荧光免疫技术

免疫学基本常识：抗原、抗体及单克隆抗体 众所周知，人或动物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵袭，也有一些疾病可以通过机体 自身调控而自愈，这是因为机体内部存在一个免疫系统。免疫系统是由中枢免疫组织（骨髓、 胸腺、消化系统免疫组织）和外周淋巴组织（淋巴结和脾脏）的免疫活性细胞（B 淋巴细胞、 浆细胞），以及由它们产生的多种淋巴因子和抗体所组成。免疫系统对外来物质产生一系列 反应的过程称为免疫，而这种反应本身则称为免疫应答。能够在机体中引起特异性免疫应答 的物质称为抗原，免疫应答的结果则是刺激机体产生与抗原相对应的特异性抗体和引起细胞 免疫。 由于免疫应答同时取决于机体，而不仅是进入机体的物质，所以抗原的定义是相对的。由此， 按照免疫应答的效果可以将抗原分为完全抗原和半抗原：完全抗原是指能够直接诱导机体产 生特异性免疫应答的一类物质。完全抗原的分子量都大于 5000，其化学成分多为蛋白质或 脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖体，多肽，核酸等也都是完全抗原。半抗原能与抗体 特异性结合，但不能激发机体产生抗体，必须与蛋白质（载体）结合后进入机体，才能产生 有效的免疫应答。大分子的半抗原在体外能与对应的抗体结合发生可见反应（凝集、沉淀）， 小分子的半抗原能与对应抗体结合而不出现可见反应。此外，抗原还可以按照自身的物质属 性分为可溶性（毒素、异种蛋白）或颗粒性（细菌、细胞）抗原，或按临床意义分为外源性 和内源性抗原。 抗体是在抗原刺激下机体免疫应答的产物。所有抗体都具有与抗原特异性结合的能力。抗体 的化学本质是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不过只有当免疫球蛋白针对已知抗原时，才能够称 这种免疫球蛋白为抗体。免疫球蛋白属于结构牢固的分子物质，可以经受较大变化的环境作 用，诸如 56℃加温，在室温下较长时期的贮藏，短期高或低 pH 处理，甚至与去污剂或尿素 接触后仍保持其抗体活性。 抗体活性是指与抗原特异性结合的能力，即二者之间的特殊亲合力。两者非共价键结合，结 合的力包括氢键，静电力，范德华力和疏水结合力。抗体抗原之间的反应是可逆的，在适宜 的条件下仍可解离而性质不变。 机体内约有 1 亿种不同的 B 淋巴细胞，每个独立的 B 淋巴细胞只能接受一种抗原的刺激从 而形成分泌一种抗体的能力，因此特异性是免疫应答的特有标志。如常识所见，麻疹患者愈 后即获得对麻疹的终生免疫，而这并不形成对天花的免疫。抗体抗原特异性结合的本质是抗 原决定簇与抗体结合簇的专一适配性，抗原决定簇是指抗原分子上专有的化学基因，可以决 定其刺激机体所产生抗体的特异性。抗原决定簇与其相对应的抗体结合簇立体构型完全相适 应。一个抗原分子可带有多个不同的决定簇。抗原分子量愈大，决定簇数量愈多。决定簇数 目代表抗原分子的价。抗体结合簇是在抗体分子上与对应的抗原决定簇发生特异性结合的部 位，位于 Ig 分子的抗原结合分段（V 段）上，由重链和轻链的一部分可变区构成。其特异 性由氨基酸排列顺序决定，约包括 5～15 个氨基酸。每个单体免疫球蛋白分子如 IgG 有 2 个结合簇，IgA 是二聚体，有 4 个结合簇，IgM 是五聚体所以有 10 个结合簇。(但是，事情 并不是绝对的。一种抗体除与相对应的抗原发生特异性反应外，也有可能与化学结构部分相 似的其它抗原发生反应，这就是通常所说的交叉反应。交叉反应可能由于两种抗原有共同的 决定簇，或由于两者的抗原决定簇虽然不完全相同，但在立体化学结构上密切相关，导致一 种抗原能与另一种抗原的对应抗体结合。) 正常情况下，抗体与抗原在机体内结合后，可以被吞噬、排泄而将抗原清除。如果这种抗原 属于外源性致病抗原（细菌、病毒、毒素），可以由此达到杀灭或削弱抗原危害的目的。对 于内源性抗原，如已经衰退、损伤或突变的异常细胞，也能被及时排除，实现机体自身的免 疫调控。当然，在异常情况下，抗体抗原结合后形成的免疫复合物将损伤组织、细胞，引起 花粉过敏一类的变态反应或免疫性疾病等不良后果。 不过长期以来所谓特异性免疫血清抗体，不论是从人还是从动物获得的，也不论是主动获得 还是被动获得的，实际上都是有许多种具有不同特性的抗体所组成的混合抗体。这是因为， 进入机体的抗原往往带有若干个抗原决定簇。此外，不同个体对同一抗原决定簇的反应并不 相同，即使同一个体不同时间接受抗原刺激后产生的反应也不完全一致。由于人们无法将体 内已受抗原刺激的各种不同的 B 淋巴细胞克隆区分开，即使在体外能将它们分成单细胞， 也无法让其继续生长，增殖并分泌抗体。因此，用常规免疫方法制备的免疫血清抗体只能是 数目众多的单克隆抗体的混合物，现在，一般称其为多克隆抗体（PcAb）。这种多克隆抗体 存在特异性差、效价低、数量有限、动物间个体差异大，难以重复制备等固有缺陷，许多场 合下使用时难尽人意。 1975 年，英国剑桥大学分子生物学研究室的 Kohler 和 Milstein 合作发表了为“分泌预定 特异性抗体的融合细胞的持续培养”的著名论文（Nature,256:495,1975）。他们将已适应于体 外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B 淋巴细胞）进行融合，发现融合 形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速 增殖，又能持续地分泌特异性抗体，通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系，由此单克 隆系就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（McAb）。上述方法 创立了一项具有划时代意义的新技术－利用 B 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体。这一技术 的创立和迅速推广，为所有需要制备和使用抗体的研究领域提供了全新的手段和制剂，促进 了生命科学诸学科的发展。两位科学家也由于这一杰出贡献荣获 1984 年诺贝尔医学和生理 学奖。 黄曲霉毒素 B1 是一种二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，分子量为 312，属于半抗原，不能直 接诱导机体产生免疫应答。因此我们的工作首先是将黄曲霉毒素 B1 与载体蛋白连接，合成 为完全抗原，以后的研究则基本上采用了前述杂交瘤－单克隆抗体技术的经典方法：动物免 疫→免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合→细胞筛选→用有限稀释法分离出可分泌特异性抗体的 单个细胞，再经过克隆化培养建立杂交瘤细胞株并制备出大量单克隆抗体，从而在此基础上 最终建立了黄曲霉毒素 B1（AFB1）的免疫方法。 免疫荧光技术 一、一些基本概念和基本知识： 1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应 的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。 2.技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 3.荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发 光，这种光称为荧光。 这种物质，称为荧光素 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------化学发光技术 4.荧光素的荧光特性： ⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长<发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数 荧光效率=------------------------------- 吸收光的光量子数 ⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱 5.