定向诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

CHINESEJOURNALOFCLINICALANATOMYVOL.25NO.52007 【收稿日期】2006-11-26 【基金项目】大理学院科研基金资助课（2004×12） 【作者简介】张本斯(1969-)，女，云南大理人，硕士，副教授，主要从 事干细胞研究，Tel:(0872)2257147，E-mail:ben-si-zhang@163.com 定向诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化 张本斯 1, 李正金 2, 邹汝荣 1, 王 凡 3, 李瑞祥 3 (1.大理学院基础医学院人体解剖学教研室,大理 671000; 2.大理学院附属医院病理科,大理 671000; 3.四川大学基础医学与法医学院人体解剖学教研室,成都 610041) 【摘要】目的:采用骨髓间充质干细胞体外转化为心肌样细胞,为心衰的干细胞移植治疗提供基础。方 法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,5-氮杂胞苷诱导 24h后正常培养,通过形态学、PAS反应、磷钨酸 苏木素染色(PTAH)、免疫细胞化学染色作鉴定。结果:诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,单 个核、卵圆形、居中,似心肌细胞,PAS及 PTAH染色均为阳性。诱导后培养 2周的细胞表达 Sarcomeric Actin和Connexin-43较弱,以后表达逐渐增强,而且1、3、5代细胞均稳定表达。结论:骨髓MSCs可在体 外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料。 【关键词】间充质干细胞; 心肌细胞; 分化; 5-氮杂胞苷 【中图分类号】Q813.5 【文献标识码】A 【文章编号】1001-165X(2007)05-0550-03 Inductionanddifferentiationofratmarrow-derivedmesenchymalstemcellsintocadiocytesinvitro ZHANGBen-si,LIZheng-jin,ZOURu-rong,etal. DepartmentofAnatomy,FacultyofPreclinicalMedicine,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China 【Abstract】Objective:Todifferentiateratmarrow-derivedmesenchymalstemcells(MSCs)tocadiocytes invitroviatheinductionof5-azacytidineandprovidefoundationforservingMSCsasanewstemcellsourceto treatheartfailure.Methods:RatMSCswereisolatedandcultured.Afterinducedwith5-azacytidinefor24 hoursandthennormalcultured,cellswereidentifiedbymorphology,periodic-acid-schiffreaction(PAS), phosphotungsticacidhematoxylin(PTAH)andimmunocytochemistry.Results:MostMSCsinducedgradually becamespindle-likeandpillar-formwithovalnucleilyinginthecenterofcellsandsimilartocadiocytes,and beingofpositivereactioninPASandPTAH.Inaddition,morethan2weeksofcultivation,positivestainingof SarcomericActinandConnexin-43wereobservedonthosecells,andthesameexpressionswereonP1,P3and P5cells.Conclusions:MSCscanbeinducedintocadiocytesby5-azacytidineinvitro,whichsuggeststhatit mightbeidealdonorcellsinstemcelltransplantationforheartfailuretherapy. 