Bactobac表达系统中文版说明书

Bac-to-Bac杆状病毒达系统试剂盒内容物：Introduction：Overview：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。*一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac表达结构后可以产生重组杆粒。*一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点：*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择pFastBac菌体（Vector）：大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。Vector特点参考pFastBacTM1高水平表达的强AcMNPV聚乙Anderon1996烯（PH）启动子用于简单克隆的大量克隆位点pFastBacTMHT高水平表达的聚乙烯启动子；Polayes1996N-末端含有6XHis，可以用来纯化重组蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3个阅读框TM两个强启动子（PH和p10）可Harris和Polaye1997pFastBacDual以同时表达两种蛋白；两个大的克隆位点指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导：1、克隆目的基因到pFastBacTM供体质粒的选择TM结构到最高效的TM产生重组质粒2、转化pFastBacDH10Bac3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、扩增滴定（Amplifyandtiter）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。Bac-to-Bac表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBacTM菌株。基于pFastBacTM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7*第二个主要结构是EcoliTM品系，用来作为pFastBacTMTM的DH10Bac菌株的宿主。DH10Bac细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBacTM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBacTM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10BacEcoli中包括：*一个低拷贝的微型F复制子*卡那霉素的抗性标记*一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒EcoliDH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal或X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10BacEcoli也包含辅助质粒，pMON7124，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7转化功能。图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达实验轮廓：流程：下图揭示了表达目的基因的一般步骤1、pFastBacdonor质粒（步骤：目的基因的克隆）得到2、pFastBac重组体（转化至DN10Bac细胞（含有杆粒和helper））得到3、含有重组杆粒的Ecoli细胞（重新划线）得到4、验证过的含有重组杆粒的Ecoli细胞（过夜培养，分离重组杆粒DNA）得到5、重组杆粒DNA（使用Cellfectin试剂感染细胞）得到6、P1重组杆状病毒株（＞106pfu/ml）（感染昆虫细胞扩增病毒）得到7、P2重组杆状病毒株（＞107pfu/ml）（滴定感染昆虫细胞）得到8、蛋白的表达培养昆虫细胞：一般指导：介绍：对于您的杆状病毒转移菌，我们推荐使用Sf9和Sf21昆虫细胞作为宿主。在开始你的转化试验和表达之前，确定你有收获的Sf9和Sf21，并将其冻存。使用无血清的介质：昆虫细胞可能在无血清的条件下收获。我们推荐使用Sf900ⅡSFM。Sf900ⅡSFM对于维持Sf9和Sf21以及对于大规模生产重组蛋白，都是无蛋白的最优的介质。昆虫细胞培养参考指导：维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下冷冻细胞使用无血清的介质按比例增加细胞产量一般指导：昆虫细胞对于环境很敏感，此外化学和营养因素，物理因素都可以影响昆虫细胞的成长。需要优化以得到最大产量。考虑以下培养条件：*温度：细胞的感染和成长的最适合范围是27-28度*PH：对于许多培养系统时合适的范围。Sf900ⅡSFM在此范围内支持一般的空气和开盖培养*同渗重摩：鳞翅类细胞使用介质的最优同渗重摩是345-380mOsm/kg*通风：对于最优生长条件和蛋白的表达，昆虫细胞被动的通氧。