16_合成多肽药物的合成工艺中关键问题分析

Chinese Journal of New D rugs 2010, 19 (2) 102　　 中国新药杂志 2010年第 19卷第 2期 [作者简介 ]　王鹏 ,男 ,主管药师 ,主要从事化学药品技术审评研究。 联系电话 : (010) 68585566 - 545, E2mail: wangp@ cde. org. cn。 ·新药申报与审评技术 · ★指导原则解读系列专 (十六 ) 合成多肽药物的合成工艺中关键问题 王 　鹏 (国家食品药品监督管理局药品审评中心 ,北京 100038) 　　[摘要 ]　文中主要结合药品注册技术审评过程中遇到的常见问题对《合成多肽药物药学研究技术指导 原则 》中合成工艺部分中的一些关键问题进行归纳和分析 ,对本指导原则中的一些技术要求 ,如起始原料的 要求、合成工艺申报资料的要求等进行深入和细化的阐述 ,同时对指导原则起草过程中存在争议的一些问题 进行了。 [关键词 ]　合成多肽 ;指导原则 ;合成工艺 ;技术要求 [中图分类号 ] R95　　[文献标志码 ] C　　[文章编号 ] 1003 - 3734 (2010) 02 - 0102 - 04 Ana lysis of key problem s on syn thesis of syn thetic peptide drugs WANG Peng (Cen ter for D rug Eva lua tion, S ta te Food and D rug A dm in istra tion, B eijing 100038, Ch ina) [ Abstract] 　Based on Guidance on Chem istry, Manufacturing and Controls Studies for Synthetic Pep tide D rugs and the common issues about drug registration, this paper summarized and analyzed key p roblem s on synthesis of pep2 tide drugs. A number of technical requirements, such as the requirements for starting materials and synthesis informa2 tion, were deep ly clarified, and controversial issues in the p rocess of drafting the guidance were described. [ Key words] 　synthetic pep tide; guidance; synthesis; technical requirement 　　有关合成多肽药物的结构确证和质量研究 ,在 指导原则解读系列专题 (十五 )中已有论述 ,本文主 要是结合药品技术审评过程中遇到的一些共性问题 就合成多肽药物的合成工艺研究中的几个关键问题 对《合成多肽药物药学研究技术指导原则 》做进一 步解读。 1　合成工艺的选择 在日常审评工作中会遇到一些研究者提出这样 的问题 :多肽合成是采用固相合成工艺好呢 ? 还是 液相工艺好 ? 国家食品药品监督管理局药品审评中 心 (CDE)更倾向于哪种工艺 ? 液相和固相合成工艺是多肽化学合成的两种主 要合成工艺。尽管随着技术、设备的不断发展、完 善 ,多肽的固相合成工艺越来越成熟并逐渐占据了 多肽化学合成的主导地位 ,但液相法是经典的多肽 合成方法 ,具有产物纯度高等优点 ,目前仍然是制备 多肽甚至蛋白质的重要方法。因此 ,无论是在实际 的药物研究工作中还是在指导原则中都不可能简单 地区分两种工艺的好与坏。研究者必须在充分了解 两种工艺优缺点的基础上 ,根据目标肽的特点、合成 的实际需要以及研究者自身的研制条件、经验等选 择合适的制备工艺。