【Keys】mesenchymalstemcells; cadiocyte;differentiation;5-azacytidine 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 (mesenchymalstemcells, MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞,在一定条件 下能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等转 化[1],将 MSCs培养诱导为上述目的细胞,进行相应组 织器官修复有着非常诱人的临床应用前景,故 MSCs 是近年倍受瞩目的组织工程种子细胞。一般认为,出生 后心肌细胞不能再生,损伤后由疤痕替代,导致心肌收 缩紊乱,最后发展为充血性心衰。Wakitani[2]首先报道 MSCs能在一定的条件下向肌细胞转化,使肌修复成为 可能。以后Orlic等[3,4]也证实MSCs可分化成心肌样细 胞,为MSCs在心脏疾病的运用奠定了基础。本实验将 MSCs在5-氮杂胞苷诱导下转化为心肌样细胞,为损 伤心肌的干细胞移植治疗提供基础。 1 材料与方法 1.1 材料 Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),5-氮杂胞苷、胰蛋白 酶(Sigma),L-DMEM(GIBCO)。小鼠抗人、大鼠、兔 Sarcomeric Actin, 兔 抗 人 、 大 鼠 、 小 鼠 Connexin43( 博 士 德 ); HISTOSTAINTM-KIT免疫组化试剂盒(中山公司);SD大鼠(本 校动物中心)。 1.2 方法 1.2.1 骨髓 MSCs的分离培养 处死 6周龄 SD大鼠,冲出股骨 胫骨骨髓制成细胞悬液。洗涤1次(1000r/min,离心5min)。将悬 液加入预置等体积淋巴细胞分离液(比重 1.077g/ml)的离心管, 2000r/min,离心30min。收集云雾状白膜层的单个核细胞,洗涤 2次,L-DMEM(含 10%新生小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml 链霉素)重悬。1×105/ml接种,37℃、5%CO2孵箱培养,5d首次换 液,以后2~3d一次。待细胞接近融合,胰酶消化,1×104/ml传代, 并标记为 Passage1(P1)。细胞接近融合时,重复上述操作,反复 传代扩增,并标记为 P2~P5等。根据贴壁性能不同,每次换液弃 除悬浮生长的造血系细胞,每次传代用 0.25%胰酶(0.1ml/cm2)消 化2~3min,控制好酶的量和消化时间,将MSCs与可能混杂的淋 巴细胞、单核细胞分开,纯化MSCs。 1.2.2 骨髓 MSCs向心肌样细胞的诱导 以 1×104/ml接种传 代细胞于预置盖玻片的24孔板,第4d向诱导组加入5-氮杂胞 ·实验研究· 550· · 中国临床解剖学杂志 2007年第 25卷第 5期 表 1 对照组与诱导组细胞 SarcomericActin免疫 细胞化学染色结果平均灰度值(x±s,n=5) Tab.1 Mean density of immunocytochemical stainingofSarcomericActininbothofcontroland inducedgroups(Mean±SD,n=5) Group 1week 2weeks 3weeks 4week Controlcells 168.88±1.65168.35±1.21 168.62±1.61 168.56±0.85 Inducedcells167.83±2.12164.91±1.32*161.05±2.75*160.87±1.93* *P<0.05,vsControlgroup 表2 对照组与诱导组细胞 Connexin-43免疫细 胞化学染色结果平均灰度值(x±s,n=5) Tab.2 Meandensityofimmunocytochemical stainingofConnecxin-43inbothofcontroland inducedgroups(Mean±SD,n=5) Group 1week 2weeks 3weeks 4week Controlcells 168.36±1.71168.52±1.08 168.27±1.52 168.68±0.92 Inducedcells167.94±2.33164.72±1.12*161.21±2.45*161.02±2.25* *P<0.05,vsControlgroup 表3 不同代骨髓MSCs免疫细胞化学染色结果 的平均灰度值(x±s,n=5) Tab.3 Meandensityofimmunocytochemistrical analysisindifferentpassageofmarrow-derived MSCs(Mean±SD,n=5) Antigen Passage1 Passage3 Passage5 SarcomericActin 162.32±2.77 161.05±2.75 162.87±3.52 Connexin-43 160.98±2.76 161.21±2.45 161.15±2.81 *P<0.05,vsControlgroup 苷(终浓度为 10×10-6mol/L),诱导 24h后正常培养不同时间作 鉴定。 