常见荧光素： ⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它 常见荧光素的特性： ⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。 ⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光 570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。 ⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收 550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。 ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE：吸收光 490~560nm，发射光 595nm，红色 荧光。 ⑹ 其它：酶作用后产生荧光物质。 酶作用后产生荧光物质： 酶 底物 产物 激发光 发射光 Β-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA 二聚体 317 414 6.合适荧光素的选择 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 荧光素-N=C NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H S H ⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。 ⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。 ⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性 ⑸ 标记方法简单、快速。 ⑹ 安全无毒 二、 荧光抗体的制备 1 荧光素与抗体结合（标记） 2 荧光抗体的纯化 3 荧光抗体的鉴定 1.荧光素与抗体结合方法： ⑴ 透析法： ①适用于蛋白质含量低、样品体积小的抗体溶液的标记 ②标记较均匀，非特异荧光较低 ⑵ 搅拌法： ①适用于蛋白质含量较高、样品体积较大的抗体溶液的标记 ②标记时间短、效率较高，荧光素用量节省 ③影响因素多，非特异荧光较强 **透析法 第一步： 将含 10mg/ml 的 Ig 溶液 10ml 装入透析袋。 第二步： 将上述透析袋放入烧杯中 ：含 0.1mg/ml FITC 的 pH=9.4 的碳酸盐缓冲液 100ml。 第三步： 4℃磁力搅拌 24h。 第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴定 生物秀—专心做生物！ www.bbioo.com 生物秀论坛-学术交流,资源共享,互助社区 www.bbioo.com/bbs/ **搅拌法 第一步： 将含 40mg/ml BP 溶液 5ml 装入反应瓶中。 第二步： 加入 pH=9.0、0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 4ml 第三步： 25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml 含 2mg 的 FITC 溶液 第四步： 25℃下搅拌 1h，4℃下继续搅拌 4h，然后进行纯化、鉴定 2. 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质 ***** (1)除去未结合荧光素： A 透析法： 将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约 10min，然后移入 pH=7.4 的磷 酸盐缓冲 液中，在 4℃下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。 B 凝胶过滤法： 葡聚糖凝胶 G25 或 G50，用 pH=7.4 的 0.01%PBS 溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然 后用上述 PBS 洗脱，取洗脱液加入 20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于 0.01ug/ml. (2)除去标记不适当的抗体： 采用 DEAE 纤维素离子柱。将 DEAE 纤维素用 pH=7.6 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液平衡装柱， 加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。 未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。 过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。 (3)除去非特异反应物质： 将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。 按 100mg 组织粉/ml 标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌 1h，静置 1h，离心取上清液，在用 50mg/ml 比例重复一次。 3. 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法 ⑵ 结合比率(F/P)测定： 分光光度法，并按下式计算： FITC: F/P=2.87×A495/(A280-0.35×A495) RB 和 TRITC: F/P= A515 / A280 * F/P 值高则抗体分子结合的荧光素多。 * 固定标本染色以 F/P=1.5 左右为宜 * 活细胞染色以 F/P=2.4 左右为宜 三.荧光抗体技术： ㈠抗原片的制作 ㈡试验类型 ㈢荧光显微镜检查 ㈠抗原片的制作 1 制作： *临床常见的标本有组织、细胞、细菌三大类。 *可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。 *细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。 2 标本的固定： ⑴ 固定目的 *防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。 *去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。 *易于保存。 *（但 CD、SIg 的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。 ⑵ 常用的固定方法： 抗原 固定剂 固定方法 蛋白质 95%乙醇 室温 3~10min 或 4℃30min Ig 类 甲醇 同上 酶类 丙酮 同上 激素 CCl4 同上 类脂质 10%福尔马林 室温 3~10min 多糖(细菌) 10%福尔马林 室温 3~10min 或 4℃30min 丙酮、甲醇 病毒 无水乙醇 室温 5~10min 或 4℃30~60min 丙酮、CCl4 或-20 ℃60min 以上 ㈡试验类型 1 直接法 2 间接法 3 补体结合法 三、其它免疫荧光技术 流式细胞仪 时间分辨免疫荧光技术 荧光偏振免疫技术 时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA) 基本原理： 利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成 复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可 测定荧光强度，从而推测待测物含量。 时间分辨荧光测定的特点： 1 采用脉冲光源(每秒闪烁 1000 次以上的氙灯), 照射样品后即暂短熄灭. 