东北农业大学蛋白质与酶工程期末复习资料

东北农业大学蛋白质与酶工程期末复习资料 1. 蛋白质工程:以蛋白质结构与功能关系的知识为基础，通过周密的分子，把蛋白质 改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。 2. 酶工程:从应用的目的出发研究酶，就是在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质， 将相应的原料转化成有用的物质的技术，是生物工程的重要组成部分。 3. 酶工程根据酶工程研究分为:1)化学酶工程:通过对酶的化学修饰或固定化处理， 改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成制造人工酶;2)生物酶 工程:用基因重组技术生产酶，以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而生成能稳定， 具有新的生物活性剂催化效率更高的酶。 4. 蛋白质的融合:将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋 白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。 5. 蛋白质的融合的作用:1)用于表达产物的分离纯化;2)提高表达产物的溶解度;3) 提高蛋白质稳定性。 6. 蛋白质晶体学:利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学 的一个重要组成部分。 7. 生物大分子运动性的功能及意义:1)打开一个瞬时的通道;2)识别和调节(通过运动 识别底物);3)催化;4)信息传递。 8. 定点突变:通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究 蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。 9. 盒式突变:又称片段取代法，利用目标基因序列中适当的限制酶切位点，插入各种的突 变DNA片段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。 10. 酶工程的研究范围:1)各类自然酶的开发和生产;2)酶的分离纯化和鉴定技术;3) 固定化技术;4)利用其他的生物技术领域交叉渗透;5)多酶反应器的研制和应用。 11. 酶的稳定性和稳定化:(一)引起酶失活的原因:1)酶的活性中心一些特定氨基酸残基 被化学修饰，使酶活性丧失(微观);2)外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍， 使其不能与底物结合;3)酶的高级结构发生变化(螺旋、折叠发生变化);4)多肽链 的断裂(很强烈);(二)酶的稳定化:1)低温保存(酶的本身不易变性，不易使其他 酶把目的蛋白降解);2)添加盐类(高浓度(NH)SO);3)添加底物辅酶等配体;4)424 添加强变性剂(保护一级结构，使用时可复活);5)结晶化。 12. 微生物作为酶源的优越性:1)容易获得酶需要的酶类;2)容易获得高产菌株;3)生 产周期短;4)生产成本低;5)生产易管理;6)提高微生物产酶的途径比较多。 13. 固定化酶:指在一定空间呈封锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回 收重复使用。 14. 固定化酶的优点:1)极易将固定化酶与产物和底物分开;2)可以在较长时间内进行反 复的分批反应和装柱连续反应;3)在大多数情况下能够提高酶的稳定性;4)酶的反应 过程能加以严格控制;5)产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺;6)较游离酶更 适合于多酶反应;7)可以增加产物的收率，提高产物的质量;8)酶的使用效率提高、 成本降低。 15. 固定化酶的缺点:1)固定化时酶活力有损失;2)增加了生产的成本，工厂初始投资大; 3)只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物;4)与完整的菌体相比不适合多酶 反应，特别是需要辅因子的反应;5)胞内酶必须经过的分离手续。 16. 固定化酶的制备原则:1)必须注意维持酶的催化活性和专一性;2)固定化应有利于生 产的自动化和连续化;3)固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍煤与底物的接 近，以提高产品产量;4)酶与载体必须结合力牢固，使固定化酶能够回收，储藏利于 反复使用;5)固定化酶应有最大的稳定性，所选的载体不与废物产物或反应液发生化 学反应;6)固定化酶成本要低，利于工业使用。 17. 