积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%*剪切力：悬浮培养产生机械剪切力。生长的昆虫细胞在含有血清的介质中（10%-20%FBS），对于细胞的剪切力一般会得到足够的保护。如果你的细胞在无血清条件下生长，加入剪切力保护剂例如PluronicF-68。注意：在Sf900ⅡSFM中生长的细胞不需要加入剪切力保护剂。转染的细胞：你需要的是对数期的细胞＞95%发育能力，可以完成成功的转染。产生重组的pFastBacTM菌株（Vector）一般信息：介绍：为了产生包含目的基因的重组质粒，使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，你需要使用限制酶消化和连接，将你的目的基因克隆进入pFastBac菌的其中一种。一般分子生物学技术：为了帮助限制酶消化和连接DNA的序列，需要其他一般的分子生物学技术扩增和保存质粒：pFastBac菌种和他的相应的表达对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因，可以使用Ecoli进行Amp筛选。为了扩增和保存pFastBac和pFastBac对照质粒，使用以下方法：1、使用载体株系感染一个recA,endAEcoli株，例如Top10，DH10B或者DH5α2、在含有100ug/mlAmp的LB琼脂糖平板选择转化株。3、选择含有质粒的转化子制备甘油菌以便长期保存克隆进入pFastBacTM1介绍：为了帮助你设计策略克隆你的目的基因进入pFastBacTM1，参考以下建议和表格克隆考虑事项：pFastBacTM1菌株是非融合菌株（无融合标签）。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有：一个ATG起始密码子用于转录起始一个终止密码子。注意：终止密码子包含在所有三个阅读框中的多克隆位点中注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。pFastBacTM1的多克隆位点：下图是pFastBacTM1的多克隆位点。限制位点标出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子下划线表示。pFastBacTM1的全序列可以从网站下载。pFastBacTM1的图谱和描述见后缀克隆进入pFastBacTMHTA，B，C介绍：pFastBacTMHT载体由三个读码框（A，B，C）提供的多克隆位点从而实现克隆目的基因，并且在N端带有6XHis。克隆：pFastBacTMHT菌株是融合菌株。为了保证表达重组蛋白，你必须：*克隆你的基因要带有ATG，位于4050-4052碱基对间。这个将会产生融合表达，带有6XHis标签，可以用TEV切除你的插入要含有终止密码注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测pFastBacTMHTA的多克隆位点：下图是pFastBacTMHTA的多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。pFastBacTMHTB的多克隆位点：下图是pFastBacTMHTA的多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。pFastBacTMHTC的多克隆位点：下图是pFastBacTMHTA的多克隆位点。其实ATG用黑体标出。限制性位点标出来以便显示实际切刻位点。框住的核苷酸显示出的是易变区域。注意pFastBacTMHTC在XbaⅠ位点内有一个终止密码子，他在N端标签框内。确定你的基因的5`端是在XbaⅠ位点上游开始。克隆进入pFastBacTMDual介绍：pFastBacTMDual包含两个多克隆位点，可以同时表达两个异源基因，一个通过PH启动子控制，另一个通过P10启动子控制。参见下列建议以便有助于你的基因克隆TM克隆事项：pFastBacDual是一个非融合载体。为了保证重组蛋白的表达，你的插入必须含有以下两点一个ATG起始密码子如果你不使用多克隆位点中的终止密码子，就必须要有一个终止密码子注意：重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始ATG。一般来说，转移载体包含完整的PH引导序列，可以提高表达的产量。对于插入克隆上游的聚乙烯启动子，注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的ATG（ATT），尽管如此，从这个位点起始的效率是低的，而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测。PH启动子下游的多克隆位点：下图是pFastBacTMDual中PH启动子下游的多克隆位点的图示。限制性位点标记出来显示了实际的切刻位点。潜在的终止密码子有下划线标出。P10启动子下游的多克隆位点：下图是pFastBacTMDual的AcMNPVp10启动子下游的多克隆位点。限制性位点标记出来以便显示实际切刻位点。潜在的终止密码子标记下划线。转化和介绍：如果你已经完成了你的连接反应，你就要准备把你的pFastBacTM结构转化进Ecoli了。很多Ecoli宿主菌和转化程序都是可以使用的。