聚丙烯酰胺凝胶电泳-PAG的组成

聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE一、PAG的组成PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylenebixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis-----多孔三维网状结构 （1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺二、PAG的聚合需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。（一）化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-。注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合（二）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。三、PAG的浓度与孔径的关系PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：20~40完全透明且有弹性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊状不成形，易破碎。凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。常用的凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。四、不连续PAGE按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分连续PAGE不连续PAGEDisc-PAGE电极槽缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液 成分 作用 样品胶 T=3%C=20%单体欲分离的样品溶液pH6.7Tris-HCl缓冲液混在一起，用光聚合聚合而成的大孔凝胶 有防对流作用Disc-PAGE 成分 作用 浓缩胶 除不加样品外，其余组成成分同样品胶相同 样品在此胶中被浓缩Disc-PAGE 成分 作用 分离胶 T=7%C=2.5%单体溶液pH8.9Tris-HCl缓冲液化学聚合法聚合成小孔胶 主要的电泳分离部分分离原理1.浓缩效应1）凝胶层的不连续性两层凝胶T与C不同孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。2）缓冲液离子成分的不连续性甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M）很低，移动速度较慢，称为慢离子。HCl是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸HCl蛋白质样品胶浓缩胶分离胶样品低电导区快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。3）pH值的不连续性为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。3.分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面.五、PAGE的特点1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节小结1.掌握（不连续）PAGE的原理2.掌握影响PAGE迁移率的因素3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用4.熟悉PAG的聚合思考题名词解释1.凝胶总浓度2.凝胶交联度问答题1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。2.试比较CAME与PAGE操作的区别。3.简述不连续PAGE的原理。Figure1.TheSangersequencingreaction.SinglestrandedDNAisamplifiedinthepresenceoffluorescentlylabelledddNTPsthatservetoterminatethereactionandlabelallthefragmentsofDNAproduced.ThefragmentsofDNAarethenseparatedviapolyacrylamidegelelectrophoresisandthesequencereadusingalaserbeamandcomputer.常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳，能获得满意的结果。为了在使用凝胶做实验时有较高的重现性，制备凝胶所用的Acr浓度，Bis和Acr的比例、催化剂的浓度、聚合反应的溶液pH值、聚胶所需时间等能影响泳动率的因子都必须保持恒定。快离子很快移动到最前面，原来它停留在那部分地区则形成了低离子浓度区，即低电导区。低电导区有较高的电位梯度，就引起了电位梯度的突变。这种高电位梯度又使蛋白质阴离子和甘氨酸阴离子在此区域加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立以后，快离子和慢离子之间造成一个不断向正极移动的界面。夹在快、慢离子间的样品蛋白质阴离子的移动界面就在这个追赶中逐渐被压缩，聚集成一条狭窄的区带。浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。凝胶的pH值明显增加,并导致甘氨酸的大量解离,有效泳动率增加.甘氨酸的分子量远小于蛋白质,它将赶上并超过各种蛋白质分子直接在氯离子后移动.这时,由于凝胶孔径变小,使蛋白质分子的迁移率减小,于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH环境中泳动,分子迁移速度与分子量大小和形状与其迁移率密切相关,分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面.Figure1.TheSangersequencingreaction.SinglestrandedDNAisamplifiedinthepresenceoffluorescentlylabelledddNTPsthatservetoterminatethereactionandlabelallthefragmentsofDNAproduced.ThefragmentsofDNAarethenseparatedviapolyacrylamidegelelectrophoresisandthesequencereadusingalaserbeamandcomputer.