放射性核素标记技术

放射性核素标记技术实验核医学一.几个概念 1.标记及标记化合物：通过一定的实验手段将某种放射性同位素和某种生物活性化合物相连接，使之成为某示踪物的方法称之为标记。其产物称之为标记化合物。 2.内源性标记：在有机或生物合成过程中，使放射性前身物掺入到某生物活性分子一级结构内的标记方法。特点是标记化合物和生物活性物质理化特性完全相同. 3.理想标记：当化合物中某原子被相同元素的放射性同位素所取代，而取代后的分子性质不发生改变(如构型,旋光性等)这称之为理想标记。它和内源性标记特点相似但方法不同。 4.非理想标记：在一定条件下，用组成化合物以外的放射性同位素原子进行取代该化合物的某些原子的标记称之非理想标记。其分子结构或性质均较原化合物有不同程度的改变。 5.末端标记：用化学或酶的方法将放射性同位素连接在完整生物活性分子上的方法。 6.双标记：在某生物活性分子中引进二种元素同位素原子或同一元素的二种放射性同位素标记称之为双标记。如T3，T4分别用125I，131I标记观察脱碘情况。22Na，24Na在细胞内外示踪观察Na流动情况。优点：是在同一实验中可以观察多种指标及代谢变化，排除减少个体实验误差。7.标记化合物的术语及符号1)定位标记：以"S"示,标记分子中标记的原子局限于分子的指定位置.用以追踪分子中某原子的去向。A-X-B+C-X*-D---------A-X-D+C-X*-BA-X-B+C-X*-D---------A-X*-D+C-X-B 产物C-X*-B1式正确.2)非定位标记：标记分子中标记的原子没有特定的位置。3)均匀标记：以"U"表示,指标记放射性原子在标记物分子中的分布，相对于分子中所有碳原子而言具有统计学均一性.如U-14C葡萄糖。 4)全标记：以"G"表示,通常指在氚标记的分子中所有的氢原子位置均被氚所取代，它和均匀标记的区别是：前者指"C"而后者指氚,前者仅表示统计学的均一性,而后者则是完全或随机取代.如G-3H-胆固醇。 5)准定位标记：以"N"表示,氚原子在预期标记的位置上的分布低于化合物总氚含量的95%。 8.标记位置及命名如1-14C-醋酸←标记化合物↑↖标记位置核素二.放射性同位素的选择根据实验选择相应的同位素，应注意：1.比放射性:表示单位重量的元素或示踪所含的放射性多少,以mCi/mmol或MBq/mmol等单位表示。由于放射性同位素的比放射性相差悬殊，所以当某示踪中引进相同原子数目的不同种类的放射性同位素，则单位时间内的核衰变数就有上千，上万倍的差异，可见选用高比放射性的同位素进行标记有着重要意义。2.丰度：类似于纯度的概念，代表了某示踪物中具有放射性部分的比例。丰度的高低直接或间接地影响标记产物的比放射性。3.半衰期：半衰期对标记反应的影响首先是对比放射性的影响,其次是要根据实验目的和时间而选择不同半衰期的放射性同位素。4.稳定性和外辐射:标记用的放射性同位素应有较好的稳定性，如131I较125I稳定性差，而且有β辐射，所以RIA常选用125I标记。5.探测仪器的计数效率:氚标记物需要用液闪测量不仅样品制备烦琐，而且仪器计数效率低，致使其应用受限。6.标记类型同位素交换法、化学合成法、生物合成法、 三.关于被标记的生物活性物的选择: 被标记的生物活性物是根据实验所确定的，但用于标记的物质必须是高纯度，所谓高纯度包括两个含义：1.化学纯2.其中所含的微量杂质不干扰实验内容，就放免而言纯品应有足够的免疫纯；杂蛋白的掺入可因其被大量标记而使标记失去意义；类似结构的杂质可因和反应体系内某些物质交叉而干扰实验。