一般推荐转化Ecoli和分析转化在下面列出Ecoli宿主：一旦你把你的插入序列克隆进入了pFastBacTM，你需要转化连接反应到Ecoli，并选择优Amp抗性的转化株。你可以使用任何recA，endAEcoli菌。包括Top10，DH10B或者DH5α进行转化。不要转化连接反应进入DH10Bac细胞。注意TOP10和DH10B感受态细胞可以从Invitrogen得到转化方法：你可以选择使用任何方法对Ecoli进行转化。化学转化是最便利的方法，而电转对大质粒是最有效的方法。选择好转化株，使用含有100ug/mlAmp的LB平板。转化株分析：一旦你得到Amp抗性转化株，我们有以下推荐：1、选出10个转化株，在含有100ug/ml的Amp的LB或培养基过夜培养2、使用你选的方法分离质粒DNA。我们推荐使用公司的试剂盒3、使用限制性方法分析质粒，证明是重组质粒并证明插入起始的正确。使用限制性酶或者酶化合物对Vector和插入端各进行一次酶切。使用PCR对转化株进行分析：你也可以使用PCR方法对阳性转化株进行分析。使用合适的PCR引物和Amp条件。如果你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行试验。使用错误的引物或污染的平板可能会得到假象。以下方法可以给你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真PCRSuperMix，合时的PCR前后引物过程：1、对于每个样品，在的小离心管加入48ul的高保真PCRSuperMix和各1ul的前后引物。2、选出10个克隆，在上述离心管中进行重悬（记得做一个Patch板保护克隆以便进行更深的分析）3、94度10分钟溶解细胞灭活核酸酶4、20-30个循环进行扩增5、延伸使用72度10分钟。4度储存6、琼脂糖凝胶电泳检测测序：对于你的结构需要进行测序证明目的基因是正确的起始以便表达。如果你是将基因克隆进入了pFastBacTMHT，证明的基因进入了N末端标签的读框中。长期保存：一旦你证明了测序的正确，确定克隆的纯度并制作甘油菌长期保存。推荐储存质粒DNA在-20度1、在含有100ug/ml的LB平板上对原始的克隆进行划线培养2、挑单克隆在1-2ml含有Amp的LB抚育3、培养至稳定期4、在的培养物中混合的过滤甘油，转到冷冻小管5、-80度储存重组质粒的产生转化到DH10BacEcoli介绍：一旦你有了你的TMTM，转变成为杆粒。你可pFastBac结构，你就可以准备转化纯化的质粒DNA进入DH10BacEcoli以使用蓝/白斑选出含有重组杆粒的克隆。Bac-toBac表达系统提供高效TMDH10Bac感受态细胞。阳性对照：每个pFastBacTM质粒都提供相应的阳性对照用来作为阳性转染和表达对照（下表）。根据pFastBacTMVecctor的使用，我们推荐在你的DH10Bac转染试验中作相应的对照。所需材料：开始之前你需要有以下材料*纯化的pFastBacTM结构（200pg/ul储存于的TE）阳性表达对照TM1管细胞）*高效DH10Bac感受态细胞（表达系统提供，每个转化试验使用*pUC19（与DH10Bac一起提供，用来做对照）*LB平板，包含Kan，Gen（庆大），Tetracycline（四环素），Bluo-gal（卤代吲哚基-beta-D-半乳糖苷）和IPTG。（每个转化3个板，使用新鲜平板，推荐见下文）*LB板含有100ug/mlAmp（用于pUC19转化对照）介质*15ml圆底塑料管*42度水域和37度摇床及37度培养箱。你需要准备LB琼脂糖平板，包含50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo-gal，40ug/mlIPTG，用来进行TMBbluo-gal，IPTG，在后面有制备平板DH10Bac转化株的筛选。可以从我公司预订抗生素，的指导。如果你正准备的LB平板使用的是事先混合好的，我们推荐使用LuriaBrothBase代替LB。使用LB板将会降低颜色敏感度，并可能降低克隆的数量。注意：在蓝/白斑筛选中使用Bluo-gal代替X-Gal。Bluo-gal产生的蓝斑颜色要比X-Gal深。准备转化：对于每个转化，你都需要一小瓶感受态细胞和三个平板。*42度水域平衡*37度烘板30分钟*室温放置SOC介质*对于每个转化试验预冷一个15ml管子转化过程：按照以下过程用高效TMTMDH10Bac感受态细胞转化pFastBac结构。我们推荐做阳性对照的转化来帮助你证明你的结果。TM1、整管高效DH10Bac感受态细胞冰上解冻。2、每个转化试验，轻轻地混合，将100ulTM高效DH10Bac感受态细胞倒入预冷的15ml管子3、向细胞中加入适量的质粒DNA，轻轻混合。千万不要上下吹吸混合*pFastBacTM结构：1ng(5ul)*pFastBacTM对照质粒：1ng*pUC19对照：50pg（5ul）4、冰上抚育30分钟5、42度热激45秒6、立即冰上2分钟7、加入900ul室温的SOC培养基8、pFastBacTM转化：37度225转震荡培养4小时。pUC19转化：37度225转震荡培养1小时9、对于每个pFastBacTM的转化：准备10折连续（不知道什么意思）用SOC稀释的细胞（10-1，10-2，10-3），每个稀释用100ul铺一个LB平板，平板包含50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo-gal，40ug/mlIPTG。