其中有 3点需要特别关注 : 第一 ,研究者必须充分了解固相和液相两种工艺 的优缺点。指导原则对此有相对比较详细的表述 ,总 结起来 :液相工艺的优点是每步中间体均可以纯化 , 可以得到高纯度的产品 ,缺点是费时费力 ,自动化程 度不高 ;固相工艺恰好相反 ,其优点是能够实现自动 化 ,缺点是由于每步的中间体不能纯化 ,粗品的纯度 不如液相合成产物 ,需要有可靠的分离、纯化手段。 第二 ,基于合成方法的不同 ,通常认为液相合成 法较适于合成短肽 ,固相合成法更适于合成中、长肽。 但是这也并不绝对 ,例如随着固相合成工艺的成熟和 普及 ,现在很多只有 4, 5个氨基酸的短肽也采用固相 法制备 ,一些长肽为解决困难序列、纯度等问题则先 采用液相方法合成短肽片断 ,然后将该片断应用到固 Chinese Journal of New D rugs 2010, 19 (2) 103　　　 中国新药杂志 2010年第 19卷第 2期 相合成中。因此 ,研究者需根据目标肽的特点和自身 试验条件、试验经验等选择合适的制备工艺。 第三 ,过去曾认为液相合成法可以大规模合成 , 而固相合成法受树脂载量等因素的影响 ,合成规模 一般不大。但近年来随着固相合成技术、设备的不 断提高、完善 ,固相合成法的产量也可以达到公斤级 甚至更高 ,合成规模的问题正在逐步得到解决。 2　合成策略 表面上看 ,肽键的形成只是一个简单的羧酸与 胺之间形成酰胺键的过程。但是由于每一个氨基酸 既含有氨基同时又含有羧基 ,如果活化一种氨基酸 , 则其可以与同一种或另一种氨基酸分子的氨基反 应 ,此外一些氨基酸 (如 Ser, Thr, Tyr, A sp等 )的侧 链官能团也能够参与反应 ,这使得肽合成变得更加 复杂。因此 ,合成策略的选择是多肽合成工艺研究 的核心工作 ,很多情况下需要深思熟虑地进行规划。 多肽的合成策略通常是指目标肽肽链的组装方 法以及肽键形成的步骤顺序和保护方法 ,其中需要 关注的技术问题非常繁杂 ,如 Nα 2氨基、Cα 2羧基以 及侧链官能团的保护与脱除 ,常见的保护基及特点 , 保护基的匹配 ,如何控制副反应和消旋化等。鉴于 本指导原则定位于“原则性要求 ”,因此指导原则只 是强调了“多肽合成的研究中不仅需要关注活化方 法、偶联方法等 ,更要关注保护 /脱保护策略的选 择 ”,而没有涉及过多的技术细节。但是作为药品 注册研究来说 ,研究者需重点关注如下几方面内容 : ①从战略角度 ,要根据目标肽的序列等情况研究、 选择肽链的组装方法 ,例如是采用线性合成还是选 择片段缩合的方法 ,研究者需充分了解这两种方法 各自的优缺点。限于篇幅本文不做详细的介绍。 ②选择适当的缩合方法。在室温下 ,一个氨基酸的 羧基与另一个氨基酸氨基的反应产物是铵盐而不是 酰胺 ,因此事先需要对羧基组分进行活化。目前 ,可 用于肽键缩合的试剂和缩合方法较多 ,常见的有酰 基叠氮物法、酸酐法、碳二亚胺法、活化酯法、磷鎓盐 试剂法、脲鎓盐试剂法等。这些缩合方法及缩合试 剂均具有各自的特点 ,例如 :叠氮法通常被认为是消 旋化倾向最小的缩合方法 ;碳二亚胺化合物中的 DCC相对便宜曾经是优选的缩合剂 ,但其具有较高 的消旋化和 C端差向异构化倾向 ;而 DCC与辅助试 剂 HOB t等联合应用能够有效地抑制消旋化等问 题 ,再度得到了广泛应用 ;磷鎓盐试剂中的 BOP是 一种非常有效的缩合剂 ,但反应中易产生具有强毒 性和致癌性的 HMPA;脲鎓盐试剂中的 TBTU 和 HBTU的缩合产率高 ,并且能够减少甚至排除消旋 和副反应的发生。研究者需要充分了解这些缩合方 法的特点 ,再结合目标肽的具体情况 (包括氨基酸 侧链的情况 )选择适宜的缩合方法 ,研究资料中应 明确缩合方法的选择依据。③保护 /脱保护策略。 官能团的保护和脱保护是多肽化学合成的基础 ,是 决定多肽合成成功与否的关键因素。