吡啶盐对多巴胺能细胞系SH-SY5Y的毒性作用机制

吡啶盐对多巴胺能细胞系SH-SY5Y的毒性作用机制 吡啶盐对多巴胺能细胞系SH-SY5Y的毒性 作用机制 ? 研究原着? 笙主_人堂堂(JFourthMil,lrtlLni,.)2003;24(16) 文章编号:1000-2790(2003)16.1520-03 1-甲基4-苯基-吡啶盐对多巴胺能细胞系SH.SY5Y的毒性作用机制 傅求真,李柱一,井晓荣,王者晋(第四军医大学唐都医院神经内科,陕 西西安710038) MechaniSillofthedeathofdopaminer. giccelllineSH..SY5Yinducedby1.. methyl-4-phenyl-pyridinium FUQiu—Zhen,LIZhu—Yi,riNGXiao—Rong,WANGZhe—fin DepartmentofNeurology,TangduHospital,FourthMilitary. Medi— calUniversity,Xi’an7l0038.China 【Abstract】AIM:Tostudythemechanismofdopaminergie cellsdeathinducedbyafterexposureto1??methyl-4?-phenyl?? pyridinium(MPP),apathogenictoxinrelatedtothe Parkinson’Sdisease.METHODS:Dopaminergiccellsvia- bilitywasmeasuredbyM1_rbyusingcellproliferationkit. OHandsuperoxidedismutase(SOD)contentswere measuredbychromatometryusingtheassaykitafterdo- paminergiccelllineSH-SY5YcellswereexposedtoMPP for24.48and72hrespe~ively.RESULTS:Dopaminergic cellsviabilityshowednosignificantchangeaftercellswrer exposedtoMPPfor24h,whereascellsviabilitysignifi— cantlydecreasedunderhighconcentrationofMPPfmore than200umol?L,.Thedecreasingratiowasinadose andtimedependentmanner.TheOHcontentwasnotsig- nificantlyfncreasedafter12hexposureandSODcontent wasnotsignificantlyreducedtill48hexposure.CONCLU- SION:TheincreasedOHmayresultinMPP-inducedoxi- dativestressindopaminergiccellsinearlystageofMPP exposure.Thedamageofcellularfreeradicalcleaningsys- ternmayleadtodopaminergJccellsdegenemtJonandlysis. 【Keywords】Parkinsondisease;1-methyl-4-phenyl-pyridini- um(MPP):oxidativestress 【摘要】目的:探讨与帕金森病发病有关的环境毒素1一甲 基4-苯基.吡啶盐(MPP)导致多巴胺能细胞死亡的可能机 制.:测定MPP作用于多巴胺能细胞系SH—SY5Y后细 胞存活率的变化及OH自由基,超氧化物岐化酶(SOD)的变 化.结果:MPP作用于多巴胺能细胞系SY5Y,可导致细胞存 活率显着性减少,浓度达到200mol?L以上后,细胞存活 率的下降呈时间与MPP浓度依赖;以200i~mol?LMPP 作用细胞6,48h后,OH自由基逐渐增加,48h后SOD开始 收稿日期:2003-04-25:修回日期:2003-05-08 作者简介:傅求真(1964一),女(汉族),江西省抚州市人博士,主治医 师,讲师.Te1.(029)3377230Email.fuqiuz}len@163.net 显着性减少.结论:OH自由基增加是MPP导致多巴胺能 细胞氧化应激的原因,而细胞内自由基的清除机制受损,则最 终导致细胞变性死亡. 【关键词】帕金森病;1.甲基4.苯基.