九制大黄炮制过程中多糖和鞣质的含量变化研究

1 成都中医药大学中药专业 93 级实习生。 九制大黄炮制过程中多糖和鞣质的含量变化研究 成都中医药大学 (610075) 　胡昌江 　谢秀琼 　马 　烈 　严 　冬1 　陈海琼1 中国医药研究开发中心 (102206) 　禹玉洪 摘要 　就一制～九制大黄炮制过程中多糖和鞣质的含量进行了测定。结果明 ,一制～九制大黄 与生大黄相比多糖含量呈上升趋势 ,而鞣质含量呈下降趋势 ,经统计学处理 ,有极显著性差异 ( P < 0. 01) ,六制大黄多糖和鞣质的含量与九制大黄相比 ,无显著性差异 ,就大黄多糖和鞣质而言 ,九制 大黄与六制大黄相当。 关键词 　九制大黄 　多糖 　鞣质 　含量测定 Content Changes of Polysaccharide and Tannin of Nine2fold Processed Radix et Rhizoma Rhei during Its Preparing Processed HU Changjiang , YU Yuhong , et al Chengdu U niversity of TCM , Chengdu , 610075 , Chi na Chi nese Medical Research & Development Cent re , Changpi ng County 102206 , Chi na Abstract 　The polysaccharide and tennin contents of one to nine2fold processed Radix et Rhizoma Rhei during processes were determined , respectively. As a result , the polysaccharide content re2 vealed an ascending tendency but tennin content showed a decreasing tendency from crude herb , one2fold processed product to nine2fold processed product . There was a significantly statistic dif2 ference among them ( P < 0. 01) . The comparison study suggested that no significant differences in polysaccharide and tennin contents would be observed between six2fold and nine2fold processed products. As far as polysaccharide and tennin contents of Radix et Rhizoma Rhei , nine2fold pro2 cessed product and six2fold processed product were equivalent . Key words 　nine2fold processed Radix et Rhizoma Rhei , polysaccharide , tennin , content determi2 nation 　　大黄系常用中药之一 ,在中医临床上常 炮制为多种饮片规格入药 ,拓宽了用药范围 , 也体现了中医辩证用药的特色和优势。古代 对大黄的炮制论述甚多 ,仅熟大黄就有 12 种 之多。明·《鲁府禁方》中有“用酒拌九蒸九晒 为末”和明·《寿世保元》中有“酒蒸九次极黑” 的记载。九蒸九晒大黄俗称九制大黄 [1 ] 。 大黄经九蒸九晒后 ,泻下作用缓和 ,具有缓泻 而不伤气 ,逐瘀而不损正的特点 ,倍受历代医 家推崇和肯定 ,特别适合于老人、小孩及体质 虚弱患者使用。 大黄所含化学成分复杂 ,到目前为止 ,已 发现 136 种以上 ,但主要是蒽醌衍生物、多糖 和鞣质三大类有效成分[2 ] 。采用硫酸 - 蒽 酮法测定多糖含量 ,采用药典法测定鞣质含 量 ,拟从多糖和鞣质的含量随蒸晒次数的变 504中成药 　Chinese Traditional Patent Medicine 1999 ,21( 8) 化规律来探讨九制大黄的炮制机理 ,寻找九 制大黄较佳的蒸晒次数和工艺条件 ,为确定 九制大黄的质量标准提供依据。 1 　样品制备 1. 