免疫组化

null免疫组化基本技术免疫组化基本技术null第一部分 组织与细胞材料的制备主要内容 一、人体组织标本的取材 二、动物组织标本的取材 三、取材注意事项 四、细胞标本的准备 五、组织的固定、脱水、透明和包埋 六、切片 七、组织与细胞材料的保存主要内容 一、人体组织标本的取材 二、动物组织标本的取材 三、取材注意事项 四、细胞标本的准备 五、组织的固定、脱水、透明和包埋 六、切片 七、组织与细胞材料的保存 概 述 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IH前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IH染色过程中的脱片。 概 述 免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IH前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IH染色过程中的脱片。 一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。null二、动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。null动物处死方法： 1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注 2.空气栓塞法 3.断头法 4.击头法 5.股动脉放血法null三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。 3.组织块的大小 厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定 4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定 2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。 3.组织块的大小 厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定 4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定 5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。 6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙 6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法： 1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法： 1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IH染色易引起背 景染色。 2.穿刺吸取法优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IH染色易引起背 景染色。 2.穿刺吸取法 3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。 （1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法 3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。 （1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法 4.活细胞标本的制备法 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IH。4.活细胞标本的制备法 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IH。五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬 化、增加组织硬度、便于制片。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。 （4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬 化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。 （6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。2.固定液的种类 (1)甲醛固定液 10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林2.固定液的种类 (1)甲醛固定液 10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 重铬酸钾 25mg 氯化汞 10g 冰醋酸 50ml 蒸馏水 800ml(2)4％多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 重铬酸钾 25mg 氯化汞 10g 冰醋酸 50ml 蒸馏水 800ml(5)Zamboni S液 多聚甲醛 20g 饱和苦味酸 150ml PB液至 1000ml (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(5)Zamboni S液 多聚甲醛 20g 饱和苦味酸 150ml PB液至 1000ml (6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿 30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇 类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。(10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇 类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。六、组织脱水、浸蜡及包埋 1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。六、组织脱水、浸蜡及包埋 1.目的 由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。 常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。 常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。 在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。4.原则 脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。 在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。5.常规石蜡包埋过程 (1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 (2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ5.常规石蜡包埋过程 (1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 (2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ (4)石蜡包埋：修蜡块，标号(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ (4)石蜡包埋：修蜡块，标号6.根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件 (1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间6.根据本实验室经验各种不同类型组织 的石蜡包埋条件 (1)大动物组织（狗、兔、小儿尸检）脱水、透明和浸蜡时间 75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％乙醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。 75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％乙醇Ⅰ 2h，95％乙醇Ⅱ 2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min, Ⅱ10min，Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。(2)小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min, Ⅱ10min，Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间 75％乙醇30min，85％乙醇1h，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜，无水乙醇Ⅰ30min，Ⅱ1～2h和Ⅲ4h，二甲苯Ⅰ30min，Ⅱ30min和Ⅲ1h。(3)活检或手术切除标本的脱水透明和浸 蜡时间 75％乙醇30min，85％乙醇1h，95％乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h和Ⅲ4h或过夜，无水乙醇Ⅰ30min，Ⅱ1～2h和Ⅲ4h，二甲苯Ⅰ30min，Ⅱ30min和Ⅲ1h。七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。七、组织切片 切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。1.切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。1.切片前的准备工作 (1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。 APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min →APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml 甲醛明胶液： 40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml铬矾明胶液： 铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml 甲醛明胶液： 40％甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml2.