在CCl4诱导的大鼠肝脏纤维化模型中肝功、肝脏纤维化程度的监测

中国实验诊断学 20o7年 9月 第 l1卷 第9期 文章编号：1007—4287(2007)09—1137—04 在 CC14诱导的大鼠肝脏纤维化模型中 肝功、肝脏纤维化程度的监测 徐 川，董云旭，吕文天，赵大兵，王 劲，姜在波，张建生，朱康顺，单 鸿 (中山大学附属第三医院放射科，广东 广州510630) 一 1l37 一 摘要：目的 对肝纤维化实验动物模型的肝功能和肝纤维化程度等指标进行评估。方法 肝纤维化大鼠模型的 制备，肝纤维化指标。血清透明质酸(HA)，层粘连蛋白(LN)，Ⅲ型前胶原(PCllI)，IV型胶原(IV．C)。肝功能指标：①反 映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标：总蛋白TPR( ( L)，白蛋白AI ( L)，球蛋白GLB( L)；②肝细胞受损的指标： 谷草转氨酶AST(U／L)，谷丙转氨酶AI (U／L)，胆碱脂酶CHE(U／L)；③反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的指标：总胆 红素 TBILI(pmol／L)，直接胆红素 DBILl(pmol／L)，间接胆红素 IBILI(tnnol／L)，总胆汁酸 TBA(／maol／L)；④胆汁淤积指示 酶：谷氨酰转肽酶OGT(U／L)，碱性磷酸酶 ALP(U／L)。结果 纤维化肝脏的形态学和病理学结果显示的大鼠的肝纤 维化处于终末期状态；对于肝纤4项，除层粘连蛋白(LN)~b，正常组和肝纤维化组的大鼠有显著性差异；对于肝功 15 项，除了总蛋白(TPROT)和胆碱酯酶(CHE)~b，正常组和肝纤维化组的大鼠有显著性差异。结论 肝纤维化大鼠的肝 纤维化和肝功指标对对照组相比有显著性差异，与肝纤维化的病理和形态学检测相一致。 关键词：肝纤维化动物模型；肝纤维化指标；肝功能指标 中图分类号：R575．2 文献标识码：A To check both the liver function and the degree of the liver cirrhosis of the CO4-induced rat liver cirrhosis model XU Chuang，DONG Yun-xu，LU Wen-tian，et a1．(Radiology幽Ⅻ加l删 ，the third Z hospital ofSun Yat-sen University，Guangdong 510630，China) Abstract：Objective To evaluate the liver function and the degree of liver cirrhosis of the liver cirrhosis mode1．Methods To prepare the rat liver cirrhosis mode1．Automatic岛c击ty．To detectthe marks mflecfi~ the degree ofliver cirrhosis as follows：HA，LN， PCⅢ，Ⅳ．C．To detect the marks mflecfi~the liver functions as follows：①The marks to reflect the c印 lity to synthesize proteins， Ⅱ’R( ( L)， 邺 ( L)，GLB( L)；②The marks to reflect the injury ofthe liver cells：AST(U／L)， r(U／L)，CHE(U／L)；③ The marks to reflect the capability to egest the bile，excrect，and detoxicate：TBILI(pmol／L)，DBILI(pmol／L)，IBILI(tnnol／L)，TBA (／maol／L)；④The enzymes to reflect the eholestasis：GGT(U／L)， (u／L)．Results The results of both the morphological and the pathological studies showed that the degree ofthe hver cirrhosis was ofthe terminal stage．