吡啶盐;氧化性应激 【中图号】R742.5;Q514【文献标识码】A O引言 目前虽然对于帕金森病(Parkinson’Sdisease, PD)的治疗取得了一些进展,但帕金森病的病理基 础黑质多巴胺能细胞死亡的机制尚不清楚,氧化应 激学说是可能的机制之一.大量的流行病学研究提 示,许多环境毒素与PD的黑质多巴胺神经元的丢失 有关,神经毒素1.甲基4.苯基.1,2,3,6.四氢吡啶 (MPTP)及其代谢产物1.甲基4.苯基.吡啶盐 (MPP)就是其中之一,它能对多巴胺能神经元造成 选择性损害,产生与PD类似的临床特点及病理改 变.我们应用多巴胺能神经细胞系,在同一体系内 观察在MPP作用下,细胞的存活率以及氧化应激指 标的改变,以期能了解MPP对多巴胺能细胞的毒性 作用机制. 1和方法 1.1材料多巴胺能的人神经母细胞瘤系SH- SY5Y由首都医科大学宣武医院北京老年病医疗研 究中心惠赠.MTI’检测试剂盒(CellProliferationKit) 购自宝灵曼公司;MPP为RB]公司产品;羟自由基 (OH),超氧化物岐化酶(SOD)检测试剂盒购自南京 建成生物工程公司.倒置相差显微镜(OlympusBH- 2),LP400型全自动酶标仪(法国巴斯德公司),紫外 分光光度计(惠普8453型). 1.2方法 1.2.1细胞培养SY5Y细胞以MEM培养基培养, 内加胎牛血清(FBS)比例为1:10,然后分别接种于培 养板和培养瓶中,在37%,50mL?LcO!的培养箱 内培养. 1.2.2细胞存活率测试(MTI’测试)细胞按2000 个/孔接种于96孔板中,48h后外加不同浓度的 MPP于培养基中,使MPP各孔的终浓度分别为 800,400,200,100I~mol?L,,每种浓度做4个复 第四军医大学(JFourthMilMe<tLni,)2003:24(16) 孔,取平均值,对照组不加毒素,分别观察24,48和 72h的细胞存活能力.按M1Tr试剂盒操作, M1Tr是一种四甲基偶氮唑盐,外观呈淡黄色,只有活 细胞才能将其摄入胞内,经线粒体琥珀酸脱氢酶催化 形成蓝色甲瓒颗粒,其形成量反映为吸光度(A)值, 因此其测量值的高低有赖于线粒体功能是否完整,可 以反映细胞的存活状态.加M1Tr10txL/well,37cc, 50mL?L’.CO,4h后,加以0.01mmol?LHC1 溶解的100g?L’.SDS,100txL/well,37cc,50 mL?L’.CO培养箱过夜,使甲瓒颗粒溶解,次日用 酶标仪测定550rllTl,参考波长为620[IITI的各孔 值,取4个复孔的平均值为该处理组的值.细胞 存活率测定公式:细胞存活率=(MPP组平均值 /同一时间点对照组平均值)×100% 1.2.3OH,SOD的测定细胞以6000个/cm接 种于75cm的培养瓶中,2d后外加MPP于培养基 内,达到终浓度为200Ixmol?L,分别收集6,12, 24和48h的细胞.按试剂盒说明书要求以匀浆方法 进行细胞裂解,取上清液以比色法测定蛋白含量及 OH,SOD的含量. 统计学分析:结果以?S表示,用SPSS10.0软 件进行两因素析因方差分析以及LSD法两两比 较. 2结果 2.1MPP对细胞存活率的影响用M1Tr方法检 测到不同浓度MPP(100,800Ixmol?L)作用不 同时间(24,72h)对细胞存活能力有一定的影响 (Tab1). 表1不同浓度MPP作用不同时间对细胞存活率的影响 Tab1EfiectofMPPindifferentconcentrationanddifferent timeonthecellularviability(n=5,?5,% 从MPP作用24h开始,细胞的存活率已开始下 降,但各浓度组间无显着性差异,在浓度为100 tool?L一时,作用48h后,存活率下降至73%,有趣 的是,作用72h后,其存活率不仅没有继续下降,反 而略有上升,达到78%.而MPP一浓度为200,800 Ixmol?L间时,细胞的存活率随MPP浓度的增加 而下降,随作用时间的延长而下降.以两因素析因设 计分析及LSD法两两比较,发现MPP的浓度及作用 时间均分别对细胞的存活率有影响,各组间变化趋势 有显着性差异(P<0.05). 2.2MPP对细胞oH自由基和SOD的影响200 Ixmol?LMPP作用细胞6h后,细胞内OH自由基 开始增加,但未见显着性差异,从12h开始OH自由 基显着性增加,至48h,增加到接近对照组的1.8倍. 200txmol?LMPP作用细胞48h时,SOD出现显 着减少(P<0.01),为对照组的45.4%(Tab2). 