梯度运行中的首峰和末峰的保留时间估计梯度洗脱的起始和终止%B tRa或tRz（min） 起始%B 终止%B 5 3 14 10 11 22 15 19 30 20 27 38 25 35 46 30 43 54 35 51 60 40 59 68 45 67 76 50 75 84 55 83 100 3，梯度洗脱的原理 梯度洗脱中，流动相强度（%B）在分离过程中逐渐增加。也就是说随样品迁移过色谱柱中，以k衡量的样品各谱峰的保留值是减小的。 梯度洗脱的有效k值等于谱峰在柱上迁移至一半路程时的k值。 梯度洗脱中k的平均值定义为k*，与等度分离一样，它决定样品的分离度和峰宽。 不同峰的k*近似为常数值是反相线性梯度分离的主要特征。因此，线性梯度色谱图中每一谱峰具有相似的峰宽。 3.1 梯度与等度洗脱 等度分离中的每个谱峰在穿过色谱柱的过程中，被组成恒定不变的流动相（%B）所包围，由容量因子k衡量的某一谱峰的保留值在分离过程中保持不变。但在梯度洗脱中，一谱峰在穿过色谱柱的过程中周围的流动相是改变的，该谱峰的即时k值也是在变化的。另外，等度色谱图中被分离的谱峰通常具有不同的k值，而在梯度洗脱中不同谱峰的有效k值（k*）却几乎相同。 式中GS为梯度变化速率，%/min；F为流速，mL/min；Vm为柱死体积，mL。 若已知某一样品需用梯度洗脱，选择k*≈5进行初始试验较为合适，这样可以兼顾分离度、能方便检测的峰高和运行时间。 3.2 梯度变化速率的影响 由于等度与梯度洗脱的相似性，较大k*值的影响应与较大k值一样：（1）k*增加，分离度Rs开始先增加，然后达到平衡；（2）谱峰伴随峰高相应减小而展宽；（3）运行时间延长。 %/min(梯度)的增加类似于%B(等度)的增加 梯度k*的增加类似于等度k的增加 梯度洗脱的方法建立几乎同等度分离一样。首先优化保留值（k*），然后按需要改变选择性（α），最后可调节柱条件（N）以兼顾改善运行时间和分离度。 3.3 梯度范围的影响 梯度范围指梯度起始和终止%B的差值。初始的试探性实验可进行一次全范围梯度（即5→100%B）。 足够大的初始%B值主要影响色谱图中的前部谱峰，使它们的k*值降低；峰变窄；分离度降低。 如梯度过早结束（末峰离开柱之前），通常应增加运行时间，并使后面谱峰变宽（检测灵敏度下降）。 4，建立梯度分离 梯度方法建立的步骤可总结为： （1）以等度分离的相同方式选择初始条件：色谱柱，流动相组成，流速，温度等；首次梯度试验却应采用较宽的梯度范围。应先优化初次实验的k*，梯度变化速率不能太陡。 （2）再调节梯度范围以缩短运行时间，去除色谱图开始和结束时无用的空间。 （3）如出现谱峰重叠或运行时间太长，则需改变选择性（α）。 （4）优化峰间距后，改变柱条件以改善分离度和/或运行时间。 （5）制定平衡柱的最佳方法，并考察仪器差异对分离的影响。 4.1 选择梯度条件 （1）梯度变化速率 如已确定最终方法采用梯度洗脱，k*≈5是良好的首选。选择15×0.46cm、5μmC8或C18柱、流速2ml/min较好。通常，初次分离宜用全范围梯度：5→100%B（△%B=95）。梯度时间tG。 （2）梯度范围 如初始梯度实验条件进行（60min梯度，5→100%B；15×0.46cm柱；2ml/min；k*≈17），起始%B与终止%B的最佳值可由前表估计出。然后进一步优化梯度范围。初始运行之前已确定需用梯度洗脱，小分子（＜2000）最好先采用20min梯度试验。 4.2 改变峰间距 在梯度洗脱中改变选择性与峰间距可通过与等度分离相同的方式实现［即通过改变k和k*（等度洗脱的%B、梯度洗脱的梯度变化速率），溶剂类型，色谱柱型，pH，HPLC方法，温度等］。反相分离中性样品时，用于改变选择性的变量的优先次序排列为：首先是流动相强度（k*），其次是溶剂类型（乙腈＞甲醇＞THF），柱型（C8或C18＞氰基＞苯基），最后是温度。对于离子样品，pH和温度是控制选择性的重要因素。 （1）梯度变化速率 在等度分离中改变%B可使k和α发生变化；在梯度洗脱中，可通过改变梯度变化速率Gs达到相当的效果。在梯度洗脱中改变梯度变化速率或（k*）导致α和峰间距的改变可能要比在等度分离中改变%B（k）大得多。因此，通过改变k或k*来控制峰间距在梯度洗脱是比在等度分离中有效得多。 （2）溶剂类型 改变有机溶剂为等度分离中改变选择性的一种常用手段，尤其对于中性样品。 在梯度洗脱中改换有机溶剂也可获得类似效果。 （3）其它条件 梯度洗脱选择性的改变与其它条件有关（主要针对离子样品）：pH，离子对试剂浓度，温度。 4.3 调整色谱柱条件 当针对参数k*和α优化了保留值以后，再改变柱长、固定柱颗粒大小和流速等柱条件，还可进一步改善分离。等度分离中，改变柱条件对k无影响，但梯度分离k*依赖于柱尺寸和流速。k*的恒定需保持Gs=（Vm/F）（△%B/tG）不变。如仅改变微粒大小则不需要改变梯度时间以保持k*恒定。 5，实验问题 5.1 设备对分离的影响：系统的滞留体积 （1）设备差异 用于梯度洗脱的仪器有两种：高压混合系统和低压混合系统。高压混合系统在泵后（高压状态下）立刻混合A溶剂与B溶剂，而低压混合系统在泵前混合溶剂。梯度设备的对分离的主要影响在于“滞留”体积（VD）。其它条件相同时，低压混合（LPM）系统的VD值较大。包括自动进样器在内，VD值范围一般为2~8ml，但管路安装不好的设备滞留体积值会超过10ml。 （2）不同HPLC分离效果的差异 不同设备滞留体积对梯度分离时的主要影响是使样品保留时间发生变化。增加的滞留体积相当于在梯度开始时增加的等度延迟。由于不同HPLC系统的滞留体积不同，流动相问题可通过延长柱平衡时间加以避免。所需的延长时间等于增加的滞留时间。 （3）减小设备滞留体积的影响 因为滞留体积的差异是梯度方法在不同系统之间不能很好移置的主要原因，在方法建立步骤中有必要阐明原系统的滞留体积。减小不同滞留体积对分离效果影响的办法有三种： 第一（最好的），某些系统控制器可以在梯度开始后的精确时间进样。如延迟进样时间tD，梯度和样品可同时到达柱进口。 第二，如梯度过程开始可插入一段等度过程，用VD值较大的系统时则可以缩短这一过程；而用VD值较小的系统时则可延长这一过程。以此方式，样品和梯度则会同时达到柱进口。 第三，以一较陡梯度从5%B至初始%B开始。 5.2 可重现的分离 （1）柱再生 在梯度洗脱末尾时保持100%B或快速将梯度改变至100%B一段时间（如2~5倍体积），以便采用强溶剂来清洗柱子。 （2）柱平衡 梯度洗脱中，最好在进样和下一次梯度开始之前，用初始流动相彻底平衡色谱柱。如不能彻底平衡柱子，色谱图中的早期谱峰的保留值和分离效果会发生改变。柱平衡一般需要5~10倍柱体积的初始流动相。为达到柱平衡，还可以使梯度反向运行。 （3）不准确的梯度 分离重现性较差也会由梯度的不准确引起。梯度不准确更易导致不同梯度系统之间的分离产生差异，当怀疑保留时间发生变化是由梯度混合不准确所致的%B随机波动而引起时，通过避免使用储液器中的纯溶剂A和B，可降低此问题的发生。 5.3 基线问题 梯度中的基线漂移和人工峰比等度洗脱中普遍得多。 （1）漂移 梯度洗脱中，基线向上漂移非常普遍，通常由所用A与B溶剂的紫外吸收差异所致。在反相梯度洗脱中，有机溶剂B浓度在分离期间是增加的，有机溶剂的紫外吸收总是大于水，因此，采用紫外检测器时，这种梯度漂移尤为普遍。 梯度洗脱中的第二类基线漂移，可由空白梯度的弯曲基线来识别，最大信号接近50%B。此种基线漂移由折射率（RI）引起；有机-水溶液通常在约50%有机物时RI值最大。 （2）人工峰 当进行空白梯度实验时，尤其用短波长UV检测和高灵敏度设置时，色谱图中可能会出现很大的谱峰。这类人工峰会（明显地）使梯度洗脱的方法建立复杂化。这种干扰通常由与流动相和设备有关的疏水且有UV吸收的杂质引起。 6，梯度洗脱方法建立的总结 （1）开始前：首先应进行一次空白梯度，以确保基线没有问题（漂移或人工峰）。 （2）运行实始梯度：采用60min线性梯度，5→100%乙腈-缓冲液，流速2mL/min，确证梯度洗脱是否必要，然后估计这种样品的最佳初始和终止%B值（梯度范围）。如肯定需用梯度洗脱，以20min梯度开始（k*≈5）。 （3）优化梯度变化速率：估计最佳梯度范围，估算梯度时间并进行这一条件下分离。 （4）优化条件：若需改善峰间距和分离度，可按等度分离的相同方式试验，以进一步改变选择性。 （5）复合梯度：有些情况下，分段梯度可缩短运行时间和/或增加分离度。应尽可能不用曲线梯度。 （6）优化色谱柱条件。 （7）其它问题：一旦选定了分离样品的实验条件，应使色谱柱达到平衡，以保证在试图减小整体运行时间时（包括柱平衡时间），早出峰的保留可重现。样品间的平衡体积应尽可能大些。 第七章 常规样品反相分离的系统方法 1，引言 2，开始 3，完成等度方法建立 4，完成梯度方法建立 1，引言 本章总结了用反相色谱法（RPC）分离时选择恰当实验条件的初步构想，并描述了将前一次的实验结果用于下一步实验条件设定的。采用这种试一试法进行研究，直到得到满意的结果。 反相HPLC分离的总体方案 （1）确定样品属于常规的还是特殊的；若是常规样品，照本章提供的方法进行研究。 （2）选择分离条件，进行第一次运行。 （3）做初次运行 a.等度方法； b对梯度方法； c对弱保留样品，由(1)改变pH；(2)加入离子对试剂；(3)改变柱子（一般键合相或交联柱）或(4)改用正相条件，来增加保留； d.对强保留样品，用(1)NARP或(2)正相条件。 （4）对等度方法，用初始梯度运行来估计第二次（等度）运行的最佳%B值。 （5）评价第二次运行中峰的质量（塔板数、峰宽、峰形）。峰太宽或不对称说明初始分离条件（柱子、pH，添加剂等）必须改变；若二次运行良好，应作进一步平等实验以保证柱平衡和可重复的保留时间。 （6）a.对等度方法，改变%ACN来改善峰间距和分离度； b.若有必要，从ACN改为MeOH并为峰间距和分离度优化%MeOH； （7）对等度方法，若步骤6a或b的分离不充分，则按照柱类型、温度、THF作溶剂、不同的C18柱的顺序改变条件； （8）对梯度方法，用改变梯度变化速度和柱温来优化峰间距和分离度； （9）对梯度方法，按上一章所确定梯度条件(初始和最后%B，梯度速度变化，梯度形状)改善分离度或缩短运行时间； （10）对等度或梯度方法，改变一个柱条件(柱长、流速、填料尺寸)可以提高分离度或降低运行时间。 1.1 一些指导原则 （1） 样品分类 常规样品的分离可通过改变溶剂浓度（%B）和类型（乙腈ACN，甲醇MeOH）（或柱温）找到合适的分离条件。浓度%B降低10%一般使保留值增加3倍，选择性通常随溶剂浓度或类型的变化而变化。柱温的上升会引起保留值的下降（1~2%/℃）和选择性的变化。 （2）初始分离条件：色谱柱和流速 反相HPLC方法建立的初始条件 分离变量                    最佳的初始条件 柱填料                C8或C18；弱酸性硅胶；若设计温度＞50℃，选择更稳定的空间保护填料 柱结构               15×0.46cm，5μm填料 流速                  2.0ml/min 流动相               乙腈-水(中性样品)或乙腈-缓冲液(离子型样品)；缓冲液为25~50mM的磷缓冲液pH2~3(若色谱柱稳定，pH最好更低)。对初始试验，可用60min内5→100%B的梯度 温度                  35或40℃ 进样量               ＜50μl；50~100μg 色谱柱也应提供(1)初始实验时对样品有合理的分离度，(2)短的运行时间(包括色谱柱的平衡和平行实验)，(3)对不同流动相有合适的压力降。5μm，15×0.46cm色谱柱，流速为2ml/min一般是较佳选择。这些条件提供了(1)合理的塔板数(N≈8000)，(2)运行时间＜15min，k＜20，和(3)由水、乙腈和/或甲醇的混合物制成的任何流动相的最大压力＜2500psi，对于快速分离7.5×0.46cm，3.5μm填料的色谱柱是较好的选择。 （3）初始分离条件：流动相 要求流动相无紫外吸收且低粘度，较好满足这些条件的有机溶剂是ACN。MeOH也是一种适合作为HPLC分离的流动相有机溶剂，初始流动相pH值的选择基于两点考虑。（1）选用低pH可以使柱硅羟基质子化并降低其色谱活性；（2）低pH值（＜3）与常见酸碱官能团的pKa值相差较远，对于在低pH下稳定的色谱柱，选pH在2~2.5之间较合适。对不太稳定的柱子，选pH3更好。 在方法建立的早期试验中应避免使用三乙胺和离子对试剂等流动相添加剂。 （4）其它初始分离条件 可通过选择柱温达到不同的分离目的。基本要求是柱温恒定。由于高温下流动相粘度降低，有较低操作压降和更高的塔板数，通常开始选用35℃或40℃的柱温。