酶固定的方法:(一)非共价结合法:1)结晶法:适用于酶活性低的酶，结晶后浓度变化大，在不断的连续使用中没有所损耗;2)分解法:将酶制成干粉，将其分散于水中不溶相中，即使干粉悬浮于溶剂上，优点:回收较方便，缺点:干粉易吸水，颗粒变大，活性降低，在有机溶剂中酶活力会受到影响;3)物理吸附法:酶被物理吸附于不溶性载体的一种方法;优点:酶活性中心不容易被破坏，高级结构变化少，酶活力损失小，也适用于固定化细胞;缺点:酶与载体相互作用弱，酶易脱落;4)通过离子键结合到水溶性载体上;优点:操作简单、条件温和、高级结构及活性中心不能被破坏，也适用于固定化细胞;缺点:载体与酶的结合力较弱，阴阳离子或阳离子缓冲液，离子浓度影响较大、酶较易从载体上脱落;(二)化学结合法:1)共价结合法:酶与载体共价结合;方法:将载体有关的基因活化，然后与酶有关的基因发生偶联反应，在载体结合比较牢固，一般不会固定底物浓度变化而改变;缺点:反应条件较激烈，往往会引起高级结构的变化，破坏活性中心，只适用于酶的固定化，不适用于细胞的固定化;2)交联法:就使用多功能试剂或者是双功能试剂，使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法，一般会通过降低交联剂浓度及反应时间保持酶活力;(三)包埋法:1)网格型:将酶或微生物包埋在高分子凝胶的细微网格中，此法是固定化微生物细胞用得较多的方法;优点:不需要与酶蛋白发生结合反应，酶活回收率较高;2)微胶囊型:把酶分子包在一个胶囊中，高分子膜为半透型的，此胶囊不渗透，可以在一些无水的有机相中存在。 18. 固定化酶的性质:(一)固定化后酶活力的变化:原因:1)酶分子在固定化过程中空间构象有所变化，甚至影响活性中心的氨基酸;2)固定化后酶分子空间自由度受到限制，直接影响到活性中心对底物的空位作用;3)内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻力;4)包埋时，酶被高分子半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近;(二)固定化对酶稳定性的影响:1)热稳定性提高;2)对各种有机试剂及酶试剂稳定性提高;3)对不同pH值的稳定性，对蛋白酶的稳定性，贮存稳定性和操作稳定性都有影响;4)固定化酶稳定性提高的原因:固定化酶与载体可以多点连接，可以防止蛋白酶分子伸展变形;固定化后酶的活力可以缓解释放;可以抑制酶的自降解;(三)最适温度变化----升高;(四)最适pH值变化:范围扩宽;(五)Km(米氏常数的变化的变化----变小，亲和力提高)。 19. 固定化方法:1)将辅酶和酶共同的固定在同一个载体上，可得到一个永久性不需外加辅酶的体系;2)将辅酶直接固定在酶分子上。 20. 细胞固定化:被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性，并且有能被反复连续使用的活力。 21. 细胞固定化的优缺点:优点:1)固定化细胞保持了细胞内酶系的原始状态和天然环境，因而更稳定;2)保持胞内原有的多酶系统，对于多步催化优势更加明显，不需要辅酶再生;3)对固定化增殖细胞发酵更具明显优势;固定化细胞密度大，可增殖，缩短发酵生产周期;发酵稳定性好，可较长时间的反复连续使用;发酵液中含的菌体较少有利于产品分离纯化，提高产品质量;缺点:1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物;2)细胞膜、细胞壁，还有载体的存在都会形成一种扩散限制的作用;3)载体形成的孔隙大小影响到高分子底物的通透性。 22. 化学修饰:凡是通过化学基因的列入或除去而使蛋白质的共价结构发生改变，我们把这种现象称为化学修饰。 23. 蛋白质功能基反应性影响因素:1)微区的极性:2)氢键效应;3)静电效应;4)位阻效应。 24. 酶蛋白功能级的超反应性:指蛋白质的某个侧链基因与个别试剂能发生迅速反应。 25. 影响超反应性的因素:1)改变蛋白质功能的pK值;2)蛋白质功能基具有较大的反应 性;3)通过静电相互作用来吸引试剂并使其具有适当的取向;4)试剂与靠近修饰部位 的蛋白区域之间的立体化学适应性。 26. 修饰剂反应性的决定因素:1)选择吸附;2)静电相互作用;3)位阻因素;4)催化因 素:5)微区极性(局部环境的极性)。 27. 修饰反应专一性的控制:(一)试剂的选择:1)对氨基酸的修饰有几种情况:a.修饰所 有的氨基而不修饰其他基因;b.反修饰α氨基;c.修饰具有催化活性的氨基;d.改变蛋白 质的带电状态和溶解性，改变蛋白质的带电状态要选择能够在中性条件下带最大电荷量 的试剂，改变蛋白质的溶解性反应在水中进行，选择化学试剂为能溶于水的;3)反应 产物的定量测定;4)考虑试剂的大小:选择试剂体积小一些，便于修饰，不致使蛋白 质的构象发生较大变化;(二)反应条件的选择:1)反应条件不会造成蛋白质的不可逆 变性;2)反应条件选择有利于专一性修饰蛋白质;(三)反应的专一性:1)可以利用 蛋白质中某些基因的特殊性;2)选择不同反应pH值;3)利用某些产物不稳定性;4) 亲和标记;5)差别标记:在体系中有酶分子、底物、抑制剂存在时;6)利用蛋白状态 的差异。 28. 