表2MPP作用不同时间后细胞内OH自由基及SOD含量 Tab2Cellular0HandSODcontentaftertreatmentofMPP一 (n=4,?S) l840?220l90.0?ll0】8】03602080?230 20?032l?021042l?03 1920?1702550?250a3290?57.0h374. 0?210h 21?0.42.2?0522?0409?0.2 3讨论 应用MTF的方法证实在200,800Ixmol?L之 间的MPP对多巴胺能细胞系SH—SY5Y的毒性作用 随浓度的增加而增加,随作用时间的延长而增加,呈 时间依赖和浓度依赖,与应用其他不同的细胞系的研 究结果相似卜.在此浓度范围内的MPP可以用来 观察其毒性作用机制.而低浓度的MPP(100 Ixmol?L)作用24h,细胞的存活率无改变,48h轻 度下降,而72h后则有所上升.这一现象尚未见有报 道,推测可能是MPP浓度较低,而细胞尚有一定的 代偿能力,而且由于有部分细胞的死亡,残余细胞的 生长空间有所增加而使其增殖速度加快的缘故.根 据M1Tr实验结果,我们选择了200Ixmol?LMPP 作为研究细胞的死亡机制所用的浓度,因为该浓度使 细胞受到损伤而又没有大部分死亡(细胞死亡50% 左右).同时,也选择了较早的时间点即6,12,24和 48h. MPP被多巴胺转运体选择性移入多巴胺能神 经元内并在其内积聚,进入线粒体抑制线粒体的电子 传递链(ETC),因而导致ATP产生的减少和自由基 -二_二 ,一, M I522 的增加,MTI1改变可反映线粒体功能变化所导致的 细胞的死亡.线粒体是体内自由基产生的主要来源 之一,抑制线粒体的电子传递可导致自由基的产生增 加,OH是细胞内毒性作用较强的自由基,而SOD是 主要的自由基清除物质,以上指标可以反映细胞内总 的氧化应激状况. 本实验的主要目的是检测在与PD有关的环境 毒素MPP作用下,多巴胺能细胞生存能力受损状态 和氧化应激指标的改变与细胞变性之间在时间上的 关系.从我们的结果分析可以看出,在12h内细胞内 OH自由基含量大量增加.而细胞本身的抗氧化酶 SOD的减少则发生于48h左右,伴随细胞存活率显 着性的下降,说明在毒素作用的早期,细胞尚有自由 基的清除能力,至后期SOD可能受到氧化而使其含 量减少,逐渐丧失抗氧化及自由基清除能力,细胞发 生不可逆变化而变性死亡.本实验结果与多数研究 者类似实验的结果相一致,但有部分学者持不同 的观点71,其原因可能是由于所用MPP的浓度较我 们所用的为低(5mo1.L), 【参考文献】 第四军医大学(JFourthMilMedLnix)2003:24(16) [1jLinH,SuCJ.Effectsofrepetitivetranscranialmagneticstimulation ont)Tosinehydroxylasepositivestaininginratobupallibusand substantianigra[J].Di—siDaxueXuebao(JFourth_lidIled Univ),2001;22(15):1384—1387. [2]ZhangJ,GrahamDG,MontineTJ,HoYSEnhancedN—meth)l--4一 phenyl一1,2,3.6-tetrahydropyridinetoxicit~inmicedeficientin CuZn-superoxidedismutaseorglutathioneperoxidase:J:J3euro- patholExpNeuro1.2oo0;59(1):53—61 [3jBaiJ,NakamuraH,HattoriI,TanitoM,YodoiJ.Thioredoxinsup— presses1一methyl-4-phenylpyridinium-inducedneurotoxicityinrat 2):81—84. PC12cellsfJ.NeurosciLett,2002:321(1— [4]ChunHS,GibsonGE,DeGiorgioLA,ZhangH,KiddVJ.SonJH Dopaminer~ccelldeathinducedbyMPP(+).oxidantandspecific neurotoxicantssharesthecomnlonmolecularmechanismJJ”一 rochem,200l:76(4):1O10一lO21. [5]YoshinagaN,Murav.amaT,NomuraYApoptosisinductionbado— paminergicneurotoxin.1-methyl-4-phen)lp)Tidiniumion(MPP (+)),andinhibitionbyepidermalgrowthfactorinGH3cellsJ:. BiochemPhar.uwol,2o()0:60(1):111—120. [6]LeeHS.ParkCW,KimYS.MPP(+)increasesthe~Mnerabilityto oxidati~estressratherthandirectlymediatingoxidativedamagein humanneuroblastomacells[J].Exp~uro1.2000;165(1): 164—171. 『7]NakamuraK.BindokasVP.KowlessurD,ElasM.MilstienS. MarksJD.HalpemHJ.KangUJ.Tetrah)drobiopterinscavengessu- peroxideindopaminergicneurons[J:JBiolChem,2001; 276(37):34402—34407. 编辑许昌泰 ??????????????????????????????? ???????????????? ? 经验交流?文章编号:1000—2790(2003)16—1522-01 脾腔静脉人造血管间置分流加断流治 疗门静脉高压症47例 孙嵩洛(河南大学淮河医院普外科,河南开封475000) 【关键词】门静脉高压症;出血;脾腔分流;人造血管;断流 【中图号】R572【文献标识码】B 1临床资料我院1997-01/2002—12采用脾腔静脉人造血管 间置分流加断流治疗门静脉高压症47(男28,女19)例.年龄 15,68(平均4o,3)岁,肝炎后肝硬变门静脉高压症45例,肝 前性门静脉高压症2例.均有呕血,黑便史,出血在3次以上 者24例,全组均有中度或重度食管静脉曲张及脾大,有腹水 者29例,肝功能Child:A级8例;B级26例;C级13例,选 左上腹部L型切口,进腹后经胃网膜右静脉插管测自由门静 脉压力(FPP).常规切除脾脏,钳类脾蒂时尽可能靠近脾门, 在胰腺上缘游离脾动脉,双重结扎,游离远端脾静脉10,15 mm长,测量其直径,脾静脉与直径10帅人造血管(美国格 尔公司生长)端端外翻缝合,吻合后人造血管内注入肝素盐 水,检查吻合口有无漏血.切开横结肠系膜及后腹膜,游离出 下腔静脉约50mill长,钳夹腔静脉前壁切开10mm长.胰尾 及脾静脉通过横结肠系膜孔,人造血管另一端与腔静脉外翻 缝合,间置血管长度30mnl11例;40,50mm29例,60,80 收稿日期:2003-01-24;修回日期:2003..04-03 作者简介:孙嵩洛(1955.),男(汉族),河北省武安市人.副主任医师, 科主任.Te1.(0378)3150796EmailtonglouA123@hotmail.con mm7例,检查吻合口无漏血后,关闭后腹膜及横结肠系膜孔, 测压后行门奇断流,断流时注意高位食管支和胃后支的结扎, 切脾前自由门静脉压为(3.81?0.5)kPa,脾腔分流后下降 (1.11?0.42)kPa,断流后上升(0.24?0.20)kPa,联合手术 后较术前平均下降(0,92?0,35)kPa.本组择期手术4o例, 急诊手术7例,无手术死亡,42例随访3,48no,食管静脉曲 张?肖失29例,明显减轻13例,无再出血41例,黑便1例.无 肝性脑病发生.彩超检查,间置血管均通畅无血栓者. 2讨论门静脉高压症食管胃底静脉破裂出血术后再出血 是外科治疗最棘手的问,也是多年来未完全解决的难题, 分流加断流联合手术近远期止血效果确切,限制性分流保证 了向肝血流量的灌注,降低门静脉高压使门静脉高压性胃病 和肝性脑病发生率降低,两种手术的联合达到优势互补,是一 种较为理想的手术.传统脾腔分流术可因患者脾静脉病 变,游离脾静脉长度不够,脾静脉撕破,张力下吻合等使手术 失败,采用血管间置脾静脉解剖仅需10,15toni,不需过多游 离胰腺,无张力下吻合血管,使分流手术简化,创伤减小,出血 减少,因间置血管短,门,腔静脉间存在压力差,血管不易栓 塞.手术安全,适应证放宽,成功率提高.更有利于联合手术的 广泛开展. 【参考文献】 [1]王字.门静脉高压症的外科治疗:J:中华普通外科杂志. 391. 2001;16(7):389— [2]刘吉奎,蔡景修,董家鸿.门静脉高压症的外科治疗:争论及治 疗方法的合理选择[J].中国实用外科杂志.2001;21(1): 33—34. 编辑许昌泰