2 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧 光衰退后，再测镧系荧光。 3 镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时 间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰， 4 镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差 异(即较大的 Stokes 位移），有利于排除非特异性 荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有 Eu、Sm Tb、Nd 和 Dy 等，其中以 Eu 最为常用。 5 测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。 荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA） 是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度 与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术；技术类型主要采用竞争法。 荧光免疫技术 荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与 一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons 等于 1941 年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称 为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光 免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的 TDM 用试剂盒，有相当 一部分即属于此类，并且还有专供 TDM 荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。 由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年 来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。 有关荧光的基本知识 一、荧光现象 （一）荧光的产生 化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态 再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。 荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止 供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。 可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起 的称为化学荧光，由 X 线或阴极射线引起的分别称为 X 线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫 技术一般应用致荧光物质进行标记。 （二）荧光效率 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效 率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。 荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度） 发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。 各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸 收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接 近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。 （三）荧光的猝灭 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态 分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧 光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特 别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物 质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以 减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。 二、荧光物质 （一）荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并 能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有： 1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶 于水或酒精等溶剂。分子量为 389.4，最大吸收光波长为 490495nm，最大发射光波长 520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好， 在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏 感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2．四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。 性质稳定，可长期保存。结构式如下： 最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为 595～600nm，呈橘红色荧光。 3．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下： 最大吸引光波长为 550nm，最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光。与 FITC 的翠绿 色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效 率较低。 （二）其他荧光物质 1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强 荧光的物质。例如 4-甲基伞酮-β-D 半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成 4-甲基伞酮， 后者可发出荧光，激发光波长为 360nm，发射光波长为 450nm。其他如碱性酸酶的底物 4- 甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 2．镧系螯合物某些 3 价稀土镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合 物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以 Eu3 应用最广。Eu3 螯合物的激发光波长范围 宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 免疫标记法 （一） 荧光免疫法： 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光， 荧光强度与 Mb 浓度呈正比，可在 8min 内得出结果。