1 　大黄 　掌叶大黄 ( Rheum pal m at um L . )的根茎 ,采自四川省理县米亚罗 ,经本校 中药鉴定教研室贾敏如教授鉴定。 1. 2 　一制～九制大黄样品的制备 　取生大 黄片加 10 %的黄酒与适量水 ,拌匀 ,闷透过 夜 (约 18h) 。于次日常压下蒸 2h ,取出 ,晒至 七八成干时 ,把药汁拌入 ,晒干。如此反复九 次即得。在每蒸晒一次过程中都留下 1 份样 品 ,分别定名为一制大黄、二制大黄、⋯⋯、九 制大黄[3 ] 。 2 　仪器与试剂 751 GW 型分光光度计 (上海分析仪器 厂) ; 　试剂均为分析纯。 3 　大黄多糖的含量测定 3. 1 　水提取工艺考察 　称取九制大黄的干 燥细粉 1. 5g (过 60 目筛) ,加 175ml 甲醇冷 浸 24h (除去蒽醌衍生物) 。过滤 ,残渣挥干 甲醇 ,用蒸馏水热提。经正交试验考察 ,以粗 多糖收率为指标选用正交表 L9 (34 ) 安排试 验。确定最佳水提条件为 :加 15 倍量蒸馏 水 ,热提取 3 次 ,每次 30min。 3. 2 　粗多糖和总多糖提取精制 　将水提液 浓缩至 12ml 左右 ,加 95 %乙醇至含醇量达 80 % ,冰箱中静置过夜。滤过 ,沉淀分别用无 水乙醇、丙醇各 15ml 洗涤 3 次 ,干燥 ,得粗多 糖。精确称取一定量粗多糖 ,加 15 倍量蒸馏 水溶解 ,每 0. 1g 粗多糖加0. 5ml 1 %鞣酸试 液 ,摇匀。冰箱静置过夜 ,滤过 ,滤液用 5 % NaOH 调 p H8 ,加入适量活性炭脱色。滤过 , 滤液加入 95 %乙醇至含醇量达 80 %。同前 , 再用无水乙醇、丙酮精制 1 次 ,干燥 ,得灰白 色精多糖[4 ,5 ] ,称为总多糖。 3. 3 　大黄多糖定性鉴别 　Fehling 试剂反应 呈阳性 ,因而含有多糖[6 ] 。文献[7 ]证明 此法所得多糖不含蛋白质、核酸和蒽醌衍生 物。 3. 4 　葡萄糖标准曲线的制备[8 ] 　精密称取 105°C干燥至恒重的葡萄糖对照品 50mg ,置 500ml 量瓶中 ,加蒸馏水溶解并稀释至刻度 , 摇匀。精密称取上述 0. 1mg/ ml 的葡萄糖对 照液 0. 30 ,0. 40 ,0. 50 ,0. 60 ,0. 70 ,0. 80ml , 分别置于 5ml 量瓶中 , 补加蒸馏水至 0. 80ml ,再加 0. 2 %蒽酮试液4. 20 ml ,摇匀 ,放 至室温。以 0. 80ml 蒸馏水加4. 20ml 0. 2 % 蒽酮试液为空白 ,在 625nm 波长处测定吸收 度 A 值 ,见表 1。 表 1 　 葡萄糖浓度与吸收度 A对应表 加入体积 V (ml) 0. 30 0. 40 0. 50 0. 60 0. 70 0. 80 浓度 C (mg/ ml) 0. 006 0. 008 0. 010 0. 012 0. 014 0. 016 吸收度 A 0. 302 0. 400 0. 491 0. 588 0. 686 0. 774 　　回归方程为 :A = 0. 01924 + 47. 35714C (r = 0. 9999) ,表明葡萄糖浓度在 0. 006～ 0. 016mg/ ml 范围内线性关系良好。 3. 5 　加样回收率 　精密称取已知含量的大 黄总多糖样品 ,加入一定量的葡萄糖对照品 , 按样品含量测定项下操作 ,测定吸收度 ,计算 回收率。结果见表 2。表明本法具有较好的 加样回收率。 表 2 　 加样回收率 试验号 取样量 (mg) 添加葡萄糖量 (mg) 测定总糖量 (mg) 回收率 …x ±SD ( %) RSD( %) 1 0. 2083 0. 2500 0. 4677 103. 76 2 0. 2484 0. 2500 0. 4942 98. 32 3 0. 2519 0. 2000 0. 4470 97. 55 100. 42 ±2. 55 2. 54 4 0. 2112 0. 2000 0. 4124 100. 60 5 0. 1885 0. 1500 0. 3413 101. 87 3. 6 　样品 (不水解) 中单糖的含量测定 　硫 酸 - 蒽酮法测定的是总糖含量 ,现用无水乙 醇代替浓硫酸配制蒽酮试液 ,同法测定生大 黄、五制大黄、九制大黄 3 批样品中单糖含 604 中成药 　Chinese Traditional Patent Medicine 1999 ,21( 8) 量 ,见表 3。 表 3 　 样品中单糖含量结果( n = 3 %) 样品 生大黄…χ±SD 五制大黄…χ±SD 九制大黄…χ±SD 单糖含量 0. 