工程菌株选育

个人收集整理仅供参考学习工程菌株选育一。出发菌株的纯化二。单孢子悬剂的敏感性。3）通过基因工程改进传统发酵名词解释：液的制备三。诱变剂及诱变剂量28.融合率：工艺1.菌株分离：是将一个混杂各种微生物四。突变株的常规分离与筛选五。1）采用直接法：融合率（%）=基本4）通过基因工程方法提高菌种抗性的样品通过分离技术区分开，并按照实际诱变剂的处理方式培养基上再生的菌落数/完全培养基上43.载体的性质：要求和菌株的特性采取迅速、准备、有效11.诱变剂的处理方式再生的菌落数一般是环状DNA，能在体外经酶切的方法对它们进行分离、筛选、进而得到1）两个以上因子同时处理*100%和连接而与目的基因结合成环，然后经所需要微生物的过程。2）不同诱变剂交替处理2）采用间接法：融合率（%）=重组转化进入受体细胞，并在受体细胞中2.诱变剂：凡能诱发生物基因突变并且3）同一种诱变剂连续重复使用体后代总数/所有后代总数融合率*100%进行大量复制及达。突变频率远远超过自发突变率的物理因4）紫外线光复活交替处理29.原生质体融合育种的应用：44.基因工程的主要步骤：子或化学物质称为诱变剂。1）提高产量或质量，合成新物质1）DNA的制备2）目的基因的生3.物理诱变剂：是指通常使用物理辐射2）改良菌种遗传特性产和分离3）DNA的连接中的各种射线。3）优化菌种发酵特性4）重组体导入大肠杆菌5）含重4.化学诱变剂：是一类能对DNA起作用，12.突变株的筛选方法4）进行遗传分析组体质粒的细菌菌落的鉴定改变其结构，并引起遗传变异的化学物（一）随机突变：也称摇瓶筛选，主30.细菌原生质体融合育种的一般程序6）目的基因的表达质。要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选。1）出发菌株的选择2）原生质体5.碱基类似物：是一类和天然的嘧啶嘌呤（二）平板菌落预算：的制备3）原生质体的融合等四种碱基分子结构相似的物质，是一种1）根据形态筛选突变株4）融合体再生和检出5）重组子即能正突变，也能诱发回复突变的诱变2）根据平板菌落生化反应突变株分离和遗传分析小：剂。3）采用冷敏感菌筛选抗生素变31.细菌原生质体融合核心技术：1.菌株的分离和筛选分为：采样、富集、6.烷化剂：是具有一个或多个活性烷基，株4）浓度梯度法1）提高细菌原生质体制备率的方法分离、鉴定。它们易取代DNA分子中活泼的H原子，5）琼脂块大通量筛选突变株2）建立最佳融合体系2.诱变剂分为：物理诱变剂、化学诱变剂、从而改变DNA分子结构，引起突变。6）应用复印技术快速筛选变株3）重组子分离模型生物诱变剂。7.营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变13.营养缺陷性菌株筛选的三种培养基：32.提高细菌原生质体制备率的方法：3.紫外线处理微生物时，其吸收射线的剂或自然突变失去合成某种营养的能力，只1）基本培养基（MM）：仅能满足微1）预处理：为了便于溶菌酶的溶解，量决定于紫外线灯的功率，灯管与被照射有基本培养基中补充所缺乏的营养因子生物野生型菌株生长所需要的培养基称可以加入物质进行预处理后再破壁，微生物的距离及照射时间。才能生长，称为营养缺陷型。基本培养基。如化学物质EDTA，巯基乙醇，4.化学诱变剂具有专一性，它们对基因的8.烈性噬菌体：如果能在短时间内连续完2）完全培养基（CM）：凡能满足一切细胞壁合成抑制因子，青霉素、甘氨酸。某部位发生作用。主要剂量取决于其浓度成生活史的五个阶段而实现繁殖和裂解营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组2）溶菌酶：对热和酸碱性有较大的和处理时间。寄主的噬菌体称为烈性噬菌体。合培养基，称适用范围，对溶解酶不敏感的可以加大5.脱氨基诱变机制：亚硝基可直接作用于9.酶的合成调节：酶的合成调节是一种通为完全培养基。酶的浓度和更换水解酶。正在复制和未复制的DNA分子，脱去碱过调节酶的合成量进而调节代谢速度的3）补充培养基（SM）：也称选择性培3）细菌生理状态：对数生长期，代基中的氨基变成酮基。调节机制，这是一种在基因水平上的代谢养基，凡只能满足相应的营养缺陷型生谢最旺盛，对溶解酶最敏感。6.琼脂块大通量筛选变株的原理：采用琼调节。长所需要的脂块，其筛选准确性比直接平板反应圈结10.微生物的分解代谢阻遏现象：在初级组合培养基称为补充培养基。33.建立最佳融合体系：果可靠、准确、更重要的是筛选量大。代谢和次级代谢中都存在，其含义是指代14.