To the4 items reflectingthe degree ofhver cirrhosis，except the LN，all the other items were shown significant difference between normal and liver cirrhosis rats．To the 15 item examinations of hver function，except the TPROT and the CHE，all the other items were shown significant difference between normal and liver cirrhosis rats．Condusion In general，there were significant different marks reflecting the liver cirrhosis and the hver fimc- tion between the normal and the liver cirrhosis rats．Tiffs Was accordance with the~tudy on either the pathology or the morphology． Key words：liver cirrhosis model；marks of liver cirrhosis；marks of liver function (Chin J Lab晰 ，2O07，11：1137) 肝硬化又称肝纤维化，是肝脏在细胞毒性药物或 病毒等外 I生毒物的侵害下，肝细胞坏死、肝细胞代 偿性增生、纤维组织异常增生的病理生理学过程【 ．2J。 肝细胞损害导致的细胞破坏，使肝内容物溢出，肝细 胞内的各种代谢酶进入血液；肝细胞损坏的同时，纤 维化导致的肝脏细胞与血液的隔离，使肝脏合成蛋白 能力下降；由于肝脏纤维化和假小叶的形成，使肝细 胞间的毛细胆管通路被阻断，胆管上皮细胞的进行I生 破坏和狭窄，使得胆汁淤积，和相应酶系统异常【3，4l。 反映上述方面的检测方法虽然已经很成熟，但是，对 肝纤维化动物模型的研究还不多见。本研究以终末 期肝纤维化大鼠为实验对象，系统地对肝脏纤维化和 肝功指标进行了分析，旨在对利用动物模型进行的肝 国誊 )，广东省科技项目( )，广东省自然 ． ’。 ： 一 ：：一⋯一 ’ 科学 金( 1377) (20060390756 2006B36003013 06021377 ‘ ‘ ‘ “ 通讯作者 1．1 实验材料 维普资讯 http://www.cqvip.com 一 1138 — 1．1．1 材料 SD大鼠，雌性，180—250g，100只。 药物：40％四氯化碳橄榄油溶液，40％酒精。 1．1．2 实验动物分组 SD大鼠，雌性，180—250 g。 正常组 10只，肝硬化大鼠90只。在肝硬化模型制 备中，排除死亡动物，按照每实验组各5只动物作为 统计学计算数量，实验用大鼠的数量足够使用。 1．1．3 给药方法 cch 0．1 ml／100 g体重，1 ml酒 精，每天给一种药物，按顺序灌 胃给药，给药 2天 后，停药 1天。腹水的出现表明终末期肝硬化形成。 终末期肝硬化形成后，四氯化碳药量酣隋减少，维持 肝硬化腹水的状态，给药同上。每天观察大鼠 外观的变化，当出现口鼻出血时，停止给药。 1．1．4 肝脏标本取材 大鼠进行苯巴比妥麻醉， 0．15 g／ml，打开腹腔，观察肝脏的外观变化，并拍 照。取肝脏标本，置于 10％甲醛溶液浸泡 24 h。 1．1．5 石蜡切片制备 按常规方法进行组织切片 组织石蜡块的制备：组织块经过脱水、透明和浸蜡过 程，组织中的水分被石蜡替代，并保持组织细胞的形 态结构不变。脱水一乙醇置换组织细胞中的水的过 程：所取组织从 50％乙醇、70％、85％、95％直至无水 乙醇的梯度脱水；透明一二甲苯置换酒精的过程：先 经纯酒精和二甲苯各半的混合液浸渍 1—2 h，再转 入纯二甲苯中浸渍；浸蜡一石蜡液体置换组织的浸蜡 过程：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的 等量混合液浸渍 1—2 h，再先后移入 2个熔化的石 蜡液中浸渍 3 h左右，组织中的水被石蜡置换。整 个浸蜡过程由机器自动完成。浸蜡后的组织材料块 放在装有蜡液的容器中，待蜡液表层凝固即迅速放 人冷水中冷却，即做成组织包埋蜡块。 1．1．