051 ±0. 001 0. 063 ±0. 001 0. 118 ±0. 004 单糖含量 总糖含量 1. 199 ±0. 021 0. 653 ±0. 016 1. 110 ±0. 034 　　由表 3 可知 ,单糖含量均小于 0. 2 % ,单 糖占总糖的比例小于 1. 200 % ,说明在除杂 过程中 ,单糖基本被除尽 (因单糖可溶于甲醇 或含水乙醇) 。因而在测定中 ,单糖可忽略不 计 ,即把测定的总糖含量作为总多糖含量。 表 4 　大黄样品多糖和鞣质含量测定结果 ( n = 3) 样品 多糖含量 ( %)ŠX ŠX ±SD 鞣质含量 ( %)Y Y ±SD 生大 黄 (X0) 4. 306 13. 890 4. 030 4. 254 ±0. 203 14. 035 14. 198 ±0. 414 4. 426 14. 668 一制 大黄 (X1) 7. 260 10. 430 6. 295 7. 015 ±0. 634 10. 435 10. 675 ±0. 419 7. 490 11. 159 二制 大黄 (X2) 7. 743 8. 140 7. 896 8. 248 ±0. 747 9. 153 8. 698 ±0. 514 9. 106 8. 802 三制 大黄 (X3) 8. 413 7. 510 8. 141 8. 500 ±0. 409 9. 045 8. 318 ±0. 770 8. 946 8. 400 四制 大黄 (X4) 8. 649 6. 785 9. 223 9. 428 ±0. 900 7. 292 7. 146 ±0. 315 10. 413 7. 362 五制 大黄 (X5) 8. 700 6. 251 9. 885 9. 645 ±0. 850 6. 685 6. 620 ±0. 341 10. 349 6. 923 六制 大黄 (X6) 8. 902 5. 189 9. 995 9. 768 ±0. 778 5. 450 5. 580 ±0. 469 10. 408 6. 100 七制 大黄 (X7) 9. 066 5. 125 10. 053 9. 820 ±0. 699 5. 447 5. 540 ±0. 468 10. 342 6. 047 八制 大黄 (X8) 9. 283 4. 810 10. 293 9. 999 ±0. 623 5. 232 5. 225 ±0. 412 10. 420 5. 633 九制 大黄 (X9) 10. 636 3. 875 10. 542 10. 635 ±0. 093 4. 390 4. 408 ±0. 543 10. 727 4. 960 3. 7 　样品多糖含量测定结果 　将生大黄及 一～九制大黄经水提、除杂、精制、干燥 ,得总 多糖 ,再精密称取总多糖 20mg 置 100ml 量 瓶中 ,加蒸馏水溶解 ,定容 ,摇匀。精密称取 1ml 置 5ml 量瓶中 ,余下按标准曲线绘制项 下操作 ,测定吸收度 ,计算多糖含量 ,见表 4。 3. 8 　样品多糖含量数理统计 　见表 5。 表 5 　生大黄及一制～九制大黄多糖含量方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 值 组间 SSA = 96. 276 9 10. 691 组内 SSe = 10. 500 20 0. 525 总和 SS = 106. 776 29 20. 375 　　F0. 01 (9 ,20) = 3. 46 ; P < 0. 01。 　　由表 5 可知 ,蒸晒次数对大黄多糖含量 极显著性差异 ( P < 0. 01) 。为进一步比较因 素间的差异 ,作单因素两两间多重比较的 q 检验。结果表明 ,生大黄与一制～九制大黄 间多糖含量有极显著性差异 ,且一制与四制 ～九制 ,二制～三制与九制间有显著性差异 ( P < 0. 05) ,而四制～九制间无明显差异 ( P > 0. 05) 。因此若以多糖含量为指标 ,则九制 大黄与四制大黄相当 ,即以多糖含量而言 ,九 制大黄只需蒸晒 4 次即可。 4 　大黄鞣质含量测定 鞣质是大黄中含量较多的成分之一 ,其 含量约为 10 %～30 % ,鞣质为一复杂的多元 酚类化合物 ,长时间高温加热不稳定 ,易降 解 ,因而有必要对九制大黄炮制过程中鞣质 含量进行研究。 4. 1 　测定方法 　采用药典法[9 ] 。 4. 2 测定结果 　见表 4。 4. 3 　鞣质含量数理统计 　见表 6。 