结果以 Mb 每小时释放的速率表示(△ Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体， 然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物， 接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根 据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命 的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。 （二） 放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有 放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记 的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射 性强度与曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA 法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到 ng／ml 水平。但早期的方法操作 麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA 的灵敏度又有了较 大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 (三) 酶联免疫法(ELISA) ELISA 法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清 Mb 和微孔板上包被的 Mb 竞争 性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为 10μg／L，线性范围达 1 000ug／L。夹心 ELISA 法与 EIA 具有良好的相关性(r＝0.92)。ELISA 法具有灵敏度高，特 异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推 广普及。但不适合急诊的快速检测。 以双抗法为例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。 接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—抗体复合物。最后加入底物，由酶催化底物生成产物。 通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。 （四）偶联生物素—亲和素系统的酶免法 利用了一个亲和素分子可以与 4 个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的 灵敏度又有明显的放大作用。 （五）时间分辨荧光免疫分析 时间分辨荧光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析 技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测 量荧光，同时检测波长和时间两个进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极 大地提高了分析灵敏度。 ( 六 ) 解 离 增 强 镧 系 元 素 荧 光 免 疫 分 析 （ Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构 的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成 EU 标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度 非常弱，因此加入一种增强剂，使 Eu3 从复合物上解离下来，自由 Eu3 同增强剂中的另一 种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号 增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免 疫分析。 免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光 素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、 定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和 冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切 片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内 抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇， 同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行 IHC 染色时，需要先进行抗 原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液 是 pH6.0 的 0.01 mol/L 的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某 种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗 体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体的保存： 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如 储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸 附，隔离蛋白常用 0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在 4℃-8℃条件 下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20 ℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温 快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。 为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入 0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下 可保存 3-5 年。保存稀释后的单抗应加入 0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保 存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在 4℃下保存数月。 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴 离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理， 以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1． 灭菌的 ddH2O 1:10 稀释该多聚赖氨酸溶液。 2． 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温 18-26℃ 3． 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液 5 分钟。注意增加时间不会提高包被效果。 4．在 60℃烘箱 1 小时干燥，或室温 18-26℃过夜干燥待用。 [注意] 1． 