对于pUC19转化：用SOC培养基1：100稀释细胞，铺100ul稀释物在含有100ug/mlAmp的LB平板。10、37度抚育48小时。分析筛选的克隆（参见推荐）。注意：我们不推荐早于48小时挑单克隆，因为这样可能会难于区分蓝白斑。重要的：微型Tn7插入到微型attTn7附属位点会干扰LacZa肽的表达，所以包含重组质粒的克隆在蓝色背景下是白色的，可能隐藏在未改变的质粒中。选择白斑分析。真正的白斑克隆比较大；因此为了避免选择成假阳性，选择最大的，最独立的白斑。避免挑出现灰色的或者在中间的菌落，因为他们可能是包含空质粒的细胞核重组细胞的混合。验证显性：1、挑10个白色的克隆，重新划线在新鲜LB平板（50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo-gal，40ug/mlIPTG）。37度过夜培养。2、在包含Bluo-Gal和IPTG的重新划线的平板上选出单克隆证明是白色的显性，嫁接至有50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline的液体中3、使用我公司的试剂盒抽提重组质粒DNA。选择性的，你可以使用附录提供的操作步骤。这个过程源于抽提大的质粒DNA（＞100kb），适用于分离质粒DNA。4、分析重组质粒DNA证明成功转化到了杆粒中。我们推荐使用PCR分析杆粒DNA。注意：适用琼脂糖凝胶电泳可以证明转化的成功与否，他可以分出高分子量的DNA。这个方法要比PCR分析可信度低，因为高分子量DNA是很难见到的。使用PCR分析重组质粒介绍：重组杆粒DNA要大于135kb。既然限制性分析很难完成这么大的DNA分析，我们推荐使用PCR分析鉴定重组杆粒中的目的基因。杆粒包含M13正负引物位点，位于LacZa互不区域的微型attTn7位点两侧，可以完成PCR检验。本节提供使用M13引物的PCR检验指导。使用M13引物进行PCR分析：使用PCR法证明你的目的基因在重组杆粒中，你可能会：使用M13Forward（-40）和M13Reverse引物使用M13Forward（-40）或M13Reverse引物于你的插入片段杂交成联合物DNA聚合酶：你可能会使用任何DNA聚合酶在你的PCR试验中，包括PlatinumTaq酶。如果希望PCR产物＞4kb，我们推荐使用聚合酶混合物。例如高保真的PlatinumTaq酶得到PCR产物：使用下面过程扩增重组杆粒DNA，适用M13正反引物和PlatinumTaq酶。如果你使用M13F或M13R与一个你的基因特意引物混合，你需要自己决定扩增的条件。如果你使用其它的聚合酶，依照供应商提供的建议。注意：如果你的插入片段＞4kb扩增条件需要被优化.1、每个样品，在微型管子中装入50ul的量进行PCR反映重组杆粒DNA（100ng）1ul10XPCRBuffer5ul10mMdNTPMix5ul50mMMgCl2PCR引物（10uM）蒸馏水总体积50ul2、一滴矿物油覆盖3、一下参量进行扩增4、从反应产物吸取5-10ul进行琼脂糖电泳分析你将会看到：如果转化发生了，而且你使用的是M13正负引物扩增，你将会在电泳上看到下列PCR产物大小如果你使用的是M13和你的特异引物进行的扩增，你需要决定PCR产物是否是希望的。12页的图有助于你计算。重组杆状病毒的产生转染昆虫细胞：介绍：一旦你证明了你的重组杆粒含有你的目的基因，就可以准备进行昆虫细胞的转染了，以产生重组杆状病毒。本章提供指导和建议以便完成昆虫细胞的转染准备质粒：你可以使用任何方法准备纯化的重组杆粒DNA。杆粒DNA必须没有酚和NaCl的污染，他们会杀死细胞，盐类会干扰脂类复合物，降低转染效率。我们推荐使用本公司产品提质粒。转染方法：推荐使用一个阳离子脂质体，例如Cellfectin试剂进行转染。此试剂用来提供给表达系统使用。Cellfectin试剂：不做翻译昆虫细胞系：推荐使用Sf9和Sf21进行转染。HighFiveandMimicSf9不推荐因为他们转染效率低下。不过，如果你有了你的杆状病毒株，你可以进行HighFiveandMimicSf9表达试验。转染介质：为了高效的转染，我们推荐在无Grace的昆虫细胞培养基中完成转染。注意Grace的昆虫细胞培养基应该不含有FBS（血糖），因为蛋白在血糖和其补充物中会与Cellfectin试剂互作，影响转染。注意：如果你在Sf-900ⅡSFM中收获了Sf9或Sf21，你可以在不含有Grace的培养基中完成转染，转染后可以容易的将Sf-900ⅡSFM转变回去阳性对照：如果你有了从pFastBac对照质粒中得到的重组杆粒，我们推荐，包括这个阳性对照在你的试验中和转化中能够评估你的结果。在这些杆粒中，包括β-葡糖甘酶（Gus）和/或氯霉素乙酰转移酶（CAT）将会在PH或者P10启动子控制下表达。在转染过后，表达的Gus和CAT可以适当进行验证。所需材料：开始之前需要有下列材料：*从pFastBacTM结构（500ng/ulTE溶解，）中纯化的重组杆粒DNA*从合适的pFastBacTM对照结构中纯化的重组杆粒DNA合适培养基收获的Sf9或者Sf21*Cellfectin试剂（4度保存）*Grace`s昆虫细胞培养基，未被补充的（培养基不含有补充剂，FBS或者抗生素）*6孔培养板或者其它组织培养用具*12X75mm灭菌管培养昆虫细胞的完全培养基计算出你的转染试验所需的Sf9细胞数量，进行扩增。转染前确定细胞健康且繁殖能力＞97%。转染条件：我们通常使用下列条件在Sf9中扩增杆状病毒株。