表 6 　生大黄及一制～九制大黄鞣质含量方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F 值 组间 SSA = 240. 020 9 26. 669 组内 SSe = 6. 711 20 0. 336 总和 SS = 246. 731 29 79. 372 　　F0. 01 (9 ,20) = 3. 46 ; P < 0. 01。 　　由表 6 可知 ,蒸晒次数对大黄鞣质含量 有显著性差异 ( P < 0. 01) 。为进一步比较因 素间的差异 ,作单因素两两间多重比较的 q 检验。结果表明 ,生大黄与一制～九制大黄 在鞣质含量上有极显著性差异。且一制～五 制与九制间有显著性差异 ( P < 0. 05) ,而六 704中成药 　Chinese Traditional Patent Medicine 1999 ,21( 8) 制～九制间无显著性差异 ( P > 0. 05) 。以鞣 质含量为指标 ,九制大黄与六制大黄相当 ,即 以鞣质含量而言 ,九制大黄只需蒸晒 6 次即 可。 5 　小结与讨论 大黄总多糖的提取工艺进行优化。采用甲醇 冷浸法以除去蒽醌衍生物 ,对多糖提取条件 进行了正交试验 ,确定了较佳的提取工艺 ,总 多糖收率较文献[4 ]有所提高。 一制～九制大黄随着蒸晒次数的增加 , 多糖含量逐渐升高 ,且与生大黄有极显著性 差异。在炮制过程中 ,一制～三制间多糖含 量上升幅度较大 ,而四～九制间上升幅度较 小 ,且六制～九制间波动极小。 结果表明 ,生大黄与一制～九制大黄间 鞣质含量都有极显著性差异 ,且随着蒸晒次 数的增加 ,鞣质含量呈持续性下降趋势 ,且九 制大黄鞣质含量约为生大黄的 1/ 3。一制～ 五制间鞣质含量下降幅度较大 ,而六制～九 制间下降幅度极小。综合蒽醌衍生物 (另文 发表) 、多糖、鞣质含量的统计结果 ,认为九制 大黄与六制大黄相当 ,即九制大黄只须蒸晒 6 次即可。 参 考 文 献 1 　禹玉洪. 时珍国药研究 ,1998 ;9 (3) :260 2 　楼之岑. 北京医科大学学报 ,1993 ;25 (增刊) :1 3 　何民 ,等. 中成药 ,1992 ;14 (12) :19 4 　张思巨 ,等. 中国中药杂志 ,1993 ;18 (11) :679 5 　李满飞 ,等. 中草药 ,1990 ;21 (10) :10 6 　中国科学院上海药物研究所编. 中草药成分提取与分离 (第二版) ,上海科学技术出版社. 1983 ;13 7 　姚文兵 ,等. 生物化学与生物物理学报 ,1991 ;23 (6) :482 8 　邹桂欣 ,等. 中成药 ,1995 ;17 (8) :19 9 　药典委员会编. 中华人民共和国药典 ,一部 ,1995 ,附录 , XXB61 (收稿日期 :1998 年 3 月) 高效液相色谱法分析黄连炮制品中 盐酸小檗碱的含量变化 佛山职工医学院 (528000) 　吴剑峰 　李海燕 　杨安平 佛山制药二厂 　吴智南 摘要 　采用高效液色谱法对黄连及其不同炮制品中盐酸小檗碱含量进行了测试。结果表明 ,生黄 连、酒黄连、姜黄连、萸黄连的盐酸小檗碱含量分别为 5. 67 % ,5. 86 % ,5. 72 % ,5. 67 %。此法的精 密度和回收率均达到定量分析标准。 关键词 　高效液相色谱法 　黄连炮制品 　盐酸小檗碱 　　黄连为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franceh ,三角叶黄连 Coptis deltoidea C. Y. cheng et Hsiao 或云连 Coptis teete wall. 的干 燥根茎。临床上常用饮片规格为生黄连、酒 黄连、姜黄连、萸黄连。黄连及其炮制品中小 檗碱的含量测定目前仅见薄层扫描法测定的 报道[1 ] 。此法测定过程繁琐 ,人为因素大 , 准确性差。因此采用高效液相色谱法对生黄 连、酒黄连、姜黄连、萸黄连中的盐酸小檗碱 进行含量测定 ,以探讨经典炮制方法对盐酸 小檗碱含量的影响。该方法分析速度快 ,进 样量少 ,准确度高 ,灵敏度高[2 ] ,优于薄层扫 描法。 1 　仪器与试药 黄连购于佛山市医药公司。经佛山市药 品检验所霍永昌副主任药师鉴定为黄连 Coptis chienesis Franch 的干燥根茎。其炮制 品按《中国药典》1995 年版规定制法自行炮 804 中成药 　Chinese Traditional Patent Medicine 1999 ,21( 8)