对于 C端 →N 端合成策略来说需要对 Nα 2氨基、Cα 2羧基 (液相合 成法或固相合成连接臂 )以及多种侧链官能团等大 量官能团进行保护 ,同时由于对选择性的要求不同 , 必须区分临时性保护 (如下一步要反应的氨基或羧 基 )和半永久性保护 (侧链官能团 ) ,临时性保护基 的脱除要保证不干扰已形成的肽键和侧链的半永久 性保护基 ,而最终去除半永久性保护基也要保证组 合起的肽链不受影响 ,此外还需关注的是保护基的 引入和脱除存在发生消旋的可能。因此 ,尽管目前 已经有优选的 Boc /Bzl和 Fmoc / tBu策略 ,保护 /脱 保护策略仍然是多肽化学合成中最为复杂和困难的 问题之一 ,任何一部关于合成多肽的专著中都会用 大量篇幅重点介绍保护 /脱保护策略。 本指导原则由于指导思想和篇幅的所限并未对 保护 /脱保护策略的技术问题进行深入探讨 ,但是作 为药品注册研究 ,保护 /脱保护策略的研究和选择是 必不可少的部分 ,申报资料中必须予以体现。研究者 应重点说明保护基的匹配问题 ,要求每一类保护基 (临时保护基和半永久性保护基 )的脱除互不相干。 目前 , Boc /Bzl和 Fmoc / tBu策略已成为优选的 保护 /脱保护策略 ,据统计 80%以上多肽合成应用了 这两种方法 ,很多研究者认为采用这两种策略就不必 再进行研究。实则不然 ,因为至今还没有一种普遍适 用的、理想的保护基 ,而且 Boc /Bzl和 Fmoc / tBu策略 本身都有各自鲜明的优缺点。在合成长肽或含困难 序列的肽时常常还会将两种策略结合应用。 除上述内容外 ,多肽的合成策略还涉及诸如固 相合成中树脂的选择、连接臂的选择、二硫键形成方 法等很多领域 ,这些都需要开展针对性的研究工作。 需要特别说明的是 ,本部分内容由于篇幅所限 并未区分固相和液相合成方法。 3　消旋化的控制 “消旋化 ”在有机化学中是指单个光学异构体 完全转变为消旋体 ,而在肽化学中“消旋化 ”也常常 用于表示 1个手性中心部分或全部差向异构化 ,而 不管反应中生成的是非对映异构体混合物还是对映 异构体混合物。 Chinese Journal of New D rugs 2010, 19 (2) 104　　 中国新药杂志 2010年第 19卷第 2期 尽管本指导原则未对控制多肽合成中的消旋化 提出明确的要求 ,但是鉴于消旋化对于多肽合成和 纯化工艺的重要性 ,从化学药物合成工艺控制的一 般原则来说 ,研究者必须对多肽合成工艺中的消旋 化问题进行研究并提出明确的控制方法。这是由于 除甘氨酸外的α2氨基酸均为手性分子 ,参与多肽合 成的官能团均连接在手性中心上 ,它们参与的所有 反应 (如保护基的引入和脱除、羧基的活化反应等 ) 都存在消旋化的可能。对于一个 10肽 ,如果每个氨 基酸仅发生 1%的差向异构化 ,则合成终产物的光 学纯度就只有 90. 4% ,而对于一个 50肽 ,其光学纯 度则仅有 60. 5% ,从而会影响到肽的生物活性。由 于将差向异构体从终产物中有效分离是一个非常繁 琐的事情 ,因此在肽合成过程中就必须采取相应措 施、加强过程控制 ,将消旋化降至最低。通常需关注 缩合方法、保护 /脱保护策略的选择 ,加强对缩合试 剂、投料比、反应条件等的考察研究。此外 ,还应注 意合成原料 ———各种保护氨基酸的控制 ,建议采用 有效手段控制其光学纯度。 4　分离和纯化 与普通化学合成药物相比 ,多肽合成工艺中产 生的杂质来源非常广泛 ,如缺失肽、断裂肽、氧化肽、 差向异构体、侧链酰基化、二硫键交换的产物等 ,而 很多杂质与目标肽本身的性质非常接近 ,因而分离 和纯化工艺的可行性就显得尤为重要。为此 ,本指 导原则用了相对比较多的篇幅对“分离和纯化 ”的 方法、研究内容等进行了阐述。而在实际工作中 ,我 们发现很多研究者对多肽的分离纯化工艺不够重视 , 提供的资料非常简单 ,尤其是很多申报资料未提供分 离纯化方法的验证资料 ,或者是研究得不充分 ,从而 导致无法对该分离纯化方法的可行性进行。 