6 切片制备及染色 石蜡切片机连续切片，将 完整的蜡片置于温水(45qC左右)中展平，捞至玻片 上铺正，滤纸吸除多余水分，置入45qC温箱中干燥， Chin J I丑1)Di 1，September，2ao7。Vl01 l1。No．9 得到石蜡切片。石蜡切片用二甲苯梯度脱蜡，再经 无水乙醇直至蒸馏水浸泡，得到水化组织切片，进行 HE及网状纤维染色。 1．2 病理学检测 每隔 7天解剖 2只大鼠，取肝脏组织，切成 1．5 cm见方的体积，做肝脏的石蜡切片，HE染色和网状 纤维染色相结合。苏木素一伊红(HE)染色观察肝小 叶细胞变化和纤维化进展，网状纤维染色观察肝脏 纤维化的进展，观察肝脏超微结构的变化规律。 1．3 肝功能指标的检测 由中山大学附属三院的 生化检验科完成。在检测肝功能和纤维化的指标 时，用毛细针取眼血 1—2 ml，医院病理科送检。具 体检测指标如下： ①反映肝纤维化 4项指标：血清透明质 酸 (HA)，层粘连蛋白(LN)，Ⅲ型前胶原(PCⅢ)，Ⅳ型 胶原(Ⅳ一C)。 ②反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标：总蛋白 TPR0T( L)，白蛋白ALB( L)，球蛋白GLB(g／L)。 ③肝细胞受损的指标：谷草转氨酶 AST(U／L)， 谷丙转氨酶 ALT(U／L)，胆碱脂酶 CHE(U／L)。 ④反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的指标：总 胆红素 YBIH(tmaol／L)，直接胆红素 DBILI(pmol／L)， 间接胆红素 IBIH(tmaol／L)，总胆汁酸 TBA(pmol／L)。 ⑤胆汁淤积指示酶(包括同工酶)有帮助的酶指 标：古氨酰转肽酶 cGT(U／L)，碱性磷酸酶ALP(U／L)。 数据处理：各项指标的检测都用 检验，检验 水准设为 0．05。 2 结果 2．1 肝纤维化模型的建立 图中可见，肝硬化大鼠的肝脏呈现颗粒样改变， 为肝硬化结节的表现。此时的肝脏已经有大量腹 水，为终末期肝硬化(见图 1)。 图1 肝硬化大鼠的解剖和病理图片，图片为放大200倍 维普资讯 http://www.cqvip.com 2Oo7年9月 第 11卷 第 9 2．2 肝纤维化 4项指标 在这4项指标中，只有 HA的比较有显著性差 异；其他3个组别的比较都没有显著性区别(表 1)。 表 1 纤维化 4项指标 Ttest，n=5，P<0．05 2．2．1 反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标 结果表明，对于 ALB和 GLB，正常组和肝硬化 组的有显著性差异(表 2)。 表2 肝细胞蛋白合成代谢功能比较 Ttest，7t=5，P<0．05 2．2．2 反映肝细胞有无受损及严重程度的指标 结果表明，对于 AST，正常组明显低于肝硬化 组；对于ALT和 CHE，则正常组明显低于肝硬化组 (表 3)。 表3 肝细胞受损程度的比较 Ttest，n=5，P<0．05 2．2．3 反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的指标 结果表明，对于肝硬化组，除了DBILI外，所有 的肝功指标都明显高于正常组。而对于 DBILI而 言，则正常组高于肝硬化组(表4)。 表4 肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的比较 Ttest，n=5，P<0．05 2．2．4 对诊断胆汁淤积指示酶(包括同工酶)有帮 助的酶指标 一 1 139 一 结果表明，肝硬化组比正常组的 GGT明显增 高，而ALP显著降低，P值小于0．001(表5)。 表 5 胆汁淤积指示酶的比较 Ttest，n=5，P<0．05 3 讨论 肝纤维化的过程，使肝细胞和胆管上皮细胞的进行性破 坏，肝脏细胞呈代偿性增生，同时伴随着纤维组织过度增生 的复杂过程。临床上常用的肝纤维化4项检测指标可以基 本上反映出纤维化程度的变化。HA为结缔组织细胞体基质 和要成分，由间质细胞合成，主要由肝内皮细胞摄取分解，少 量小分子亦由肾小球滤过。当肝，肾功能受损时，血清 HA 升高，且随病变加剧而呈升高趋势。血清HA 检测能较好地 反映肝纤维化的发展与转归；LN也称为板层索，属结构性糖 蛋白，存在于肝内胆管，血管和淋巴管的基底膜的透明层中， 与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关；血清 I2,1水平 常与Ⅳ．