四．标记化合物的主要指标及检查方法1. 核纯度：        所需放射性活度核纯度%= ×100样品总放射性活度半衰期测定法、能量测定、2.  放化纯度：特定形态的放射性活度放化纯度%=×100样品总放射性活度层析法、放射自显影、放射性扫描、HPLC、 分段切取测量待测组分和原点的距离（I）Rf=流动相的前沿和原点的距离（L）待测组分和原点的距离（I）Rf= 流动相的前沿和原点的距离（L）3)比活度：比活度=放射性活度/单位化学量*每一种放射性核素都有一个比活度的理论值比活度λN=0.693N/T1/2N为一毫克原子（mA）的总原子数为6.023×1020=69.6×108/T1/2GBq/mA意义是每mA的某核素比活度的理论值，即每分子接上一个该放射性核素原子的标记化合物的比活度理论值。一些常用放射性核素比活度理论值  核素半衰期Bq/mmol 14C5730Y2.3G3H12.33Y1073G35S87.4d55.2T32p14.28d338.5T125I60.2d80.3T131I8.04d600T五.标记方法原料为简单化合物如3H2,Ba14CO3,Na125I等1)    同位素交换法2)化学合成法3)生物合成法多肽或蛋白质的碘化标记 125I-Na在氧化剂的作用下氧化成碘分子,与蛋白质或多肽分子中的酪氨酸残基发生碘化作用,从而使蛋白或多肽碘化.所以只要含有酪氨酸或人为的接上酪氨酸的化合物均可用放射性碘标记,除此而外组氨酸,色氨酸残基也可生成碘化物.碘化标记有一氯化碘法,氯胺-T法,过氧化物酶法,Iodogen法,电解标记法,连接标记法等这里仅介绍常用的后四种方法.一.氯胺-T法.1. 原理:氯胺-T(对甲基苯磺胺的N-氯衍生物)是一种较温和的氧化在水溶液中,产生次氯酸,它可以使阴离子131I,125I在碘化反应过程中产生一种具有强氧化性的带正电荷的碘原子对酪氨酸酚环上与负氧(羟基)邻位的碳进行亲,电攻击,或对组胺酸咪唑环上与负氮邻位的碳进行亲电攻击,产生取代反应而碘化多肽或蛋白质.这种取代反应在某些情况下可以在组胺酰咪唑基或半胱胺酰巯基上,对于非肽类激素,如甾体激素A环第二位的氢也可进行取代.有关氯胺-T的作用原理尚不清楚,可能反应如下:2.标记过程和实验条件的优化:(以TSH为例)1)碘化程序及条件:TSH纯品(碘化级)2μg10μl缓冲液(0.5MPBPH7.5)20μl125I-Nao.5mCi5μlCL-T20μg20μl-----------------------------------------反应45秒室温(25℃)偏重亚硫酸钠40μg80μl-----------------------------------------然后用SephadexG-75(1×20Cm)分离放射性碘和标记蛋白.标记过程中应注意的问题是:1)被标记的纯品必须要高纯度，高活性通常为碘化级。2)PH对碘化反应有着重要影响,根据被碘化的蛋白质，多肽不同，所需最适PH也不同，一般以中性偏弱碱环境为宜；为确保反应体系维持适当的PH则必须要使用足够缓冲容量的缓冲液。3)碘源和氯胺-T的用量：首先注意碘源是丰度，是否有保护剂(通常为Na2SO3等还原剂)，有无载体等，实验中氧化剂的用量远大于理论值；当有还原剂时氯胺-T用量较无还原剂碘源还要相应增大；由于氯胺-T的用量也能将蛋白或多肽的巯基氧化；所以标记还原性强的蛋白化合物时氯胺-T的用量亦应相应增加。氯胺-T的用量有一临界值,低于此值，氯胺-T用量不足时标记率很低，而用量过大不仅无助于提高标记率反而会明显降低标记化合物的免疫和生物活性。