事实上 ,指导原则已经明确要求研究者在注册申 报资料中必须提供 : ①详细的纯化工艺。②相关的 工艺参数。③详细的纯化工艺的验证资料。这其中 纯化工艺的验证资料最为重要 ,是说明多肽纯化工艺 可行性的关键环节。纯化工艺的验证一般可通过比 较纯化前后样品的纯度来进行 ,申报资料中需要提供 样品纯化前后的纯度研究图谱和相应的纯度数据。 需要强调的是 : ①纯化前后样品纯度的对比研 究需要以可行的杂质分析方法为基础。②纯化前 多肽粗品的纯度应符合合成多肽的一般规律。例 如 ,一个接近 40个氨基酸残基的多肽采用固相工艺 合成 ,研究者提供 HPLC图谱显示纯化前粗肽的纯 度高达 80%以上。然而 ,采用固相合成工艺制备含 有 40个氨基酸残基的多肽 ,要使总收率达到 80% , 其每一步得率均需超过 99. 5% ,这在实际生产中是 很难做到的 ,这种情况会提示粗品纯度检查方法的 专属性不够理想 ,不能充分检出粗品中存在的各种 杂质。正是基于此 ,合成多肽杂质研究方法通常也 会用粗肽来对方法的专属性进行验证。 总之 ,分离纯化工艺验证研究的目的是要说明 所采用的工艺能够有效地分离、去除合成中产生的 各种杂质和副产物 ,注册申报资料应围绕该目的提 供翔实的试验数据。 5　合成所用氨基酸的要求 氨基酸及其衍生物 (通常是保护氨基酸 )作为 多肽合成的起始原料 ,其质量对合成多肽的质量有 重要影响 ,例如保护氨基酸的纯度如果为 99% ,那 么合成一个 10肽 ,纯化前仅由起始原料引入的杂质 就会高达 10% ,因此研究者应特别关注氨基酸及其 衍生物的来源、质控方法等。申报资料中 ,一是要提 供氨基酸的来源及相关证明文件 ,二是要提供氨基 酸的质量和检验报告。指导原则对氨基酸的质 量标准有明确的要求“作为起始原料的氨基酸及其衍 生物的质量标准一般应包括性状、熔点、比旋度、化学 纯度、色谱纯度及光学纯度、含量等 ,其中对于起始原 料的化学纯度和光学纯度的控制尤为重要。” 需要特别关注保护氨基酸光学纯度的控制问 题。在本指导原则征求意见阶段 ,关于是否要求控 制合成所用氨基酸的光学纯度的问题就存在较多争 论 ,企业界的代表认为实施起来难度较大。课题组 经多次讨论并充分征求国内权威专家意见 ,认为合 成起始原料氨基酸的光学纯度对终产品质量具有明 显影响 ,同时也参考了 FDA, EMEA的相关技术要求 并充分考虑到国内目前保护氨基酸的质量情况 ,最 终在本指导原则的定稿中还是保留了相关要求。在 实际工作中 ,国内多数研究者采用测定比旋度的方 法控制氨基酸的光学纯度 ,但是受专属性、灵敏度等 的限制 ,比旋度无法有效控制氨基酸的光学纯度 ,尤 其是对于比旋度数值较小的保护氨基酸更是如此 , 如 Fmoc2Glu (O tBu) 2OH为 + 1. 2°, Fmoc2Gln ( Trt) 2 OH为 - 1. 0°。因此 ,建议采用手性 HPLC法控制起 始原料的光学纯度。 6　注册申报资料中的常见问题 从实际审评工作来看 ,在合成多肽注册申报资 料的合成工艺部分除了前文所述的工艺研究和工艺 验证工作不充分之外 (例如未对纯化工艺等进行研 究、验证 ,未提供保护 /脱保护策略、缩合方法的选择 Chinese Journal of New D rugs 2010, 19 (2) 105　　　 中国新药杂志 2010年第 19卷第 2期 依据和必要的研究资料等 ) ,最常见的问题就是提 供的合成工艺不够详细 ,主要表现为提供的工艺步 骤和操作过程过于简单、工艺参数不够全面、过程控 制方法不够详细。 以固相合成制备生长抑素为例 ,有些合成工艺 表述为 :以 ×××树脂起始 ,按照多肽的氨基酸序列 进行固相合成 ,顺序连接 Ser, Thr⋯⋯A la,以 20%六 氢哌啶 /二氯甲烷为脱保护剂 , ×××为缩合试剂 ; 用 ×××为切割剂 ,将直链肽从树脂上切割下来 ;在 ×××中 ,直链肽经 ××氧化生成二硫键形成环肽 , 得到生长抑素粗品 ⋯⋯这样的工艺资料看似包含了 合成工艺的整个过程 ,但事实上评价者很难对该工 艺的可行性做出准确判断 ,因为它缺少太多的细节 , 例如没有说明树脂的用量及溶胀洗涤方法、脱保护、 缩合反应的具体方法等。 