C、HA 等相平行，在肝纤维尤其门脉高压诊断方面有 重要价值；Ili型前胶原(PcIli)是Ⅲ型胶原前体，反映肝内Ⅲ 型胶原合成，血清PClII含量与肝纤维化病变程度密切相关， 反映出肝纤维合成情况，肝硬化晚期(失代偿期)，血 PcIli含 量可有下降。血清1V．C为构成基底膜主要成份，反映基底 膜胶原的更新率 ，含量增高可较灵敏反映出肝纤过程 ，是肝 纤的早期标志之一。本试验中的肝纤维化四项检测指标中， 正常与纤维化的大鼠的血清 12N水平没有显著区别，目前还 不能够解释。在以后的工作中需要扩大样本量进一步对此 进行研究。 随着肝纤维化进程的发展，肝细胞的血供逐渐减少，肝 细胞的代偿性增生减少，同时肝血窦的disse道内纤维化程 度逐渐加重，肝脏功能不断下降，最终导致肝脏功能失代偿， 肝脏合成蛋白能力下降，白昼化可明显下降低，出次。本研 究中，肝硬化组的血清球蛋白量比正常组有显著增高，表明 肝硬化大鼠体内的体液免疫反应程度增强。因此，总蛋白的 差异不显著是符合以上的分析结果的。 在肝脏损害过程中，肝细胞的变性坏死导致肝细胞内容 物的溢出，通过检测肝细胞内的酶对肝细胞的损害程度进行 评价。目前常用的指标有谷丙转氨酶ALT(GPT)、谷草转氨 酶 ASr(G0T)胆碱酯酶(CHE)等。以上各项酶在肝细胞中均 有存在，当肝细胞膜受损或细胞坏死时，这些酶进入血清便 增多。通过测定血清或血浆中酶的活性，即可反映肝细胞受 损情况及损伤程度。 从病理组织学分析，肝脏纤维组织异常增生是机体的一 种自我保护机制，即将不同程度变性坏死的肝实质进行分 隔，一方面可以阻断肝细胞毒性物质(病毒或细菌)的进一步 侵袭，另一方面可以保护功能相对较好的肝组织的功能。肝 脏纤维细胞增生的同时，变性坏损区域的肝脏细胞也异常增 维普资讯 http://www.cqvip.com · -- — — 1140 ·--—— 生。如果肝脏毒物的侵害进程停止，例如肝损害药物的停 用，则肝脏细胞会产生胶原酶，溶解纤维组织【5-7]。 肝脏损害导致肝脏星形细胞可同时分化为肝脏细胞和纤 维细胞，是导致肝脏细胞和纤维细胞增生的重要原因 ]。肝 细胞增生使得正常的毛细胆管通路异常或消失，同时肝脏毒 性物质也使胆管上皮细胞受损，而发生胆道狭窄。这些胆道 异常的特征造成纤维化肝脏出现胆汁淤积。本研究中检测的 两个胆汁淤积指示酶，在肝内胆管上皮层的浓度较高。当上 皮层受损及胆管内压力增高时，便有这些酶增多进入血清中。 作者简介：单鸿，放射医学教授，从事介入放射学和分子影像 学研究。 参考文献： [1]FaustoN．Liver regeneration．2000，LHepatol，32(1Supp1)：19—31． [2]FaustoN． vex regeneration．LHepatol，2OOO，32：19—31． 文章编号：1007—4287(20Cr7)09—1140—03 Chin J Lab 1Na期，September，2OO7，Vol 11，No．9 l3]Brant EM．Grading and staging the histopathological lesion ofchronic hep= afitis：The Knodell histology activi~index and beyond[J]．Hepatiology， 2OOO。31：241． 14 JGaudio E，o|1 P，Pannarale L，et 81．Hepatic microeireulation and p ． biliary p]eXIIS in experimental biliary cirrhosis：A morphological study[J]． Gastroenterology，1996，111：11l8， [5]Bonis PA，Friedman SL，Kaplan MN．Is liver fibrosis reversible[J]?New En J Med，2001，344：488． ‘ [6]arthur MJ．FibmgenesisⅡMetallopmteinases and their inhibitors in liver cirdaosis[J]．Am J Physiol，2OOO，279：G 245． [7]L／ndquist JN，MarzluffWF，St'efanovic B，d a1．Ⅲ．Posttnmscriptional reg- ulation of type collagen[J J．Am J Physlol，2000，279：G 471． 18 JBritton RS，Bacon BR．