1.2.3 诱导后骨髓 MSCs的鉴定 (1)PAS反应:诱导后培养 4 周,取出细胞爬片,95%乙醇固定,过碘酸氧化,Schiff试剂浸染, 亚硫酸液冲洗,甲基绿复染。(2)PTAH染色:诱导后培养 4周取 出,95%乙醇固定,高锰酸钾氧化,草酸漂白,磷钨酸苏木素浸染。 (3)免疫细胞化学染色:① 诱导后培养不同时间 MSCs的免疫细 胞化学染色,于培养 1、2、3、4周取出细胞爬片,冷丙酮固定, Triton-X100破膜,过氧化氢处理,血清封闭,加一抗(Sarcomeric Actin、Connexin-43),37℃孵育 2h,加生物素化二抗,加碱磷酶标 记的链酶卵白素,碱磷酶的底物-色素混合液显色,同时用 PBS 作为一抗设置阴性对照。对染色结果作图像分析,测定平均灰度 值(IPP图像分析软件,USA)。② 诱导后不同代 MSCs的免疫细 胞化学染色,取诱导后培养 4周的 1、3、5代细胞按方法①作 SarcomericActin、Connexin-43的免疫细胞化学染色。 1.2.4 统计学处理 采用 SPSS软件,多均数比较用单因素方差 分析,两均数比较用t检验。 2 结果 2.1 倒置显微镜观察 培养 2d,细胞逐渐贴壁,5d首次换液,可见多个 细胞克隆。1周后,增殖迅速,约10~14d接近融合。传 代初期细胞呈球形,很快沉降贴壁,伸展为多角形,并 逐渐变成梭形、三角形,胞质丰富,核明显,呈卵圆形。 3~5d增殖迅速,约7d长满瓶底。造血系细胞因不贴 壁,随换液除去。严格控制酶的量和作用时间,传代所 用酶不能使紧贴瓶壁的淋巴细胞、单核细胞脱落,2次 传代后细胞达融合生长时,有更均匀有序的成纤维细 胞样分布。连续传 5代,形态无明显变化,传代周期 6~7d,说明MSCs得到了进一步纯化。5-氮杂胞苷作用 后,细胞增殖减慢,部分脱落死亡,存活细胞形态发生 改变,以梭形、柱形为主,部分细胞有分支,并逐渐互相 连接,核一个,卵圆形,居中,似心肌细胞形态。 2.2 PAS反应 诱导细胞胞浆呈红色,以核周围更明显(图 1),对 照组为阴性。 2.3 PTAH染色 诱导细胞胞浆呈紫蓝色,核呈深蓝色(图2)。对照 组为阴性。 2.4 免疫细胞化学鉴定 诱 导 后 培 养 3、4周 ,SarcomericActin及 Connexin-43为阳性,2周为弱阳性,阳性细胞胞浆呈蓝 色(图 3,4)。诱导后培养1周以及未诱导细胞为阴性。 阴性对照组未着色,说明各结果均有特异性。随诱导后 培养时间延长,平均灰度值逐渐减少(表1、2),其中 3、4周间的差异无统计学意义。对照组灰度值随时间变 化不大,也无一定规律。除1周外,2、3、4周两组平均灰 度值间的差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.5 诱导后不同代细胞的免疫细胞化学鉴定 3代细胞均表达 SarcomericActin和 Connexin-43, 平均灰度值高低不一,但差异无统计学意义(表3)。 3 讨论 3.1 骨髓MSCs向心肌样细胞的分化 本实验分离培养骨髓 MSCs,经 5-氮杂胞苷诱导 后正常培养,细胞形态发生明显改变,以梭形、柱形为 主,部分细胞有分支,并逐渐互相连接,单核,卵圆形, 居中,说明诱导细胞具有心肌细胞的形态特征。 SarcomericActin是构成肌原纤维中细肌丝的主要 蛋白,存在于心肌和骨骼肌,Connexin-43只存在于心 肌。心肌细胞间通过特定的缝隙连接偶联在一起,在电 反应中形成整体。这些缝隙连接就是Connexin-43的六 聚物,这是心肌细胞的特征。本研究表明经5-氮杂胞苷 诱导,骨髓MSCs已向心肌样细胞分化,而且细胞间已 有 Connexin-43连接,这对于细胞间信号传递,心肌功 能的保持非常重要。另外,诱导细胞PAS、PTAH反应均 为阳性,说明诱导细胞富含糖原和肌原纤维,这都是心 肌细胞的特点,进一步表明骨髓MSCs已向心肌样细胞 551· · CHINESEJOURNALOFCLINICALANATOMYVOL.25NO.52007 图 1 诱 导 后 培 养 4周 PAS反应 ×200 图 2 诱 导后培养 4周 PTAH染色 阳性 ×400 图 3 诱导后 培养 3周 SarcomericActin 免疫细胞化学染色阳性 × 400 图 4 诱导后培养 3 周 Connexin-43免疫细胞 化学染色阳性 ×400 Fig.1 Positivereactionof PAS in induced cells culturedfor4weeks.