对于你的转染试验这些条件应该作为一个起始点，你可以通过改变DNA和Cellfectin试剂的浓度以及细胞密度对条件进行优化。转染步骤：适用下列步骤在6孔板进行Sf9细胞的转染。如果你想在其它细胞培养用具中转染细胞，你需要对你的条件进行优化。记得使用无补充的Grace`s培养基，他不含有FBS或抗生素1、在6孔板或35mm组织培养板，与每个孔2ml含有抗生素的培养基中（例如：2ml的SF900ⅡSFM包含50单位/ml青霉素和50ug/ml链霉素）接种9X105Sf9细胞。2、27度细胞最少接触1小时3、对于每个转染的样品，准备杆粒DNA：Cellfectin试剂混合在12X75mm的灭菌管中1）将1ug纯化的杆粒DNA稀释进入100ul未补充Grace培养基2）完全混匀Cellfectin试剂，翻转混合5-10次。吸出6ulCellfectin试剂稀释进100ul未补充Grace培养基。3）使用稀释的Cellfectin试剂连接稀释的杆粒DNA（总体积约210ul）。轻混合，室温抚育15-45分钟。4、在DNA/脂肪混合体抚育过程中，从细胞中除去培养基并用2ml未补充Grace培养基清洗。弃去清洗培养基。5、向每个含有混合体的管子中加入未补充Grace培养基，清混匀，将混合体加入到含有细胞的孔中。6、27度培养5小时7、弃去DNA/脂肪混合体，向细胞中加入2ml全培养基（例如SF900SFM含有抗生素）8、27度潮湿条件抚育72小时或者指导你开始能够看到病毒感染的现象。提取P1病毒株。分离P1病毒株介绍：带有芽孢的病毒应该在转染以后释放入培养基72小时。但是，如果你的转染效率不好，细胞可能在转染后的4-5天也没有被病毒感染的迹象。转染过后的72小时，你需要亲自检查细胞是否有感染信号（下表）一旦细胞出现感染，使用下列步骤从培养基中收获细胞。感染细胞的特性：使用倒差显微镜在250-400X观察感染细胞时，可以看到病毒感染的细胞具有以下特点：感染记号显性描述早期（第一个24小时）细胞直径增加可以看到直径增大了25-50%细胞核增大细胞核可能充满细胞晚期（24-72小时）细胞停止增长与单个细胞相比，细胞不再增大出现颗粒体病毒芽孢信号，出现小泡分离细胞从平板或曲颈瓶脱离很晚期（大于72小时）细胞消亡细胞出现消亡，单层细胞开始出现消亡制备P1病毒株：1、一旦从第8步得到转染细胞，上述的晚期转染现象出现，就可以从每个孔中收集含有病毒的细胞，并转入灭过菌的15ml带盖管子。500Xg离心5分钟除去细胞和大的碎片2、将上清转到新的15ml离心管。这就是P1病毒株。4度避光储存。储存信息见下页注意：如果你希望浓缩的病毒株，你可以在离心后，使用低蛋白吸附的滤器完成。病毒株的储存：按下列条件储存：1、避光，4度2、如果培养基不含血清，加入FBS至终浓度为2%，血清可以作为蛋白酶底物。3、对于长期保存，重新扩增后保存整株病毒于-80度4、不要在4度时储存经常使用的病毒。重复冻融会降低病毒的滴度。下一步：得到你的纯化P1杆状病毒株之后，你可以：1、扩增毒株（下节详细介绍）这个过程推荐得到最高滴度的毒株，而且在你的试验中优化结果2、决定你的毒株的滴定度（见病毒斑点试验）3、如果你希望，纯化你的病毒结构4、使用P1病毒株感染Sf9进行表达预试验。注意：如果你想做一个小规模的或者是预试验，你可以直接使用P1毒株感染Sf9进行表达试验。由于毒株数量小，表达条件可能不能再生（如果滴度未知，MOI是不可知的）扩增你的病毒株介绍：P1毒株是小规模，低滴度的毒株，你需要使用这株去感染细胞，从而产生高滴度的P2株。转染Sf9细胞得到的首株的滴度一般为1X106到1X107pfu/ml。用以下步骤扩增得到的P2株滴度为1X107到1X108pfu/ml。本章提供P2株的制备和指导所需材料：SF9或Sf21；P1病毒株；合适的培养用具；组织培养试剂；27度潮湿培养箱重要的：扩增P1病毒株，需要感染Sf9或者Sf21，使用悬浮或单层培养。根据你的需要，你可以任何规模的扩增，但是你因你使用的P1菌株的量受到限制。一般扩增P1在10ml悬浮培养基中培养2X106细胞/ml或在6孔板培养2X106细胞/ml。计算感染所需的Sf9细胞，随后Expand细胞。使用前确定你的细胞健康并且繁殖力大于97%多样性感染（MOI）：为了扩增毒株，在多样性感染细胞的范围是。MOI就像每个细胞的病毒数量一样需要定义。使用下列公式计算获得特定的MOI需要多少病毒株：注意：如果你没有滴定你的P1毒株，你需要假定滴度范围是1X106至107pfu/ml6细胞/ml，使用MOI=我们假定P1毒株的滴度是6例如：需要感染10ml细胞，2X105X10pfu/ml。扩增步骤：依照下列步骤在6孔板扩增P1毒株1、感染当天，准备Sf9和Sf21细胞上清和细胞板，2X106细胞/孔。接触培养细胞室温1小时2、1小时后倒差显微镜检查细胞的吸附情况3、每孔加入合适数量的P1毒株4、27度潮湿培养箱抚育细胞48小时5、感染后48小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基，转到15ml的管子。500Xg离心5分钟弃去细胞和碎片。注意：可以在感染晚期收获病毒（72小时）。每个杆状病毒的结构决定了优化收获时间。过度培养将会由于细胞的调亡使生殖能力衰减6、将上清转到15ml管子。这是P2毒株。4度避光保存。长期保存需要整株在-80度7、检测你的P2毒株的滴度梯度扩增步骤：一旦你有了高滴度的P2杆状病毒毒株，你可以梯度增加扩增病毒至任何体积。