重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响

塞垣医堂盘查垫!Q生蔓堑鲞箜!』塑 重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及 对细胞周期的影响 陈志红龚先玲刘义 摘要 目的：研究重楼总皂苷对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及对细胞周期的影响。方法：用MrI-r 法测定重楼总皂苷对A549细胞的增殖抑制率；Hoechst．PI双染观察细胞形态学变化：流式细胞术测定重楼 总皂苷对A549细胞周期时相分布的影响。结果：重楼总皂苷能抑制A549细胞的增殖，其作用呈明显的时间 和剂量依赖性；Hoechst．PI双染显示细胞凋亡特征；重楼总皂苷使A549细胞被阻滞在S期。结论：重楼总皂 苷对A549细胞的增殖有较强的抑制作用．明显影响细胞周期时相分布。 关键词肺肿瘤；重楼；皂苷类； 细胞增殖； 细胞周期 EffectofsteroidalsaponinsfromP．poiyphyUaonproliferationandcellcycleofA549cellsCHENghi—hong‘． GONGXian—ling，LIUYi．幸AnalysisCenter，Guan#o昭MedicalCollege，Zhanjiang524023，China 【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofsteroidalsaponinsfromPpolyphyllaonproliferationandcell cycleofA549cells．MethodsTheinhibitionrateofsteroidalsaponinsfromP．pobphylmforA549cellproliferation wasdetectedbyM，rI'．ThemorphologicalchangesweredeterminedusingHoechst-PIstaining．Theeffectofsteroidal saponinsfrom只polyphyllaonthecellcycleofA549Wagobservedbyfloweytometry．ResultsSteroidalsaponins fromP．po切hyllainhibitedthecellproliferationofA549cellsinadose-andtime—dependentmanner．Hoechst-PI stainingshowedthefeaturesofapoptosis．A549cellstreatedbysteroidalsaponinsfromPpolyphyllawereblockedin Sphase．ConclusionsSteroidalsaponinsfromP．polyphyllaCallinhibitthegrowthofA549cellsbyinducingS phasearrest． 【Keywords】Lungneoplasms；Por／spolyphyUa；Saponins；Ceilproliferation；Cellcycle 重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的 干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功 效[川。现代药理研究明：重楼具有抗肿瘤、消炎、抑 菌、镇静、镇痛、止血等作用。近年来，重楼的抗肿瘤 作用受到广泛关注【驯。季申等【2]研究表明，重楼的水 提物、甲醇提取物和乙醇提取物对人肺癌A．549、人 乳腺癌MCF-7、人结肠腺癌HT-29、人肾腺癌A-496、 人胰腺癌PACA，2、人前列腺癌PC．3等多种肿瘤细 胞均有抑制作用。甾体皂苷是其主要药效成分㈣。本 课题组前期研究发现：重楼总皂苷可抑制人鼻咽癌 CNE．2Z细胞的增殖，细胞被阻滞在S期。从而诱导 凋亡(另文发表)。在此研究基础上，本实验将探讨 重楼总皂苷对人肺癌细胞A549增殖的抑制作用 及对细胞周期的影响。 1材料与方法 1．1 仪器与试剂 NAPCOseries5400C02培养 doi：10．3969／j．issn．1006—5725．2010．15．003 基金项目：湛江市科技项目(编号：2008C03016) 作者单位：524023广东省湛江市，广东医学院中心(陈 志红)，天然药物研究与开发重点实验室(龚先玲，刘义) 箱。Elx酶标仪(Bio—TEK．INSTUMEN"ISINC产品)． EclipeET2000一E荧光倒置显微镜(Nikon公司生 产)，EPICSXL流式细胞仪(美国COULTER公司生 产)。胰蛋白酶、5一氟尿嘧啶(5．ru)、甲基噻唑蓝 (MTr)(美国Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青 生物材料有限公司)。RPMI．1640培养基(Gibco公 司)。 1．2药材重楼药材购于广东湛江天马大药房． 由广东药学院滕希峰博士鉴定为重楼的干燥根茎。 符合《中国药典>(2005版一部)的规定。 1．3细胞株人肺癌细胞A549由广东医学院天 然药物研究与开发重点实验室传代培养。 1。4方法 1．4．1 重楼总皂苷的制备取干燥的重楼块根，粉 碎，称40．00g样品，加70％的乙醇400mL回流2 次，每次3h。过滤，合并滤液，减压浓缩除去乙醇。加 水悬浮．依次用石油醚、乙酸乙酯除去亲脂性的成 分，再用正丁醇萃取，正丁醇部分浓缩至于，干粉为 重楼总皂苷。 1．4．2细胞培养A549细胞培养于含lO％dx牛血 清、100kU／L青霉素和100哪／L链霉素的RPMI． 