营养缺陷型菌株分离和筛选：1）融合剂的浓度：PEG4000--60007.ONPG：O--硝基苯酚--β--D--半乳糖谢过程中酶合成往往受高浓度的易被迅1）营养缺陷型的诱发2）淘汰野生浓度40%--60%苷。速分解利用的碳源和氮源抑制。型菌株2）融合剂的处理温度：一般低温融8.基因组改组阶段：菌株诱变和融合改组11.原生质体育种：以微生物原生质体为3）营养缺陷型的检出4）营养缺陷合重组率较高。育种相结合。的常用育种方法有原生质体再生育型的鉴定3）融合剂处理时间：处理时间一般9.基因工程育种的特点：与传统育种方法种、原生质体诱变育种、原生质体转化育15.淘汰野生型菌株的方法：少于30min，时间会使融合率降低。不同的是，基因工程育种能实现真正意义种和原生质体融合育种。1）抗生素法原理：青霉素，制霉病素34.细菌原生质体的制备方法：上的远缘杂交。12.原生质体再生育种：是微生物制备原等抗生素作用于生长着的微生物细胞，1）将带有遗传标记的双亲菌株分别10.生质体直接再生，从再生菌落中努力筛选对休止细胞无作用。接种在完全培养斜面上培养后接入液体变异菌株，最终得到优良性状提高的正突方法：菌培养在含抗生素的基本培培养基中，制备种子液，按接种变菌株。养基中。量1%--2%接种到新鲜液体培养基中，13.原生质体诱变育种：它是以微生物原2）菌丝过滤法：适用于丝状菌（放线培养至对书期，离心收集菌体。生质体为育种材料，采用物理或化学诱变菌、霉菌）2）酶解：每隔一段时间观察原生质剂处理，然后分离到再生培养基中再生，原理：基本培养基上只有发育成菌体形成的情况，当多数细胞转化原生质并从再生培养基中筛选高产突变菌株。丝；缺陷型菌株孢子可通过滤膜，野生体时，离心弃酶液，保存在高渗14.原生质体融合育种：是指双亲本原生型菌丝不能通过。溶液中。质体在促溶剂作用下相互作用，融合成一3）高温杀菌法：基本培养基上只有野35.霉菌原生质体融合育种的关键步骤：个细胞，然后核融合，最终强制性的将双生型生长，加热杀死野生型营养体，保（一）霉菌原生质体的制备亲基因组融合，DNA交换重组并产生性留缺陷型菌株芽孢，细菌-80。C，1）去孢子悬液，涂布于平板表状。酵母-60。C，适用于芽孢、孢子菌。面的玻璃纸上培养。15.基因组改组：基因组改组是传统育种16.效价的测定：重层琼脂法单层平板2）将培养长出菌丝体的玻璃纸方式与改组相结合，从而产生复杂子组法快速测定法转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖合，快速选育微生物的方法。17.噬菌体菌株的选育：动，使菌丝体散落在酶液16.基因工程育种：1）专一性噬菌体的获得和纯化2）中，取出玻璃纸，轻轻振荡酶解，一般广义：包括所有利用DNA重组技术高效价噬菌体原液制备酶解15--20min。将外源基因导入到微生物细胞，使后者3）菌株诱发突变和分离4）3）酶解后将酶解液用G--2或获得前者的某些优良性状或者液体摇瓶振荡培养G--3砂芯漏斗过滤，使原生质体与破碎利用后者作为表达场所来产生目的产物5）进一步考察抗性菌株对周围环境中菌丝体分开，然后洗涤得到物。各种噬菌体的抗性纯化的原生质体。狭义：仅指那些以微生物本身为出发18.酶合成调节的类型：（二）：原生质体融合：菌株，利用基因工程方法进行改造而获1）诱导调节：凡能促进酶生物合成的1）化学融合：将带有不同遗得的工程菌，或者是将微生物调节称为诱导调节。传标记的亲本菌株原生质体1:1混合在甲的某种基因导入到微生物乙中，使后2）阻遏调节：凡能阻遏酶生物合成的PEG中融合，对真菌来说者具有前者的某些性状或表达调节称为阻遏调节。融合条件基本一致，PEG的相对分子前者的基因产物而获得新菌株。19.解除磷酸盐调节突变株的选育：质量为4000--6000，浓度17.载体：载体是携带目的基因并将其转诱变后涂布在平板上→培养至肉眼可为40%，在Ca2+存在的情况下融合率移至受体细胞内复制和表达的运载工具。见→切下琼脂块继续培养→含磷酸钠会提高。2）电融合法：用融合仪在融→不含磷酸钠合室中融合，但对原生质体的伤害是不简答题：→底部不加滤纸→在平板观察抑菌圈可避免的，所以融合的原1.辐射剂量：绝对剂量：单位用crg1/nm2选择突变株生质悬液浓度和电流强度都需要摸索。表示，常用一种计量仪测定。→加磷酸盐滤纸→在平板观察抑菌圈（三）：融合重组体分析与鉴定相对剂量：单位用照射时间选择突变株1）传代稳定性测定2）细或杀菌率表示。20.杂交的意义：胞核菌落形态3）DNA含量2.紫外线诱变的特点：1）通过具有不同遗传性状菌株的杂4）产物5）孢子大小和红1）方便，诱变效果很好的常用诱变剂交，使遗传物质进行交换和重新组合，外线光谱2）在红光操作或暗培养改变亲株的遗传物质的基础，扩36.