石蜡切片： 3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机) 2.石蜡切片： 3.冰冻切片：IHC冰冻切片，ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机) 4.切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）4.切片要求及注意事项： (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52－60℃烤片18h。 (3)切片厚2～4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片）(7)冰冻切片后需凉干后立即固定 (8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理24h，冰冻切片。 (9)冰冻切片固定后-80℃保存备用(7)冰冻切片后需凉干后立即固定 (8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理24h，冰冻切片。 (9)冰冻切片固定后-80℃保存备用八、组织与细胞材料的保存 1.冷冻保存： -80℃，-145℃，-198℃ 组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。八、组织与细胞材料的保存 1.冷冻保存： -80℃，-145℃，-198℃ 组织应在离体30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80℃冻存。 3.蜡块的保存 4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。2.新鲜组织经适当固定后，装入冻存管 中，-80℃冻存。 3.蜡块的保存 4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上，9孔板上的细胞可经固定后-80℃保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。第二部分 IHC的一些基本技术第二部分 IHC的一些基本技术主要内容 一、石蜡切片的脱蜡至水 二、内源性酶的消除方法 三、IHC的非特异性染色 四、热诱导的抗原修复 五、显示系统及衬染剂的选择和配制 主要内容 一、石蜡切片的脱蜡至水 二、内源性酶的消除方法 三、IHC的非特异性染色 四、热诱导的抗原修复 五、显示系统及衬染剂的选择和配制 一、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。 一、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。 二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，无水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水冲洗。 二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，无水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水冲洗。二、内源性酶的消除方法 (一)内源性过氧化物酶的消除方法： 1. 0.3%～3%H2O2甲醇液20min 2. 1％ H2O2 20min 3. 3％苯肼溶液 37℃ 1h 4. 0.075%盐酸甲醇液 30min二、内源性酶的消除方法 (一)内源性过氧化物酶的消除方法： 1. 0.3%～3%H2O2甲醇液20min 2. 1％ H2O2 20min 3. 3％苯肼溶液 37℃ 1h 4. 0.075%盐酸甲醇液 30minnull5.DAB-H2O2溶液中加0.005M NaN3 过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min， 经洗后1％硼酸钠处理10min。 7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸30～60min。(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 10％醋酸 10min 2. 0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 10％醋酸 10min 2. 0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min(三)内源性生物素的消除方法 1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素 2.先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。(三)内源性生物素的消除方法 1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素 2.先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。三、IHC的非特异性染色 1.特异性抗体不纯 2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。 3.IgG的交叉反应三、IHC的非特异性染色 1.特异性抗体不纯 2.抗体免疫球蛋白所带电荷与检测组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。 3.IgG的交叉反应4.共同抗原决定簇 5.单一决定簇抗体的异质性 6.特异性抗原弥散 7.IgG受体干扰 8.鼠源性抗体检测鼠源性组织4.共同抗原决定簇 5.单一决定簇抗体的异质性 6.特异性抗原弥散 7.IgG受体干扰 8.鼠源性抗体检测鼠源性组织解决方法： 1.用正常二抗血清吸附 2.将组织用酶消化或抗原修复 3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除 4.高度稀释特异性一抗解决方法： 1.用正常二抗血清吸附 2.将组织用酶消化或抗原修复 3.二抗用木瓜酶将抗体结合部Fab切除 4.高度稀释特异性一抗四、热诱导的抗原修复 抗原修复(Antigen Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。四、热诱导的抗原修复 抗原修复(Antigen Retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。1.依据：40年代美国学者Fraenkel-conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。1.依据：40年代美国学者Fraenkel-conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。2.修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃，15min；③水浴锅100℃，15min；④高压锅/消毒锅120℃，5min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。2.修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃，15min；③水浴锅100℃，15min；④高压锅/消毒锅120℃，5min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。3.修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01M pH7.0 PBS;④2%硫酸铝；⑤2％硝酸铝；⑥生理盐水；⑦蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。3.修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01M pH7.0 PBS;④2%硫酸铝；⑤2％硝酸铝；⑥生理盐水；⑦蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。4.温度与修复时间的关系：许多的实验结果明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：①100℃ 20min；②90℃ 40min；③80℃ 60min；④70℃ 20h。 4.温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：①100℃ 20min；②90℃ 40min；③80℃ 60min；④70℃ 20h。 5.AR应注意的问题： ①热处理后应注意自然冷却； ②热处理液不要让其煮干； ③不要任何抗原的检测都使用该方法； ④一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；5.AR应注意的问题： ①热处理后应注意自然冷却； ②热处理液不要让其煮干； ③不要任何抗原的检测都使用该方法； ④一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；⑤形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。 ⑥如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可改善某些抗原的修复。⑤形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。 ⑥如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可改善某些抗原的修复。 五、显示系统及衬染剂的选择和配制 (一)显示系统 目前用于IHC的标记酶主要有HRP，AKP，其显示系统分别为：1.HRP常用的发色基因： (1)3、3’-二氨基联苯胺盐酸盐(3、3’-diaminbezidine;DAB); (2)3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);1.HRP常用的发色基因： (1)3、3’-二氨基联苯胺盐酸盐(3、3’-diaminbezidine;DAB); (2)3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);(3)四甲基联苯胺； (4)盐酸对苯二胺； (5)4-氯-1-萘酚； (6)高香草酸 (7) α –萘酚派若宁(3)四甲基联苯胺； (4)盐酸对苯二胺； (5)4-氯-1-萘酚； (6)高香草酸 (7) α –萘酚派若宁2.AKP常用的发色基团： (1)BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)＋NBT(硝基四氮唑蓝)； (2) α –萘酚AS-BI磷酸盐＋快红或快蓝。