亲和试剂:也称作为位点专一性抑制剂，试剂作用于被作用位点的某一基因，而不与被 作用部位以外的其他基因发生作用，这类修饰剂叫做亲和试剂。 29. 亲和标记:亲和试剂一般都具有与底物相类似的结构，对酶的活性部位具有高度的亲和 性，能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记，把这一类专一性的化学修饰成为亲和标 记，也称专一性不可逆抑制。 30. 固定化酶:在一定空间上，呈闭合状态，可发生连续作用，最后回收再利用。 31. 固定化是如何通过下列三种效应影响酶的稳定性:1)产生空间障碍;2)产生扩散限制; 3)多点共价连接。 32. 稳定化的方法:(一)固定化(化学结合、包埋法等):1)产生空间障碍:抑制化学失 活;2)产生扩散限制:把酶包埋在多孔颗粒内部，底物先接触多孔颗粒表面，再扩散 到内部与酶作用，不受底物浓度控制;3)多点共价连接:将酶多点共价连接到载体表 面，或用双功能试剂交联酶，或降酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加牢固， 从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过度。 33. 核酶:是描述具有催化活性的RNA，其化学本质是核糖核酸具有酶的催化功能，底物可 以是不同分子，也可以是同一RNA分子中的某些部位。 34. 天然核酶:(一)剪切型核酶(催化自身和异体RNA的切割，核酸内切酶):1)锤头型 核酶;2)发卡型核酶;3)蛋白质—RNA复合酶;(二)剪接型核酶:包括组?内含子 和组?内含子;实现RNA的自我剪接;具有核酸内切酶和连接酶的活性。 35. 体外选择:从顺序随机的RNA或DNA分子构建的大容量随机分子库出发，在其中筛选 得到极少数具有特异功能的分子。 36. 适体:能与有机物或蛋白质等配体专一高效结合的RNA或DNA片段分别称RNA适体或 DNA适体。 37. 筛选适体的:1)化学合成DNA分子库，在分子链上的某一位置引入完全随机或部 分突变的顺序，分子的两端是固定的顺序，以便PCR扩增;2)经过几轮PCR扩增后， 体外转录形成一个具有随机顺序的RNA库;3)将这些RNA分子通过结合有靶分子的亲 和层析柱，根据RNA与靶分子的结合能力大小将其区分开来，结合力强的RNA分子被 最后洗脱下来;4)洗脱下来的RNA分子经过反转录、PCR扩增、转录，在进入下一次 筛选循环，经过5~10个循环后，获得库中富集了与靶分子亲和力高的RNA分子。 38. 核酶的筛选过程:1)通过转录随机序列的RNA构建一个DNA随机库;2)随机库中具 有催化活性分子可以催化底物与进行共价连接;3)将反应产物通过固定在底物RNA的 5’端顺序互补配对的寡核苷酸亲和柱，选择性的吸附随机库中那些可以催化连接反应 的RNA分子;4)经过高盐洗脱:逆转录、PCR扩增、转录、进入下一轮筛选;5)在接 下来的筛选循环中，用易错PCR以一定频率向有活性的分子中引入突变，增加了筛选得 到的随机库的分子多选择性;6)经过多轮筛选，有催化活性的RNA分子富集起来，而 活性比较低的分子被淘汰。 39. 脱氧核酶:利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段具有高效 催化活性和结构识别能力。 40. 体外选择方法:1)不需要转录和逆转录，人工合成DNA分子，直接进行PCR扩增;2) 获得单链DNA分子:PCR扩增在引物上连接一个生物素，将PCR产物经过生物素蛋白的 亲和柱来实现正负链的分离;3)引入二价的金属离子作为辅助因子;4)针对这些脱氧 核酶，将一些额外功能团引入到DNA当中，来增加结构和功能的亲和性。 41. 脱氧核酶的分类:(切割RNA的脱氧核酶)(切割DNA的脱氧核酶)(具有激酶活力的脱 氧核酶)(连接酶功能的脱氧核苷酶)(催化卟啉环金属螯合反应) 42. 反义核酸:DNA或RNA分子与mRNA分子结合，形成空间位阻，使其不能与核糖体结 合，进而翻译成蛋白质另外也能降解mRNA。 43. 酶分子的合理性设计:利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其实突变 性进行研究，获得酶分子特征。空间结构。结构和功能之间关系，以及氨基酸残基等方 面的信息，然后以此为依据对酶进行改造。 44. 酶分子的非合理性设计:不需要准确的酶分子结构信息，而通过随机突变、基因重组、 空白筛选等方法对其进行改造，定向选择出所需要性质的突变酶。 45. 酶分子定向进化:即酶分子的发展方向;是从一个或多个存在的亲本酶(天然的或人为 获得的)出发，经过基因的突变或重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得领 先期望的具有某些特性的进化酶。定向进化=随机突变+正向重组+选择(或筛选)。 2+46. 易错PCR:在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高Mg 浓度，加入Mn离子，改变体系中dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目 的基因中以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。 