为了产生高滴度的P3，梯度扩增的细胞量和病毒体积要适当，遵照本章指导从冰冻的主毒株获得高滴度毒株：如果你储存你的毒株在-80度，我们推荐使用此株产生另外的高滴度毒株进行表达试验。当病毒在-80度保存时，滴度会降低。下面为指导和扩增过程病毒斑点试验（PerformingaViralPlaqueAssy）:介绍：我们推荐使用斑点试验进行：决定你毒株的滴度；斑点纯化病毒（可选）试验框架：决定病毒的滴度，你需要1、在6孔板的Sf9细胞2、准备10-flod连续稀释的病毒株3、将不同稀释的杆状病毒加入到Sf9和感染细胞中1小时4、弃去病毒覆盖细胞层使用Plaquing培养基5、抚育7-10天计算每个稀释物中的斑点病毒滴度影响因素：影响滴度的因素很多：1、目的基因的大小。滴度一般会随着目的基因的增大而减小2、转染效率。为了高的转染效率，我们推荐使用Cellfectin试剂转染Sf9。准备DNA/脂质体混合物在非补充Grace昆虫培养基3、杆状病毒株的年龄。长期保存在4度或者-80度病毒的滴度都会减弱。如果你的病毒株已经保存了6个月-1年我们推荐在使用前滴度或者重新滴度病毒4、冻融次数。如果你储存在-80度，每次冻融都会降低病毒10%的滴度5、错误的储存方式。为了经常使用，病毒株应该整株的保存在4度避光条件所需材料：实验前所需材料：1、你的澄清的杆状病毒株（使用前存在4度）2、适当培养基中的Sf9或Sf21（每个被滴度的杆状病毒株为30ml对数期细胞，5X105细胞/ml）3、SF900ⅡSFM或其它合适的完全生长培养基4、Sf900培养基（）（100ml；或其它何时的培养基）5、4%琼脂糖凝胶6、灭菌的细胞培养级别的蒸馏水7、100ml灭菌的玻璃瓶8、6孔子之培养板（每个毒株2个板用来滴定）9、无菌台10、40度和70度水域11、微波炉（可选）12、27度潮湿培养箱注意：如果你在血清补充培养基培养Sf9（完全TNM-FN）。你需要有以下试剂1、Grace昆虫培养基，补充过的2、Grace昆虫培养基（2X）3、胎牛血清（FBS），高质量的热灭火的准备斑点培养基（PlaquingMedium）：斑点培养基由培养基和琼脂糖混合组成，对于斑点试验用来固定昆虫细胞。在开始下列步骤前立即准备斑点培养基。如果你培养Sf9在SF900ⅡSFM中，那准备Sf900斑点培养基。如果你培养是在TNM-FH，准备Grace斑点培养基。注意其它培养基也可以使用1、在微波炉或者70度水域20-30分钟溶化4%的琼脂糖凝胶，溶化之后，下列物质放入40度水域空的，灭菌的100ml瓶子*Sf-900培养基（）或者Grace昆虫细胞培养基（2X）、4%的琼脂糖凝胶液化后，将胶，培养基和空瓶子转到超净台、用下列方法快速制备斑点培养基：Sf900斑点培养基：混合30ml的Sf-900培养基（）和10ml的4%的琼脂糖凝胶在100ml瓶子里，轻摇。Grace`s斑点培养基：20ml热灭活的FBS加入到100mlGrace昆虫细胞培养基（2X）的瓶子。将25ml含有血清的Grace昆虫细胞培养基（2X）和细胞培养级别的灭菌蒸馏水以及溶化的琼脂糖胶混合在100ml空瓶子，轻轻混匀4、使用之前将斑点培养基的瓶子放回40度水域斑点试验的过程：使用以下步骤在6孔板完成斑点试验以决定拟的杆状病毒株的滴度。如果你有了杆状病毒表达对照，我们推荐你对这个也作滴度。记得在试验中做一个阴性对照（无病毒）注意：下列过程提供的量适合滴度一个病毒株（每个病毒株2个6孔板）。如果你想滴度更多，，相应的增加试剂量1、转染当天，收获Sf9，在Sf900ⅡSMF中制备30ml细胞上清，5X105细胞/ml。（或其它完全培养基）。如果你有阴性对照，你需要另外的一个板子2、是细胞在板底定居，盖盖室温抚育1小时3、1小时培养之后，相差显微镜观察细胞。Sf9应该是已经吸附而且50%已经融合。4、准备8个梯度稀释（10-1到10-8）的纯化病毒株，在Sf900ⅡSMF或者未补充的Grace培养基，无FBS。为了做这些，你需要在12ml管子顺序稀释的病毒株或前面稀释过的培养基。需要完成8个管子。5、将装有Sf9的6孔板和稀释过病毒的管子转移到超净台。标记上板子，需要2体积（一个样品一个复制品）按如下方法：10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8。6、从孔中除去培养基，立即用1ml适合的稀释的病毒代替。7、室温抚育1小时8、抚育1小时后，从40度水域中除去细胞和培养基瓶。9、从最高的稀释到最低的稀释（10-8至10-3）顺序，从孔中除去含有病毒的培养基，使用2ml斑点培养基代替。尽快操作避免细胞单层干燥10、移动板子之前使用琼脂糖培养基覆盖10-20分钟11、27度潮湿培养箱抚育7-10天之道斑点可见并可以计数。如果你想着色斑点计数，见下面，计算滴度，见前面注意：为了改进斑点的可见度，用中性红染色平板。其它平板染料比如水晶蓝不推荐，因为他们包含的有机溶剂能杀死宿主细胞。你可以使用下列之一：1、准备琼脂糖溶液包含有中性红，将溶液覆盖感染后的板子子上4天。感染后7-10天计算板子数量。2、准备中性红溶液加入到计数前1-2小时的平板（感染后7-10天）。重要的：如果你想斑点纯化你的病毒，不要染色斑点使用中性红，它可以诱导重组病毒的突变所需材料：开始试验前你需要有下列物质：1、中性红2、细胞培养级别的蒸馏水3、Sf900ⅡSMF或其它培养基（如果制备琼脂糖溶液）4、4%琼脂糖凝胶（如果准备琼脂糖溶液）5、40水域（如果制备琼脂糖溶液）中性红染色过程：准备琼脂糖覆盖的中性红（第4天使用）1、在Sf900ⅡSMF（或其它全培养基）中制备1mg/ml的中性红。