2.AKP常用的发色基团： (1)BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)＋NBT(硝基四氮唑蓝)； (2) α –萘酚AS-BI磷酸盐＋快红或快蓝。null3.配制方法 (1)DAB:50mg DAB溶在0.01M pH7.6 100ml Tris-Hcl中，加入0.03% H2O2，显色8～12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。3.配制方法 (1)DAB:50mg DAB溶在0.01M pH7.6 100ml Tris-Hcl中，加入0.03% H2O2，显色8～12min，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。(2)AEC:取40mg AEC溶在5ml二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入0.05mol/L pH5.5醋酸盐缓冲液50ml，最后加入0.03% H2O,终产物为红色可溶性。(2)AEC:取40mg AEC溶在5ml二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入0.05mol/L pH5.5醋酸盐缓冲液50ml，最后加入0.03% H2O,终产物为红色可溶性。(3)4-氯-萘酚：取100mg 4cl-1-萘酚溶于10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入0.05M pH7.6 TB 190ml,过滤后加入0.03% H2O2。(3)4-氯-萘酚：取100mg 4cl-1-萘酚溶于10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入0.05M pH7.6 TB 190ml,过滤后加入0.03% H2O2。(二)衬染剂的选择和配制 IHC染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，以利于结果的。(二)衬染剂的选择和配制 IHC染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，以利于结果的分析。nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull1.苏木素衬染色剂 (1)Mayer氏苏木素：取1g Mayer氏苏木素加温溶于100ml蒸馏水中，再加入50g碘酸钠和50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。1.苏木素衬染色剂 (1)Mayer氏苏木素：取1g Mayer氏苏木素加温溶于100ml蒸馏水中，再加入50g碘酸钠和50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。(2)Harris氏苏木素：取2.5g Harris氏苏木素溶于25ml无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解30min，冷却后过滤，使用时加醋酸4ml，可增加染色强度。(2)Harris氏苏木素：取2.5g Harris氏苏木素溶于25ml无水乙醇中，另将钾明矾加温溶于500ml蒸馏水中，待钾明矾全部溶解，再将二液混合在一起，加入氧化汞，溶解30min，冷却后过滤，使用时加醋酸4ml，可增加染色强度。2.甲基绿：取2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，直到氯仿为无色。2.甲基绿：取2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净的分液漏斗，加入三氯甲烷充分摇荡混合，使甲基绿中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，移去紫红色的三氯甲烷，如此反复更换氯仿，直到氯仿为无色。3.核固红：取0.1g核固红溶于100ml 15％硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。 3.核固红：取0.1g核固红溶于100ml 15％硫酸铝水溶液，加热溶解，冷却后过滤。 第三部分 IHC的结果判读第三部分 IHC的结果判读主要内容 一、免疫组化结果的判断原则 二、对照染色 三、非特异染色 四、阳性标记的形态特征和判断 五、染色失败的可能原因 主要内容 一、免疫组化结果的判断原则 二、对照染色设计 三、非特异染色 四、阳性标记的形态特征和判断 五、染色失败的可能原因 null一、免疫组化结果的判断原则null  ⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 ⒉抗原表达必须在特定部位。如PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内,不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。null  ⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。 null  ⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。null 二、对照染色设计 null (一）对照染色的目的 设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。 null 假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯(特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④Fc受体的干扰，等等。null（二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类：null⒈阳性组织对照 指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色的有效性，排除假阴性的可能。 null⒉阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。null⒊阴性试剂对照 是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照、替代对照等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。null⒋自身对照 是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。null 三、非特异染色 null 非特异染色是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自： null①内源性干扰(自发荧光、内源酶、内源性生物素等)；②试剂污染(质量差，交叉反应，Fc受体干扰等)；③组织处理不当(组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等)。null 纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，即对症下药(具体纠正方法不展开讲了，同学们可以自己阅读讲义p123-126) 。null四、阳性标记的形态特征和判断null 免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。特点包括定性、定位和定量三方面。null 免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。null (一)阳性标记免疫特征： 分"弱(+)、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法（FITC为例） 则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；null 免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。一般图片照像，原则上多取强阳性区域。null(二)阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H2O2为例） 可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。nullnullnullnullnull(三)阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例） 免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：①局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型；⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。null(四)阳性标记强度特征 依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+ ，指阳性细胞总数在25%以下）；null中等阳性（++,指阳性细胞总数在25%—49%)；强阳性（+++ ，指阳性细胞总数在50%以上)。目前多采用积分综合计量。计算公式为：（+）%x1 +（++）%x2+（+++）%x3；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++),>1.5者为(+++)。至少随机观察5-10个HPF。null五、染色失败的可能原因 null 免疫组化染色的基本要求有二：①实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无，二者的比值应大于1（阳性/背景）；②对照染色的结果应附合要求。否则，所得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。null 假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等有关。null 假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果，谓之假阴性。其原因与组织处理不当，组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变质等),操作失误等有关。 null判断原则： 实验设计 抗体选择 抗原定位性 抗原分布不均一性null谢 谢！