万方数据 2686 1640培养液中，37℃、5％CO：饱和湿度细胞培养箱培养．取 对数生长期细胞用于实验。 1．4．3 MrI，11法测定重楼总皂苷对A549细胞的生 长抑制作用 取对数生长期的人肺癌细胞A549． 用O．25％的胰蛋白酶消化，含10％新生小牛血清 的RPMI．1640培养液调制成4X104个／mL的细胞 悬液，接种于96孔板中，每孔接种100斗L。在 370C、5％CO：条件下培养过夜后，吸出培养液，加入 新鲜培养液180斗L及药液20“L。待测样品用 DMSO溶解(DMSO终体积分数≤0．1％)，化合物终 浓度分别为60、90、120、150、180P,g／mL．每个浓 度平行6孔．同时设置空白对照组和5-Fu的阳性 对照组，空白对照组每孑L加入20恤L的RPMI．1640 培养液，阳性对照组则加入浓度为20斗g／mL的5．Fu 20皿。分别培养培养24、48、72h后，每孑L加入5 mg／mL的M，ITI'20斗L，37℃5％C02条件下温育 4—6h，弃去上清液，每孔加入150IxLDMSO，在微 型振荡器上摇匀15rain，结晶溶解后，立即比色，在 酶标仪主波长为570nm。参比波长为630nm处测 量OD值，比色以空白孑L调零。计算药物对肿瘤细 胞的增殖抑制率。增殖抑制率=(1一实验组OD值 平均值／对照组OD值平均值)x100％。 1．4．4荧光显微镜观察细胞形态取对数生长期 的A549细胞，调整细胞浓度为3．0×105个／mL，接 种于24孔板中，每孔接种500斗L。在37℃、5％C02 条件下培养过夜后。吸出培养液．加入新鲜培养液 450pL及药液50斗L，使其终浓度为60、90、120 I山g／mL，同时设置阴性对照，阴性对照加50此 RPMI．1640培养液。继续培养24h后。用预冷的 PBS洗涤2次，加入浓度为10斗g／mLHoechst 3334237℃染色15min，PBS洗涤2次。再加入浓 度为50扯g／mL的PI染色液于冰上染色15min， PBS洗涤2次，于荧光显微镜下观察并拍照。 1．4．5 流式细胞仪分析重楼总皂苷对人肺癌细胞 A549周期的影响取对数生长期的人肺癌细胞 A549，PBS洗2遍后，0．25％胰蛋白酶液消化，用含 10％dx牛血清的RPMI．1640培养基制备成浓度为 3．0X104个／mL的细胞悬液．接种于50mL的小培 养瓶中，每瓶接种6mL。在370C、5％CO：条件下培 养过夜后。吸出培养液，加入新鲜培养液及重楼总 皂苷药液，使其终浓度为60、90、120斗g／mL，同时设 置阴性对照。阴性对照加相同体积的培养液。分别 在给药后24h，用胰酶消化细胞，离心收集细胞， PBS洗2次，细胞沉淀用70％乙醇悬浮，在-200C 冰箱固定24h以上。PBS离心洗去乙醇后加PI染 液(含50mg／LPI，10mg／LRnaseA。0．1％TritonX一 塞旦匡堂苤查2Q!Q芏筮堑鲞筮!』塑 100。0．1％柠檬酸钠和0．5％NaCl)，室温下避光染 色30min，400目筛网过滤，用流式细胞仪检测 DNA含量，分析细胞周期(激发波长488nm，发射 波长630nm)。 1．5统计学方法实验数据用五±s表示，应用 SPSSl3．0统计软件进行单因素方差分析，组间比较 用玲D法。以P<0．05为差异有显著的统计学意义。 2结果 2．1 重楼总皂苷对A549细胞增殖的抑制作用 重楼总皂苷对A549细胞增殖的抑制作用结果见 表1。从表1可以看出：不同浓度药物处理组分别 培养24、48、72h。重楼总皂苷对A549细胞的增殖 具有抑制作用，且其抑制作用具有时间和浓度依赖 性。随着作用时间的延长和药物浓度的增加．细胞 抑制效果越来越明显，重楼总皂苷对A549细胞的 生长有量一效、时一效关系。 表l重楼总皂苷对A549CNE-2Z细胞增殖的抑制作用(厅巧) i±s．％ 2．2荧光显微镜观察重楼总皂苷对A549细胞的 影响 在荧光显微镜下观察经Hoechst．PI双染的 A549细胞，对照组细胞呈现弥散均匀蓝色荧光，细 胞边缘整齐，偶见个别坏死细胞(图1a)。而经重楼 总皂苷处理24h后的A549细胞．细胞体积变小。 染色质固缩。细胞核呈亮蓝色及明显的核形态变 化，并可见染色质边集及凋亡小体(图lb、lc、ld)。 2．3 流式细胞仪分析重楼总皂苷对人肺癌细胞 A549细胞周期的影响重楼总皂苷对人肺癌细胞 A549作用24、48h后对细胞周期各时相DNA含 量的影响见表2。重楼总皂苷对人肺癌细胞A549 作用24h时，随着重楼总皂苷作用浓度的增加． Gl／Go期DNA含量降低IF=5．86，，如(3．1I)=3．59；P <0．05]，S期DNA含量明显增加[F=30．54，Rm(3． 11)=6．22；P<0．01]，G2／M期DNA含量降低『F= 336．00，F00l(3'11)=6．22；P<0．01]。重楼总皂苷对人 肺癌细胞A549作用48h时，随着重楼总皂苷作用 浓度的增加，G。／G0期DNA含量降低fF=32．87， R．01(3．11)=6．22；P<0．01]，S期DNA含量明显增加[F =172．56，，kl(3’11)=6．22；P<0．01]，G／M期DNA含 万方数据 塞旦匿堂盘查垫!Q堡箜堑鲞筮!』塑 注：a，x,／N．b，60ttg／mL重楼总皂苷作用A549细胞24h；e，90trg／mL重楼总皂苷作用A549细胞24h；d，120ttg／mL重楼总皂苷作 用A549细胞24h 图1荧光倒置显微镜观察重楼总皂苷诱导的A549细胞形态学变化(x200) 表2重楼总皂苷处理A549细胞不同时相DNA含量的影响(n=3) i-1-s 注：与0鹇／mL比较，·P<0．05，十}P<0．0l 量降低[F=10．52，Fo．01(3．⋯=6．22；P评分

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