过滤除菌。2、40度水域中50ml的管子混合下列试剂：1mg/ml的中性红（）；Sf900ⅡSMF（）3、微波炉溶化4%的琼脂糖凝胶，40度水域5分钟4、将含有中性红溶液的50ml管子和凝胶转到超净台。加入6ml琼脂糖凝胶到中性红溶液5、每个孔用1ml中性红覆盖。琼脂糖凝胶凝固后，将平板放回27度潮湿培养箱知道斑点可以计数。将会出现清楚地斑点准备中性红染色（第7-10天计数前使用）1、准备1mg/ml的中性红加入到细胞培养级别的蒸馏水2、每个孔加入中性红溶液，室温抚育1-2小时3、用滤纸或吸耳球轻轻除去过量的燃料，计算斑点。在红的背景下，透明胶上的斑点会清楚可见计算滴度：是用下列公式计算你的毒株的滴度。注意优化范围是6孔板上每个孔计算3-20个斑滴度（pfu/ml）=斑的数量X稀释因子X（1/接种体积ml/孔）红色单层中例如：我们在每孔含有10-6病毒稀释的孔中加入了1ml接种体积，得到了20个斑。使用公式得到滴度：滴度=20（斑）X106X（1/1ml/孔）=2X107pfu/ml你将会看到：当滴度杆状病毒株时，一般得到的滴度范围为：P1为1X106-1X107pfu/ml；P2为1X107-1X108pfu/ml。注意：如果你的P1毒株滴度小于为1X106pfu/ml或P2小于1X107pfu/ml，推荐生产新的毒株。斑点纯化：你可以通过斑点纯化从单个的病毒克隆得到毒株。使用下列步骤所需材料：Well-Space的病毒斑点的平板（来自斑点试验）；活性大于95%的对数期的Sf9或Sf21；灭菌的巴斯德吸管和曲径瓶过程：1、培养Sf9或者Sf21参照斑点试验的1-3步2、使用巴斯德管和曲径瓶，小心的选择一个清澈斑点，将琼脂糖盖子（含有病毒）转到离心管，其中包含有500ul全培养基。使用漩涡震荡混合均匀3、每个孔加入100ul琼脂糖盖子溶液4、27度潮湿培养箱抚育72小时5、从每个孔收集含有毒株的培养基，转到15ml灭菌管。500Xg离心5分钟除去细胞和残片6、将上清转到新鲜的15ml管子。这个是斑点纯化的毒株7、以后过程为扩增杆状病毒株表达重组蛋白介绍：一旦你有了合适滴度的pFastBac杆状病毒株，你可以感染昆虫细胞进行重组蛋白试验阳性对照：如果你有高滴度的pFastBac杆状病毒对照结构，你可能希望做一个你的试验对照。一旦你的对照病毒感染了你的细胞，基因编码的Gus和/或CAT将会限制表达，以便进行简单的试验。表达指导：下面提供了一个使用重组病毒感染昆虫细胞表达目的蛋白的指导*细胞系：取决于你的需要和目的基因，你可以使用任何昆虫细胞包括Sf9和Sf21或MimicTMSf9进行表达。细胞可以进行悬浮和贴壁培养。注意：你如果表达分泌蛋白，需要使用HighFive细胞改进表达培养条件：一般在无血清条件下使用Sf900ⅡSMF或表达FiveSFM培养细胞。依据你的需要和目的蛋白，注意可能在感染后期需要添加%%的FBS或BSA以便保护重组蛋白不被水解。Protien-Based蛋白酶抑制剂一般比人工合成的蛋白酶抑制剂便宜而且高效*感染条件：推荐在细胞处于中对数期时（密度为１Ｘ１０６－２Ｘ１０６细胞／ｍl）感染细胞。确定在感染时培养不受营养或环境限制*MOI：理想的MOI因细胞系间，相关感染动力学毒株或使用的克隆不同而不同。对于蛋白表达试验，应该为每个毒株，介质，反映和细胞系建立一个剂量反映，来证明感染参量的最优。最为试验的起始，感染细胞使用的MOI为1-5时间进程：推荐实施一个时间进程决定表达蛋白的表达动力学，因为许多蛋白可能会在培养之中被细胞蛋白酶降解。注意：分泌蛋白的最大表达一般在感染30-72小时看到，非分泌表达蛋白48-96小时。最优的表达：大量因素影响着最优表达，包括细胞系，MOI，你的目的，基因种类等。你可以使用下列优化的条件表达你的重组蛋白细胞系：一定量MOI的感染的Sf9，Sf21，HighFive或MimicTMSf9。重组蛋白表达的试验在不同的感染后时间（24，48，72，96小时）。选择细胞系提供重组蛋白的最好表达条件*MOI：不同的MOIs的感染的细胞量和蛋白试验。使用重组蛋白的最优水平提供的MOI*时间进程：固定的MOI感染的细胞和试验在感染后不同时间表达重组蛋白（24，48，96）选择最优条件分析重组蛋白表达：是用下列过程分析你的重组蛋白。下列过程使用与24孔形式的感染后24-96小时收获的细胞进行分析。其它程序也可以参考1、24孔板接种Sf96X105/孔.细胞接触至少30分钟2、弃去培养基用新鲜的培养基清洗一次。换上300ul新鲜培养基、在希望的MOI值时每孔加入毒株。包括合适的对照、27度潮湿培养、合适的时间收获细胞或培养基（分泌表达）（感染后24，48，72，96）。如果收获细胞，弃去培养基，使用无血清培养漂洗一次。1XSDS-PAGEBuffer400ul溶解细胞、-20度冷冻或煮沸样品最少3分钟，使用SDS-PAGE分离蛋白重组蛋白的检测：可以使用任何方法，包括目的蛋白功能性检验和Western印记。如果你做WB，需要有你目的蛋白的抗体。注意：如果你使用的是pFastBacTMHT表达蛋白，N末端的6XHis标签和TEV识别位点将会增加你的目的蛋白约3KD-葡糖甘酸酶试验：如果你的试验中包括了pFastBacTM1Gus或者pFastBacTMDual-Gus/CAT结构，你需要使用下列方法进行β-葡糖甘酸酶试验。