每 100mL 已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片 40-90 张， 超过 90 张片子将影响其 黏合力。 2． 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含 1% HCl 的 70%乙醇溶液来清洗。 4． 释过的多聚赖氨酸溶液要放在 2-8℃，至少在 3 个月内是稳定的。 5． 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。 免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由 Coons 等（1950）建立， 经过近 43 年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化 学。它与亲合化学技术如葡萄球菌 A 蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA 等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机和扫描电视等技术结合发展为定量免疫荧 光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用使免疫荧光细胞化学技术发展到更 高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与与图像分析仪的结合使免 疫荧光组织化学的定量检测更加准确。在免疫荧光细胞化学中应用单克隆抗体日益增多，将 会不断提高特异性、敏感性和应用范围。激光扫描等聚集显微镜的应用又开创了新的发展时 代。 由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性， 在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学以及临床检验学等生物学和医学许多 方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。 第一节 免疫荧光细胞化学的原理 免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制 成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或 抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本， 荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或 组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或 检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。 用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组 织）化学技术。 免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。 一、直接法 1．检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗 体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧 光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。 2．检查抗体法 将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相 应抗体反应，而将抗体定位检测出来。 二、间接法 1．检查抗体法（夹心法） 此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用 此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗 体之间，故称夹心法。 2．检查抗体法 用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有 切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性 IgG 荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人 IgG 荧光抗体 等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自 身抗体和多种病原体抗体的重要手段。 3．检查抗原法双薄片 此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗 原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再 用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原） 结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多 于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合 3～5 个分子抗体，当此抗体作 为抗原时又可结合 3～5 分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强 3 至 4 倍。此 法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显 示。这是现在最广泛应用的技术。 三、补体法 1．直接检查组织内免疫复合物法 用抗补体 C3 等荧光抗体直接作用组织切片，与 其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物---抗补体荧光抗体复 合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组 织活检诊断等。 2．间接检查组织内抗原法 常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上， 经 37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗 体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光 抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。 四、双重免疫荧光标记法 在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直 接法，将两种荧光抗体（如抗 A 和抗 B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法 洗去未结合的荧光抗体，抗 A 抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗 B 抗体用 TMRITC 或 RB200 标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。 五、对照试验 为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时 进行以上对照试验： 1．直接法 需设下述对照试验 （1）标本自发荧光对照：标本只加 PBS 或不加 PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察 应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。 （2）抑制试验：可分为二步法和一步法。 ①二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明 显减弱的荧光。 ②一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为 阴性。此法效果较二步法好，并且简便。 （3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光。 如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。 2．间接法 （1）自发荧光对照：同上（一）。 （2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。 （3）抑制试验：同上。 （4）阳性对照：同上。 如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。 3．补体法 （1）自发荧光对照 （2）荧光抗体对照 （3）抑制试验 （4）补体对照：取新鲜豚鼠血清 1：10 稀释先作用标本，再用抗补体荧光抗体染色， 结果阴性。 （5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再用 1：10 稀释度的新鲜豚鼠血清孵育后， 再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。 （6）阳性对照：（1）～（5）结果阴性，（6）和待检标本阳性时，则为特异性荧光。 第二节 荧光抗体的制备 荧光抗体是免疫荧光细胞化学的重要技术之一，制备高特异性和高效价的荧光抗体必须 选用高质量的荧光素和高特异性高效价的免疫血清。 一、荧光素 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬 时停止（一般持续 10-7～10-8s）。可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。目前主要常 用的荧光色素有以下 3 种： （一）异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, GITC） 呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存 2 年以上，在低温中可 保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光谱为 490～495nm，最大发射光谱为 520～530nm， 呈现黄绿色荧光，分子量为 398.4（图 3-5）。 在碱性条件下，FITC 的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而 形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。反应式如下（图 3-6）： 一个 Ig 分子上最多能 标记 15～20 个 FITC 分子。 （二）四乙基罗达明（tetraethylrodamine B200, RB200） 呈褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱 为 570nm，最大发射光谱为 595～600nm,呈明亮橙红色荧光。分子量为 580。 RB200 在五氯化磷（PCl5）作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下易与蛋白质 的赖氨酸ε-氨基反应结合而标记在蛋白分子上。化学反应式如下。 （三）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC） 它是一种紫红色粉末，较稳定。其最大吸收光谱为 550nm，最大发射光谱 620nm，呈橙 红色荧光，与 FITC 的黄绿色荧光对比清晰（图 3-9），与蛋白质结合方式同 TITC。它可用 于双标记示踪研究。化学结构式如下。 Hoechst 33258 染色 固定液 50 ml Hoechst 33258 染色液 50 ml 抗荧光淬灭封片液 5 ml 说明书 1 份 保存条件： 4℃保存，Hoechst 33258 染色液需 4℃避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。 注意事项： Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。 Ø 需 PBS 或 0.9%NaCl 溶液。 Ø 需盖玻片与载玻片。 Ø 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。 Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。 使用说明： 1. 贴壁细胞 A. 取普通洁净盖玻片于 70%乙醇中浸泡 5 分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培 养级 PBS 或 0.9%NaCl 等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内， 种入细胞培养过夜，使约为 50%-80%满。 B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入 0.5ml 固定液，固定 10 分钟或更长时间（可 4 ℃过夜）。 C. 去固定液，用 PBS 或 0.9%NaCl 洗两遍，每次 3 分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或 手动晃动数次。 D. 加入 0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色 5 分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 E. 用 PBS 或 0.9%NaCl 洗两遍，每次 3 分钟。 F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞 接触封片液，切勿弄反。 G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在 350nm 左右，发射波长在 460nm 左右， 详细图谱请参考下图。 2. 悬浮细胞 A. 离心收集细胞样品于 1.5ml 离心管内，加入 0.5ml 固定液，缓缓悬起细胞，固定 10 分钟 或更长时间（可 4℃过夜）。 B. 离心去固定液，用 PBS 或 0.9%NaCl 洗两遍，每次 3 分钟。洗涤期间手动晃动。 C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约 50ml 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上， 尽量使细胞分布均匀。 D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 E. 均匀滴上 0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色 5 分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 F. 用 PBS 或 0.9%NaCl 洗两遍，每次 3 分钟。 G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在 350nm 左右，发射波长在 460nm 左. 3. 组织切片 A. 对于任何常见切片，处理至常规可以进行免疫染色时，或完成常规的免疫染色后，即可 进行后续的 Hoechst 染色。 B. PBS 或 0.9%NaCl 洗两遍，每次 3 分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 可在六孔板中操作。 C. 加入 0.5ml Hoechst 33258 染色液，染色 5 分钟。也宜用摇床，或手动晃动。 D. 用 PBS 或 0.9%NaCl 洗两遍，每次 3 分钟。 