可能的话，样品应先用水（1mg/mL）或乙腈的稀水溶液来溶解。对于最终的RPLC方法，溶解样品的最佳溶剂是流动相，可用乙腈或甲醇溶解并在进样前用水或流动相稀释。先进样25~50μl（25~50μg）以得到最大检测灵敏度。 （5）确保准确的保留数据 当色谱柱，流动相或温度发生变化时，进样前都要求用10倍柱体积（对15×0.46cm的柱子是15mL）的新流动相来平衡。 在开始阶段，应改变流动相或柱温而不是色谱柱，因为流动相和柱温的改变可以连续进行，更有可能找出多组分样品的最佳选择性。同时这也比改变色谱柱更方便。 严格按照下述操作可以保证柱平衡和数据重复性：（1）用至少10倍于柱体积的新流动相清洗色谱柱（对流速为2mL/min的15×0.46cm的柱子需8min）；（2）进样；（3）用至少5倍于柱体积的流动相清洗色谱柱；（4）再次进样。 若色谱柱达到平衡，在两次运行之间保留时间的改变应不超过0.02min。 由于色谱柱被污染或键合相流失，色谱柱的保留性能可能会变化，这意味着不同时间得到的保留数据没有可比性。 （6）确保好的柱性能 第一步或第二步试验运行完成，更重要的是考察色谱图的峰形和塔板数。对一个15cm，5μm的色谱柱，流速为2mL/min时，不对称因子应在0.9~1.5之间(0.9~1.3间更好)，分子量小于1000的样品，等度洗脱的塔板数应＞4000。在梯度运行情况下，半峰宽不应大于0.4min。方法建立中不断出现拖尾峰或展宽峰会浪费相当多的时间和精力以改善柱性能。 （7）峰跟踪 峰跟踪是指改变实验条件时，在两次运行之间对同一组分谱带的匹配。 2，实验开始 2.1 初始条件 对常规样品，先使用上表中的条件：15cm，5μm的C8或C18柱，乙腈-水流动相，2mL/min的流速，柱温35℃或40℃(除非没有柱恒温装置)，和适当的进样量。对离子型样品，向流动相中添加25~50mM磷酸钾的缓冲溶液（pH2~3）。若不知道样品类型为中性还是离子，最好用同样的缓冲液pH值。可用等度或梯度洗脱进行初始“试探”分离。最好优先选用梯度分离，最初梯度可以先用5→100%的乙腈，60min。初次梯度运行可确定（1）推荐等度或梯度洗脱；（2）是否需要特殊的反相条件。 2.2 调整保留值范围 RPC方法建立的首要目标是选择能提供合适保留值范围的实验条件。若等度洗脱可行，意味着0.5＜k＜20；k超出此范围，则有必要梯度洗脱。但通常选择或需要选择等度洗脱。 （1）等度分离            △tR/tG                        等度保留值            0.25                           1＜k＜10            0.40                           0.5＜k＜20 运用“三倍”，初次运行的最末谱带的k值可用来估计%ACN。有机相浓度降低10%可以使k值大约增加3倍。 （2）梯度分离 若起初的梯度分离（实验1）表明等度洗脱不可行，进一步的试验（和最终的方法）应以梯度方式。可用梯度表来决定下一次梯度运行最佳初始和最终%ACN值。 2.3 评价峰型和柱效 谱图中的一些谱带至少有部分分离时，就可以测量和计算它们的峰宽和对称性。必须注意峰的拖尾或扭曲，因为硅烷化相互作用将导致最终建立的方法普适性变差。塔板数N低是存在的另一个问题（如对一根15cm，5μm，流速为2mL/min的色谱柱＜4000塔板数）。 3，完成等度方法建立 常规样品和等度HPLC分离方法建立的系统策略 实验                                              问题 运行1 60min内5→100%ACN梯度              1.1 能用反相HPLC吗?(无弱或强保留组分)?                                       1.2 样品用单一RPC分离是否太复杂?                                       1.3 等度或梯度洗脱哪个更好? 运行2 从运行1和上表中选出%ACN            2.1 峰对称吗?                                       2.2 塔板数合理吗?                                       