其他方法也可用：*使用X-葡糖甘酸在琼脂糖板上检验篮斑*定性的快速鉴定β-葡糖甘酸酶，使用X-葡糖甘酸混合小量的细胞观察它的蓝色。简单的，混合5ul20mg/ml的X-葡糖甘酸（溶于DMSO或二甲基甲酰胺）到50ul细胞培养基。2小时内观察蓝色的变化CAT蛋白试验：如果你的试验中包括了pFastBacTMHT-CAT或者pFastBacTMDual-Gus/CAT结构，你需要使用你选择的方法进行CAT表达试验。CAT试验有显影试剂盒，如果做WB，可以从公司买抗血清纯化重组蛋白：你可以使用任何方法纯化蛋白。注意：涂过你的目的基因在pFastBacTMHT的6XHis标签筐内，你可以使用亲和层析介质例如ProBond或Ni-NTA。使用TEV蛋白酶除去N末端融合标签：如果你使用pFastBacTMHT表达融合蛋白，你可以使用TEV蛋白酶除去N末端融合的标签。注意：由于你可隆重使用的限制酶，增加得AA可能会出现在你的蛋白N末端问题解决克隆进入pFastBacTM载体：问题原因解决重组pFastBacTM结构物插入片断pFastBacTM质粒或插入DNA消化不完全*是用另外的限制酶消化*纯化插入片断pFastBacTM质粒遭到不完全的或者过渡的磷根据你使用的磷酸酯酶的说明书优化酸酯酶消化去磷酸化的条件pFastBacTM质粒或插入DNA片断未纯化好使用试剂盒连接不完全*根据你使用的连接酶说明书进行连接插入了不稳定的DNA序列如LTR和反向重复*低温培养转化细胞（30度）序列*使用MAX高效Stbl2完全细胞用于转化。Stbl2Ecoli转为不稳定片断设计转化后没有得到克隆或很少Ecoli感受态细胞效率低下*如果存储不当，制备新的细胞*使用我公司的感受态DNA不纯纯化插入的DNA。确信没有苯，蛋白质，去污剂和乙醇转化DNA量太大*对于化学的感受态细胞加1-10ng的DNA入5ul或少于100ul。电转感受态为10-50ng入1ul或少于20ul细胞连接不完全*优化连接反应*进行连接对照，进行胶检验注意：连接产物和线性DNA转化效率要比超螺旋DNA低10X，100-100X连接反应含有感受态细胞抑制剂减少连接反应的量。转化前使用5XTE稀释抗生素*确定抗生素使用正确，浓度正确*减产抗生素是否降解。使用新的感受态细胞储存不当-80度储存感受态细胞处理不当冰上融化后立即使用，不要震荡转化过程细胞未热激或抚育不当根据说明书进行产生重组杆粒DNA：当转化到DH10Bac时你可能会遇到下列情况，及解决方法问题原因解决无蓝斑（无重组）克隆着色时不够至少48小时在确定克隆显性之前注意：可能你看到的并挑选的蓝斑没有重组杆粒使用X-Gal代替Bluo-GalBluo-Gal在筛选中增加了蓝白斑的对照转化后成长不够涂板之前转化细胞在SOC至少培养4小时平板没有Bluo-Gal和IPTG制备新鲜的选择平板，包含50Kan，7Gen，10TeTra，100Bluo-Gal，40IPTG板上克隆太多*梯度稀释转化混合物，涂板均匀*调整细胞稀释度（10-2到10-4）平板时间太长或见光储存*不要使用超过4周的平板*避光保存抚育时间太短或温度太低条克隆前抚育至少48小时，37度抚育所有克隆都是蓝色pFastBacTMDNA质量不好*使用纯化质粒DNA*检查质粒DNA的质量，确定DNA没有降解平板未加Gen（庆大霉素）制备新鲜的选择平板，包含50Kan，7Gen，10TeTra，100Bluo-Gal，40IPTG得到克隆很少复苏表达时使用LB培养基使用SOC培养4小时复苏表达时间太短增加复苏时间37度4小时或30度6小时蓝白斑难以区别琼脂PH不对将LB琼脂调节至蓝斑亮度太弱*使用Bluo-Gal*增加Bluo-Gal的浓度至300ug/ml*使用黑白背景分辨平板板上克隆太多或者太少调整稀释细胞浓度至理想抚育时间太短或温度太低铺板48小时在挑斑*37度抚育IPTG浓度不对优化IPTG浓度，20-60ug/ml一般会使颜色清晰。分离杆粒DNA：问题原因解决杆粒DNA降解DNA储存不当纯化的杆粒DNA-20度*不要经常冻融高分子两杆粒DNA处理不当*分离杆粒DNA时，不要震荡DNA溶液*不要机械的重旋DNA，让溶液温和的降到管低产量低抗生素浓度不正确转化的DH10Bac细胞生长在含有50ug./mlKan，7Gen和10Tetra的LB培养基杆粒DNA含有重组和空杆粒在中间挑取灰色或者深色的克隆分析更多的白色DH10Bac转化株，选取一个仅含有重组杆粒的DNA转染昆虫细胞：问题原因解决病毒产量低转染效率低*使用Cellfectin试剂*在未补充Grace培养基转染，转染过程中确定不含有FBS或者抗生素*当感染信号出现时收集病毒上清（96小时后）细胞太稀少在推荐的细胞浓度铺板太多或太少的Cellfectin或其他脂质优化使用脂质体的数量体试剂DNA/脂质体混合体抚育时间太短或者优化抚育时间（3-8小时）太长重组杆粒DNA降解*转染之前琼脂糖电泳检查重组杆粒的量*使用试剂盒制备杆粒DNA或后面的方法杆粒DNA不纯评比其他的DH10Bac转化株，挑选含有只含有重组的蛋白表达：问题原因解决蛋白产量低病毒株包含有重组和非重组的进行斑点纯化分离重组病毒病毒没有重组*使用M13引物PCR检验杆粒DNA的转化*使用新的重组杆粒DNA重新转染使用的病毒低度太高或者太低通过改变MOI优化感染条件细胞收获时间不好进行时间过程试验决定最大蛋白量的收获时间细胞生长条件和培养基不是最优*根据你的培养器材优化培养条件和表达条件*在