根据相关指导原则的要求 ,结合多肽合成的具 体特点 ,多肽的固相合成工艺资料应包括 : ①如果 各个氨基酸缩合工艺完全一致 ,应至少要提供一个 合成循环的详细合成工艺及工艺参数 ,包括氨基酸 的用量、树脂的用量及处理方法、脱保护的详细方法 (次数、时间、洗涤情况等 )、缩合反应的详细方法 (缩合剂用量、反应时间、洗涤情况等 )等。②如果 某个氨基酸的缩合方法有所变化 ,如缩合时间等具 体的工艺参数不同、需要进行二次或三次缩合、由于 一些困难序列需要进行封闭等 ,申报资料中必须明 确说明。③如果第一个氨基酸需要通过酯键、酰胺 键或酰肼键等与树脂连接 ,应提供该步骤的详细合 成工艺。④应提供详细的裂解、二硫键形成、纯化、 干燥过程的工艺及工艺参数 ,如纯化工艺应提供柱 填料种类及粒径、色谱柱的直径、流动相组成、上样 量、检测波长、流速、色谱条件 ,并详细说明组分收集 的选择标准、其他组分的处理方式等。⑤提供详细 的过程控制方法。如缩合反应、二硫键连接等反应 终点的监控。 对于液相合成工艺 ,由于在合成中会用到不同 的缩合方法及脱保护技术 ,因此应详细说明合成中 的每一步操作以及反应终点监控等过程控制方法 , 尤其是分离纯化工艺。 7　结语 由于组成的特殊性 ,合成多肽药物的合成工艺 具有与普通化学药物明显不同的特殊之处 ,本文只 是根据指导原则起草过程中遇到的一些问题并结合 药品技术审评过程中的一些体会尝试对《合成多肽 药物药学研究技术指导原则 》以及合成多肽药物合 成工艺研究中的部分关键问题进行解读 ,希望能够 使这部指导原则更好地服务于研究者。 最后还需要说明的是 ,与其他指导原则一样 ,本 指导原则不可能穷尽合成多肽药物合成工艺研究领 域内的所有问题 ,研究者还需根据药品研究的一般 规律、针对各自品种的特点开展全面的研究工作。 [ 　参 　考 　文 　献 　 ] [ 1 ]　国家食品药品监督管理局. 合成多肽药物药学研究技术指导 原则 [ S]. 2007. [ 2 ]　N. 休厄德 , H. D. 贾库布克. 肽 :化学与生物学 [M ]. 北京 :科 学出版社 , 2005. [ 3 ]　彭师奇. 多肽药物化学 [M ]. 北京 :科学出版社 , 1993. [ 4 ]　NA IL SL, AKERSMJ. 蛋白质药物———开发与生产 [M ]. 北京 : 化学工业出版社 , 2006. [ 5 ]　王军志主编. 生物技术药物研究开发和质量控制 [M ]. 北京 : 科学出版社 , 2003. 编辑 :王宇梅 /接受日期 : 2009 - 10 - 09 　 (上接第 97页 ) 于哪类化合物 ,有助于剂型的选择和化合物特性的 认知 ,有利于对药物进行综合评价。②晶型、粒度 的研究。在药物研发中常常会忽视 ,对于水溶性不 好的药物 ,晶型和粒度对药物的毒性和疗效有一定 的影响 ,对此进行深入的研究有助于药物的开发。 ③灭菌工艺条件。药物的灭菌工艺对药物的安全 性影响很大 ,因此在进行药物工艺研究应对灭菌工 艺条件进行全面深入的研究 ,确保药物的质量。 ④杂质限度的依据。如何确定杂质的限度 ,是创新 药物开发的关键环节 ,需要结合药物安全性的数据 , 并结合化合物的特点 ,综合判断以确定合理的限度 , 可参考相关的指导原则。⑤稳定性研究。应关注 影响产品质量的包装密封系统方面的变化 ,这是保 证药物质量的重要方面。 4. 4　上市后阶段 药品批准上市后 ,鉴于种种原因 ,药品的处方、 工艺 ,原辅料的来源、规格等方面会发生相应的变 更 ,具体要求参照即将发布的《已上市化学药品变 更研究的技术指导原则》。 以上是笔者在创新药物 CMC审评中的一些思 考 ,希望能对药物的研究有一定的参考作用 ,如果有 不妥之处也希望批评指正。 编辑 :王宇梅 /接受日期 : 2009 - 03 - 18