工业微生物育种的发展：3）参数：紫外功率，工作距离，照射大变异范围，使两株的优良性状集中于自然选育、诱变育种、杂交育种、代时间重组体内，获得新品种。谢控制育种、基因工程育种3.辐射的照射方法：2）通过杂交后获得具有新遗传特性37.利用平皿中生化反应进行分离的方1）直接对平皿上的菌落进行照射的重组体，不仅克服长期诱变造成的生法：2）用直径6--10mm的打孔器把菌落连活力下降，代谢缓慢等缺陷，也透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑琼脂一同取出，置于灭菌平皿内进行培可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱菌圈法养变剂的“疲劳”效应。38.基因组改组育种的：3）制成菌悬液3）通过杂交可以遗传物质和传特点：基因组改组育种技术不仅具有4.碱基类似物诱变处理方法：递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。高效性和定向性，更具有了通量化和自1）单独处理：饥饿培养8--10h，浓度21.微生物杂交亲本菌株的选择：动化的特点。为25--40μg/ml，不同的菌浓度不同1）原始亲本：原始亲本是微生物杂区别：传统杂交育种也涉及整个基因2）与辐射线复合处理：诱变后的效果交育种中具有不同遗传背景的优质出发组，但只是两个亲本之间发生重组，而比单独处理的效果好。菌株主要根据杂交的目的来选基因组是多个亲本之间的重5.烷化剂的分类：择。组，是传统育种方式和改组相结合的，快1）单功能烷化剂：仅一个烷化基团，2）直接亲本：在杂交育种中具有遗速选育微生物的方法。对生物毒性小，诱变效应大。传标记和亲和能力而直接用于杂交配对39.基因组改组育种技术的基本原理：2）双功能烷化剂或多功能烷化剂：具的菌株，称为直接亲本。原理：将诱变育种和原生质体融合育有两个或多个烷化基团，毒性大，致死22.微生物杂交育种的基本程序：种相结合。率高，诱变效应较差选择原始亲本→诱变筛选直接亲本特点：传统原生质体融合是两个亲本6.烷化剂的性质：→直接亲本之间亲和力鉴定→杂交→分单轮融合，基因组改组是多亲本多轮融1）1--甲基--3--硝基--1--亚硝基胍（亚离到基本培养基或选择培养基培养合。硝基胍、NTG或NG或→筛选重组体→重组体分析鉴定1）多亲融合：即参与融合的是多个MNNG）23.微生物杂交育种的遗传标记：带有不同遗传性状的亲本，一般采用（1）黄色结晶状物质，性质不稳定，1）营养缺陷型标记2）抗性标记4---11个。遇光颜色由黄色变为绿色，诱变效应3）温度敏感性标记2）递推式：融合重组后代可重复进降低，须保存在棕色瓶中，并4）其他性状标记（菌落形态、可溶行第二次、第三次甚至更多轮融合。在低温，干燥条件下保存。色素的含量等）40.基因组改组育种技术的方法：（2）NTG不溶于水，须加助溶剂24.放线菌杂交技术的方法：混合培养1）对出发菌株进行人工诱变，建立（如丙酮），使用时现用现配，有起诱变法、玻璃纸法、平板杂交法等。一个正突变菌株的突变库。剂之称。25.混合培养法的步骤：2）把突变库中的正突变株制备原生2）甲基磺酸乙酯（EMS）3）硫酸二1）直接亲本是杂交配对菌株2）质体，然后进行多亲本原生质体的融合，乙脂（DES）4）乙烯亚胺斜面混合接种3）单孢子悬液的制备从中筛选出性状优良的重组体，7.NTG诱变方法：4）重组体的检出5）重组体的鉴构建重组体库。孢子悬液的制备别3）如果一轮筛选不理想还可以进行NTG母液制备混合终止反应26.原生质体再生育种的操作：多次递推式原生质体融合，直至筛选到处理完毕后，马上把接触过的NTG的1）菌种培养至对数生长期2）用理性目的菌株。器皿用NaOH和NaSO侵泡处理。溶解酶等酶降解菌体细胞壁41.基因组改组育种技术：2238.诱变育种的作用：3）离心收集原生质体后转移到再生1）提高目的代谢产物产量2）提高有效产物的产量改善菌种特性培养基上再生优化微生物的发酵特性提高产品质量简化工艺条件4）从再生培养基上筛选高产突变菌3）改造微生物代谢途径4）开发新品种株在代谢工程和功能基因研究中的应用9.影响菌种生长发育的主要因素：27.原生质体诱变育种的特点：42.基因工程在微生物育种中的应用：培养基斜面培养基制备技术移种育种过程中亲本直接与诱变剂接触，1）通过基因工程方法生产药物的密度温度湿度药品和材料质量材料通常为对数生长期细胞，代谢旺盛2）通过基因工程方法提高菌种的生10.诱变育种的步骤：复制频繁，生活力强，可提高对诱变产能力