Intracellular signaling pathwaysin stellate cell ac- tivation[J]．Alcohol Clin Exp Res，1999，23：922—925． (收稿日期：2007—06—14) 间充质干细胞移植对大鼠脑缺血区 GDNF 钱佳利 ，徐忠信 ，常 颖 ，莽 靖 ，王晓明 ，李昕华 ，郭 丽。 (1．长春中医药大学 生理教研室，吉林 长春 130031；2．吉林大学中日联谊医院神经内科； 3．吉林大学公共卫生学院 毒理学教研室) 摘要：目的 观察骨髓问充质干细胞移植对大鼠大脑中动脉栓塞后神经功能的影响及 GDNF的表达。方法 采 用线栓法大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，颈内动脉移植 MSCs，Bederson神经功能评分观察大鼠神经功能，免疫组织 化学和原位杂交技术检测 GDNF表达。结果 MSCs移植可显著提高大鼠局灶性脑缺血后神经功能，缺血周边区 GDNF蛋白及mRNA表达水平均高于对照组。结论 MSCs移植可促进神经功能恢复，可能通过增加 GDNF的表达起 到脑保护作用。 关键词：间充质干细胞；脑缺血；胶质细胞源性神经营养因子 中图分类号 ：11743．3 文献标识码：A Effect oftransplantation ofmesenchymal stem cellstoGDNF after cerebralischemiain rats QL4NJia-li ，XUZhong-xin”， CHANG玢 ，et ．(1．Changchun Universit)’ofTraditional ChineseMedicine，Changchzm 130031，China；2．Department ofNeurol· ogy China-Japan Union Hospital，Jilin University；3．Department ofToxicology，School 0厂Public Health，Jilin University) Abstract：Objective To observe the neurological functional recovery after transplanting mesencbymal stem cells(MSCs)to mts with middle cerebral artery occlusion(MCAO)，and detect the expression of GDNF．Methods MCAO model was establlsbed with Sll- ture emboli method ，measLu~functional outcome t}l Bederson neurologicat sevefit)，score．MSCs were transfered into mts through arte． ria carofis internal 24 hours after MCAO，detect expression of GDNF protein and mRNA by immunohistochemi eal and in situ hybridiza— tion method．Results MSCs transplantation could significantly improve the rats neurological functional recovery after MCAO．The ex- pression of GDNFmRNA and protein is higher dmrt the control group．Conclusion MSCs can significantly improve neurological reco~一 ery after MCAO in rats and protect the brain by increased GDNF expression． Key words：Mesenchymal stem cells；Cerebral ischem／a；Glial cell fine de ed neurotrophie factor 基金项目：吉林省科技厅自然科学基金资助项 目(20030536-5) *通讯作者 (Chin．， D ，20O7，11：1140) 影 维普资讯 http://www.cqvip.com