×200 Fig.2 Positiveexpression ofPTAH ininducedcells culturedfor4weeks.×400 Fig.3 Positiveexpression ofimmunocytochemistryfor SarcomericActinininduced cellsculturedfor3weeks.× 400 Fig.4 Positiveexpression ofimmunocytochemistryfor Cnnexin-43ininducedcells culturedfor3weeks.×400 分化。 1、3、5代细胞诱导后培养 3周,SarcomericActin 和Connexin-43均为阳性,三代细胞平均灰度值不同, 表明SarcomericActin和Connexin-43在不同代细胞的 表达有一定差异,但三代细胞间的差异无统计学意义, 说明本实验条件下,细胞稳定表达 SarcomericActin和 Connexin-43,稳定地向心肌样细胞分化。 3.2 5-氮杂胞苷促进MSCs向心肌样细胞分化的机制 5-氮杂胞苷是胞苷类似物,为DNA甲基转移酶抑 制剂,当其作用于 MSCs时能整合进入 DNA中,通过 抑制DNA甲基转移酶使DNA低甲基化,而DNA的甲 基化程度和基因调节密切相关[5]。MSCs具有多能干细 胞的特点,并含有完整的遗传物质,在一定条件下可能 表达不同体细胞特异性蛋白,分化为不同体细胞。 Boheler等[6]通过研究5-氮杂胞苷诱导小鼠胚胎细胞系 C3H10T1/2向肌细胞转化认为,其机制可能与激活肌 源性基因 MyoD1有关。本实验表明 5-氮杂胞苷诱导 24h后正常培养,细胞形态改变,表达心肌特异性蛋白 SarcomericActin和 Connexin-43,合成糖原和肌原纤 维,具有心肌细胞的特征。5-氮杂胞苷诱导MSCs心肌 化,可能是它和控制向心肌分化的特异启动子基因上 阻遏蛋白结合,使其去甲基化而发生构型改变,从而启 动细胞向心肌分化,使 MSCs转变成心肌细胞[7]。如果 能发现该启动子上的阻遏蛋白,选出高特异性的去阻 遏剂诱导干细胞,将会提高体外分化心肌细胞的效率, 为建立自体心肌细胞库提供可能。本研究还发现,5-氮 杂 胞 苷 对 MSCs的 持 续 诱 导 并 不 能 明 显 增 加 SarcomericActin和Connexin-43的表达,以终浓度10× 10-6mol/L5-氮杂胞苷诱导72h,部分细胞脱落死亡,提 示 5-氮 杂 胞 苷 对 MSCs的 SarcomericActin和 Connexin-43基因在转录后无明显的调控作用。 【参考文献】 [1]PittengerMF,MackayAM,SimonettiDW,etal.Multilineagepotential ofadulthumanmesenchymalstemcells[J].Science,1999,284(1135): 143-147. [2]WakitaniS,SaitoT,CaplanAI.Myogeniccellsderivedfromratbone marrowmesenchymalstemcellsexposedto5-azacytidine[J].Muscle Nerve,1995,18(12):1417-1426. [3]OrlicD,KajsturaJ,ChimentiS,etal.Bonemarrowcellsregenerate infractedmyocardium[J].Nature,2001,410(6829):701-705. [4]FukuharaS,TomitaS,YamashiroS,etal.Directcell-cellinteractionof cardiomyocytesiskeyforbonemarrowstromalcellstogointocardiac lineageinvitro[J].JThoracCardiovascSurg,2003,125(6):1470-1480. [5]SussinanM.Heartandbones[J].Nature,2002,410(6829):640-641. [6]BohelerKR,CzyzJ,TweedieD,etal.Differentiationofpluripotent embryonicstemcellsintocardiomyocytes[J].CircRes,2002,91(2): 189-201. [7]BittiraB,KuangJQ,Al-KhaldiA,etal.Invitropreprogrammingof marrowstromalcellsformyocardialregeneration [J].AnnThoracic Surg,2002,74(4):1154-1159. 552· ·