氯胺-T的用量是一实验值，由于氯胺-T水溶液遇光和空气很不稳定，所以要新鲜配制。4)温度对标记的影响：如图所示：温度的增加不仅可提高反应达平衡的时间，而且在不同温度下反应有着不同平衡常数K值.一般选用20℃，过高的温度往往造成纯品失活。有人用4℃标记是为了降低氯胺-T的副作用。5)反应体积的影响：通常要小于100μl，目的是提高可被碘化的蛋白浓度；以提高碘化率。6)反应时间：在某一固定的条件下，反应达到平衡的时间是比较衡定的，氯胺-T法反应时间一般在一分钟以内；和氯胺-T用量一样增加反应时间非但不能提高碘化率,反而会因为碘源,氧化剂等因素而加大标记化合物的损伤；把反应时间控制在最小是合理的。7)关于终止反应：可通过扩大反应体积或用还原剂如偏重亚硫酸钠，其用量为氯胺-T用量的1-2倍.二.乳过氧化物酶法(LPO) 1. 原理:在含有低浓度的过氧化氢条件下，乳过氧化物酶可以使过氧化氢把负一价碘离子氧化成带正电的碘离子，从而达到碘化的目的。该方法为一酶促反应，底物由过氧化氢，碘和被标记的酚化合物组成。其反应如下:2.LPO和CL-T法的比较:LPO法由于过氧化氢的浓度低而副反应少，其标记位点限于LPO能接近的位置，即蛋白分子的表面，远离活性中心；有定向特征；其标记产物活性保存较好；LPO标记主要作用在立体构型上有利于酶缔合的含有酪氨酰基和少量组氨酸残基的蛋白或多肽，这和CL-T法相同。二者不同之处是:CL-T法不仅限于分子表面，分子空间因子对标记的影响不大，而后者(LPO)则受分子空间因子影响，CL-T法标记咪唑基困难，而LPO可以较容易的标记组氨酸，除此而外LPO法可用以标记各种细胞及细胞膜。3.LPO法标记条件的探讨:1)反应温度的影响：不同实验内容最适温度各异，通常介于20-37℃，本室选用20℃。2)反应时间的影响：理论上每克分子酶每分钟催化6.5×103克分子碘进入蛋白。但实验表明其标记率和时间的相关曲线类似于CL-T法，达反应平衡的时间远大于CL-T法，一般在数分钟之内。3)PH的影响：过氧化物酶在酸性环境中活性最好，有人认为最佳PH以4.5-5为宜。但实际工作的最佳PH并不尽相同，其范围在3-8之间，这可能由于在不同PH环境中蛋白质活性基团的游离，暴露程度不同有关。4)过氧化物酶的用量：浓度过低不能有效的碘化，浓度过高碘利用率增加并不显著，而且还能造成自身标记，通常其用量应少于被标记蛋白的1-10%。标记200μg的IgG酶的用量为25μg。5)过氧化氢的用量：过氧化氢系强氧化剂，高浓度过氧化氢(>100μg分子)可抑制过氧化物酶活性，而且损伤被标记蛋白的活性，过氧化氢浓度过低致使碘化率太低。一般一克分子的碘用一克分子的过氧化氢为宜。该方法另一应注意的问题是；过氧化氢不稳定需用前稀释。为了克服过氧化氢对酶和蛋白的损伤作用，有人对此方法进行了改进，利用葡萄糖氧化酶和D-葡萄糖相作用缓慢释放过氧化氢以减少其抑制和损伤作用。本方法的另一改进是将过氧化物酶偶联到Sepharose上，固定化酶有利于克服酶自身标记的问题。总之该方法条件温和，标记损伤小是一较为普遍使用的标记方法。4.LPO法对脂肪的碘化:LPO法可以碘化标记磷酸脂，三丙烯酰甘油脂,游离脂肪酸，溶血磷脂及完整细胞上的脂质，其催化位置在饱和及不饱和脂肪酸上进行。5.LPO法标记对活细胞及细胞膜的碘化:由于LPO法标记位点仅限于酶分子所能到达的部位，而细胞膜表面可供碘化的蛋白质分子大量存在，所以严格限制条件可以标记活细胞或细胞膜(具体方法略)。