2.3 k范围合理吗?                                       2.4 分离得好吗?                                       2.5 运行3应使用何%ACN(增加还是降低10%;改变k的1/3或3倍)? 运行3 %ACN增加10%                        3.1 此分离最佳的%ACN是什么?                                       3.2 分离得好吗? 运行3a 运行2和3的最佳%ACN                    3.3 能肯定充分分离了吗? 运行4 运行2和3用来估计最佳%MeOH             4.1 k范围合理吗?                                           4.2 分离得好吗?                                           4.3 运行5用什么%MeOH? 运行5 %MeOH增加10%                          5.1 此分离的最佳%MeOH是什么                                           5.2 分离得好吗?                                           5.3 关键峰对在最佳ACN和MeOH运行中                                               变化吗?(若变，运行6) 运行5a 运行4和5的最佳%MeOH                  5.4 能确定充分分离吗? 运行6和7 运行2，4及运行3，5流动相混合(1:1)       6.1 水/甲醇和乙腈混合物可以充分分离吗? 运行7a 优化水、甲醇和乙腈三元溶剂体系           7.1 能确定分离充分了吗?                                          7.2 用ACN-MeOH混合物的分离充分了吗? 优化柱条件。柱子长度，填料大小或流速的变化常被用来优化最终的分离，特别是只要求分离度的微小提高时。 柱条件改变的特征（等度分离） 变量                                    特征 降低流速                   能适度地增加分离度，增加运行时间，降低压力，不会发生未知的选择性改变（相同的柱子） 增加柱长                   分离度明显增加                            运行时间和压力明显增加，可能有预计不到的选择性变化 降低填料粒度               能较大提高分离度、运行时间和柱压                            可能有预计不到的，选择性变化，更短的柱子使柱外效应更重要                            对填料＜3.5μm更易产生其它问题（堵塞） 4，完成梯度方法建立 对常规样品和梯度分离HPLC方法建立的系统方法 运行1                 60min内5→100%B；15×0.46cm柱，2.0ml/min；35~40℃ 运行2                根据上表调整初始和最终%B值；增加梯度变化速度到5%/min;                       检查运行1和2的难分离峰对;Rs＞0.7对任何梯度变化速度都可能吗? 运行3                 升温至60~70℃，重复运行2的分离 运行4                将梯度时间增加3倍，重复运行3的分离；检查运行1至4的关键峰对；对任何梯度速度或温度所有峰的Rs大于0.7吗? 运行5                  若Rs＞0.7，在此条件下分离 运行6                  若要求Rs增加，由改变柱条件来实现 运行7                  若梯度速度和温度的增加不能使样品充分分离，研究甲醇或乙腈-甲醇混合物的使用(用更陡的梯度代替高比例的有机相)，若此法