E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在 350nm 左右，发射波长在 460nm 左右， Hoechst 33258 的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱。 DAPI 染核 原理： 主要结合 dsDNA；结合小沟的 AT。DAPI 也结合 RNA，但其发射峰波长（500nm）要长于 DAPI/dsDNA（460nm）。 DAPI dilactate 更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时，下述方法可加以修改。 保存： 10mg/单位，室温避光保存，小瓶内至少一年。制 stock 液，溶解 100uM （DAPI dihydrochloride 二盐酸化物分子量为 350.3；DAPI dilactate 分子量为 457.5）DAPI 于去离子水中或 DMF(二 甲基甲酰胺)，4℃避光可保存 6 个月。 DAPI 是诱变剂，水溶液可通过活性炭去除，要安全处理。 染色： 在所有染色完成后进行复染，不需要另外的固定和通透处理。 荧光显微镜复染方法： 1. PBS 平衡 2. PBS 稀释 DAPI stock 液至 300nM，滴加 300μL 这种稀释液于细胞上。 3. 孵育 5 分钟。 4. PBS 中涮洗几次，涳干过量缓冲液，抗淬灭剂封片。 FISH 复染： 样品在 dH2O 中洗以去除残留缓冲盐溶液，有助于减少玻片上非特异背景。 1. PBS 中稀释至 30nM，吸 300μL 滴于样品上，塑料玻片有助于平均分配染料。 2. 黑暗室温孵育 30 分钟。 3. 去掉盖玻片，PBS 和 dH2O 中小心盥洗。 4. 去掉过量液体，绵纸在样品边缘小心吸取。 5. 盖上盖玻片，蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。 荧光显微镜观察。 Rhodamine 123 染色 中文名称：罗丹明 123 目 的：测细胞内线粒体的跨膜电位 EX/EM： 505/534 染液配制： 罗丹明 123 粉剂用甲醇配制成 1mg/ml 的储备液，100ul/支分装，-20℃保存。 染色时用 Dulbecco’s PBS 缓冲液将其稀释为 5ug/ml。 染色步骤： 培养细胞 Dulbecco’s PBS 缓冲液漂洗 2～3 次(缓冲液预热至室温或 37℃) Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育 1 小时 Dulbecco’s PBS 缓冲液漂洗 2～3 次 加 0.5ml Dulbecco’s PBS，上机测量 Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度) 原理： AM 酯的羧酸经修改不带电荷，易浸入细胞。一旦进入细胞，亲脂性集团被非特异酯酶切断， 使其带电荷，从而溢出细胞大大减慢。一般，酯化集团水解对于结合靶离子是必须的。AM 酯水解显颜色或荧光的特点可用于检查其自发水解。 保存： 指示剂干燥避光 4℃或-20℃可长期保存。 AM 酯易水解，发货瓶中至少可放六个月。 用时 AM 应溶解于无水 DMSO，并尽快使用（一周内），否则细胞运载能力下降。AM 的 DMSO 储备液应避光、冷冻、干燥保存。盐的储备液应用蒸馏水或缓冲液制备，冷冻-20℃ 避光保存，可放 6 个月。 应用： 用细胞浸透 AM 酯运载技术： 1.在生理缓冲媒介中将 DMSO 稀释至 1-5μM。不可用含胺的缓冲液如 Tris。 2.有机阴离子转运抑制剂苯甲酸（1－2.5mM）或 sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)可加入细胞外液 以减少指示剂去酯后的渗漏。苯甲酸和 sulfinpyrazone 是很碱性的，所以之后要重调 pH 值。 3.AM 酯孵育细胞一般在 20－37℃，15－60 分钟，准确的浓度，时间和温度靠经验摸索。 AM 酯运载技术有一个内在问题即亚细胞隔阂，降低孵育温度可以减轻这一副作用。 4.检测荧光前，建议细胞最好在无指示剂媒介中（最好有阴离子转运抑制剂）洗，以去掉细 胞表面的非特异吸附的染料。而后再孵育 30 分钟来进一步使细胞内 AM 酯完全脱掉。荧光 素泄漏引起的背景高可以在实验前在细胞外加入抗荧光素抗体来防止。 目 的：测细胞内游离钙离子浓度 EX/EM：探针在细胞外液无荧光，进入细胞后最大激发波长和发射波长为 464/526 方法一： 染液配制：Fluo-3-AM 50ug 溶于 45ul DMSO(Fluo-3-AM 浓度 1mM)，15ul/支分装，-20℃保 存。染色时用 15～50mM HEPES 缓冲液将其稀释为 1～20uM(如 1.5ml 为 10uM)。 染色步骤： 培养细胞 缓冲液漂洗 2～3 次 Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室温孵育 0.5～1 小时 缓冲液漂洗 2～3 次 加 0.5ml 缓冲液，上机测量 一、荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要 部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的 荧光图像。 荧光显微镜的结构和主要部件 （一）光源 现在多采用 200W 的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定 数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发 时，可达 50～70 个标准大气压力，这一过程一般约需 5～15min。超高压汞灯的发光是电极 间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光， 足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。 超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太 高。 新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约 为 15000V），启动后，维持工作电压一般为 50～60V，工作电流约 4A 左右。200W 超高压 汞灯的平均寿命，在每次使用 2h 的情况下约为 200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短， 如开一次只工作 20min，则寿命降低 50%。因此，使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过 程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭， 以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等 15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强 烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。 超高压汞灯（100W 或 200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室 上有调节 灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光 透镜。 国产超高压汞灯 GCQ-200 型性能良好，可以代替 HBO-200 等型的进口灯泡，平均寿命 在 200h 以上，价格也比较低。 我国研制的一种简易轻便型高色温溴钨荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、 直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已