注意点:1)标记物如果作为探针用必须严格限制125I2的生成,防止其进入细胞内侧.2)碘化细胞膜时要先碘化标记然后再分离细胞膜，以消除细胞的自分解干扰。3)为排除细胞内系统催化的碘化和对碘氧化的影响，应同时作对照实验。4)可溶性蛋白较膜蛋白更易碘化，所以标记前需充分洗涤，并加蛋白水解酶抑制剂。四.Iodogen法1.原理:Iodogen(氯甘脲)化学名称为1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲。该物质不溶于水，但可溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜等有机溶剂。它是一较温和的氧化剂，其标记原理和CL-T法，LPO法相似。2.特点：Iodogen法实际上是一固相氧化剂，条件温和而且易于控制，它既可以象LPO法一样碘化暴露在外的酪氨酸,组氨酸残基，也可以象CL-T一样在碘化酪氨酸残基时不受分子空间因素的影响。利用其不溶于水的特点可以简便地进行细胞标记(方法略)。这一方法目前受到广泛的应用。三.电解标记法1. 原理：碘化反应在坩埚内进行，阴阳极用半透膜分开，阳极区含有被标记的蛋白质和碘源，控制极间电压使氧化电势高到能使I-氧化成I2，但又低到使任何氨基酸不被氧化，从而达到碘化的目的。2.特点：条件温和，蛋白质不和氧化剂接触损伤小，条件易于控制适合较大量蛋白质的碘化，缺点是装置复杂，通常被标记的蛋白质量较大。四.间接标记法1.原理：这种方法是将*I用CL-T法标记到活泼的化学试剂上，然后将该试剂连接到欲标记的分子上，目前较为成熟的是Bolton-Hunter试剂，化学名为3-(对-羟基苯)丙酸-N琥珀亚胺酯(HPNS)，首先用CL-T法将HPNS碘化，然后以此酰化剂与蛋白质分子中的游离氨基酸相缩合而引入蛋白质分子中，反应如下:2.特点：由于该方法碘化标记的不是酪氨酸，而是自由的赖氨酸残基，所以特别适用于缺乏酪氨酸或酪氨酸位于活性中心，引入碘后就会导致失活的蛋白质。例如PA(proteinA)的4个酪氨酸残基有一个被碘化，则PA将失去结合IgG的Fc能力，故应选用这种方法。这种方法既避免了蛋白质与氧化剂的接触，也不和碘直接接触；所以损伤最小；缺点是二步反应，碘利用率低，标记物比活度低，不适用于短肽的标记。五.合成法(偶合法)标记用化学合成法引进放射性同位素在3H，14C标记中极为普遍。碘标记中亦有同样的应用，如欲标记T2定位将碘标记在3，5内环位置上，由于内环不能发生置换，取代反应。所以首先把酪氨酸碘化成4-羟3-5二碘苯基丙酮酸，然后再和非放射性4-羟3-5二碘苯基丙酮酸偶合，脱盐再用次磷酸和氢碘酸加热去掉3',5'位的碘,即得到T2(3,5).该方法的优点是可进行定位标记；产率高。标记物的纯化 当碘化反应终止后可选用各种生化或物理方法将被碘化的物质和游离碘分离，各种方法原理不同，特性各异要根据实验具体情况来选择。常用的方法有透析、电泳、各种色谱技术等，透析法简单易行，回收率较高。但要注意低温和在透析袋外加KI载体。对于某些不稳定的标记物常用分子筛Sephadex层析，它不仅可分离游离碘，而且还可以将标记中的损伤，变性物除去。对于某些定位标记的物质，可因碘在不同的位置所致电泳速度不同而借助电泳技术予分离。标记物的质量鉴定1.比放射性测定：投碘量×碘利用率比放射性(％)=------------------------×100投蛋白质量比放射性的测定方法：1）依上述公式直接计算，其中碘利用率的计算方法有:A)有机酸(如三氯醋酸)沉淀法。