47. 连续易错PCR:将一次PCR扩增得到的有用突变基因，作为下一次PCR扩增模板，连续 反复地进行随机诱变，使每一次后的的小突变累积而产生重要的有意突变。 48. DNA改组:将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起，形成新的突变基因库， 又称有性PCR。 49. DNA改组的操作:从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶?随机切 割得到的随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，在PCR循环过程中，随机片段之间 互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组， 将亲本中的有意突变进行重新组合。 50. 交错延伸法:在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间， 从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物，与体系内同时存在的不 同模板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整长度的基因片段，结果会产 生间隔的含有不同模板序列的新生DNA分子，这样的新生DNA分子中，含有大量的突 变组合，将有利于新的酶性质的产生。 51. 基因文库:一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到 载体DNA分子中，所有插入基因组DNA片段的载体分子集合体将包含这个生物体的整 个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。 52. 文库的代表性:指文库包含的DNA分子是否能完整地反映出来外源基因的全部可能的 变化和改变，它是体现文库质量的最重要指标。文库代表性好坏衡量指标是文库的库容 量。 53. 库容量:指构建出的原始突变文库中所包含的独立的重组子克隆数。 54. 构建突变库的载体:(λ噬菌体载体系统)(质粒载体系统)(哺乳类细胞表达载体系统)。 55. 模拟酶:又称为人工酶或酶模型，在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环 境等结构特征以及酶的作用机理和立体化学等特征的应用科学。 56. 酶模型的(催化基团)和(底物之间)必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良 好的反应特异性和催化效力是相当重要的。 57. “主—客体”化学:主体(酶)和客体(底物)通过配位键和其他次级键形成稳定复合 物的化学领域称为“主—客体”化学。 58. 模拟酶的分类:(一)根据类型分:1)单纯酶模型;2)机理酶模型;3)单纯合成的酶 样化合物;(二)根据属性分:1)主—客体酶模型;2)胶束酶模型;3)肽酶;4)半 合成酶;5)分子印迹酶;6)抗体酶。 59. 抗体酶:抗体高度选择性和酶的高效催化能力巧妙的产物，本质是一类具有催化能力的 免疫球蛋白，也叫催化抗体，专一性超过酶反应专一性催化速度，有的也可以达到酶的 催化速度。 60. 分子印迹:制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，把化合物叫做印迹分子，也 叫做模板分子。 61. 分子印迹的原理(分子印迹的制备方法):1)选择印迹分子的功能单体，使二者发生互 补反应;2)在印迹分子----单体复合物周围发生聚合反应;3)用抽提法从聚合物中除掉 印迹分子;4)形成的聚合物内保留与印迹分子形状、大小完全一样的空穴，该聚合物 能以高选择性重新结合印迹分子。 62. 表面分子印迹的种类:1)无机物为载体的表面分子印迹;2)固体材料表面修饰;3) 蛋白质表面印迹。 63. 生物印迹:分子印迹的一种，指以天然的生物材料(如蛋白质和糖类物质)为骨架，在 其上进行分子印迹，而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。 64. 生物印迹原理:生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消，其构象被固定，因而模板 分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化，在移入无水有机相中才能得以 保持。 65. 用生物印迹方法将蛋白质转化为半合成酶:1)使蛋白部分变性，扰乱起始蛋白的构象; 2)加入印迹分子，使印迹分子与部分变形的蛋白充分结合;3)待印迹分子与蛋白质相 互作用后，用交联剂交联印记的蛋白质;4)经透析方法除去印迹分子。