B)收集洗脱液并绘出层析谱，然后根据蛋白质峰和游离碘峰计算碘利用率。C)取小样作纸层析，根据扫描图计算碘利用率。2）用该标记作放免分析标准曲线，以T/B对浓度作图，以交于X轴所代表的该标记物质量和加入标记物的放射性相比(Bq/mol)，即为该标记物的比放射性。3）自身取代法:制备标准曲线，在同等条件下加入一定量的该标记物，分离、测定并计算其取代比率，求出比放射性。4)选用和被测标记物能谱相差较大的另一种同位素标记该物质，以待测标记物作标准曲线，以另一种示踪物的不同浓度作为样品加入反应体系，同时双道测定两种同位素放射性，求其抑制比率，从而计算其比放射性。实验目的不同所要求的比放射性亦有所不同，对RIA高比放射性有利提高方法的灵敏度,但对RBA标记物分子最好是一个分子标记一个碘原子最为理想。2.放化纯度:标记后要通过不同的方法将游离碘和被标记的蛋白质分开，分离的效果直接影响放化纯度鉴定方法包括各种层析技术(常用的柱层析,硅胶板,纸层析等)，电泳等。标记贮存一定时间后由于放射损伤，脱碘等原因引起放化纯度下降，须用同样的方法进一步纯化，放化纯一般应>90%。3.活性鉴定活性鉴定因不同实验内容而不同，RIA中主要检查标记物的免疫原性，非特异结合(NSB)<5-10%，最大特异结合在过量抗体存在的条件下应>85%。RBA则主要检查其生物活性，虽然具体指标不同，但内容基本相同。4.稳定性导致标记的蛋白质，多肽生物活性和免疫活性损伤，改变的主要因素有:1)蛋白质分子上碘原子的参入量:由于碘置换到酪氨酸残基系非同位素的非理想标记，所以碘化程度对其生物活性的改变就有决定的影响，引入碘的数目越少，活性改变就越小。反之亦然，所以比放射性要控制在一定的范围。同等的碘参入量对不同的物质所造成的活性改变也不相同，这和蛋白质本身的特性及分子量的大小有关。2)酪氨酸在被标记物的位置和地位对标记的稳定有重要关系。如前所述，如酪氨酸位于活性中心则碘化很容易造成标记物的损伤。3)氧化反应损伤:氧化损伤是由氧化剂和碘分子引起，主要涉及蛋氨酸、色氨酸及二硫键。4)辐射损伤:高比放射性时射线可引起标记物聚合，二硫键断裂致使标记物失活，另一方面射线可造成溶液水电离而损伤标记物。为此标记物需贮存在低温，有BSA或其它还原剂的溶液中贮存。 标记化合物 比活度 贮存状态 贮存温度 贮存浓度 14C标记化合物氨基酸核苷酸碳水化合物与核苷甾体化合物3H标记化合物氨基酸核苷酸碳水化合物与核苷甾体化合物32P-核苷酸35S-氨基酸125I-三碘甲腺原氨酸125I-甲状腺素 低高低高低高低高低高低高低高低高低55.5GBq/mg1.85GBq/mg1.48GBq/mg 冷冻干燥体含2%乙醇的灭菌水溶液含50%乙醇的缓冲溶液冷冻干燥固体含2%乙醇的灭菌水溶液含5-10%乙醇的苯溶液冷冻干燥固体含2%乙醇的水溶液含2%乙醇水溶液含2%乙醇的水溶液含乙醇的苯溶液含50%乙醇的溶液水溶液（冲氮气）水溶液（含0.1%巯醇）乙醇：水=3：150%丙二醇水溶液 -200C/00C-200C00C-200C20C/-1400C20C20C-200C20C20C/-1400C-200C/-1400C-800C20C/-1400C20C20C 1.85-3.7MBq/ml1.85-3.7MBq/ml1.85-3.7MBq/ml37MBq/ml37MBq/ml37MBq/ml37MBq/ml185MBq/ml185MBq/ml11-15MBq/ml37MBq/ml11.1MBq/ml待测组分和原点的距离（I）Rf= 流动相的前沿和原点的距离（L）