酵母表达基因工程产物特性分析

酵母表达基因工程产物特性 《生物工程进展》2001 ,Vol . 21 ,No . 2 酵母表达基因工程产物特性分析 3 刘 文 胡 巍 综述 王洪海 审校 ( )山东淄博学院生物与化学工程系 255013 ( )3 复旦大学遗传所 上海 摘要 本文阐述了酵母表达系统在表达外源基因特别是大分子真核生物基因方面的优越性 ; 分析 了酵母表达系统的局限性 :聚合体的存在 、信号肽加工不完全 、内部降解等而造成的产物不均一现 象 。同时提出了相应的解决办法 。 关键词 酵母 基因工程 表达产物 自七十年代初基因工程问世以来 ,因其具有目 ,即单个多肽通过二硫键结合 它转变成第二种形式 的性强 ,生产速度快 ,产量高等优点 ,很快从实验室 成二聚体 ,最后二聚体之间形成二硫键 ,得到二硫键 阶段发展到应用阶段 ,并取得了一系列的成果 :1978 交联的颗粒 ,它在表现上 、化学性质和免疫性方面都 6 年人胰岛素基因在大肠杆菌中表达 ,1979 年生长激 与血源 HBsAg 类似。目前 ,许多分子生物学学者 素基因在大肠杆菌中表达 ,1980 年人干扰素基因在 对酵母表达系统产生了强烈的兴趣 。 大肠杆菌中表达 ,大肠杆菌为基因工程的迅速发 但是 ,酵母表达系统也有其局限性 。由于表达 展发挥了重要作用 。但是 ,大肠杆菌并不是生产外 的外源蛋白的聚合体存在而影响产率 ,由于信号肽 源蛋白理想的宿主 ,它产生的内毒素会给产品纯化 加工不完全 、内部降解等造成表达产物结构上有差 带来困难 ,其表达的大部分外源蛋白产物也不能分 异现象即不均一现象 ,为酵母表达基因工程产物的 泌到细胞外 。因此 ,人们一方面在努力克服这些缺 纯化和工业化生产带来了困难 。 点 ,另一方面也在探讨其它的表达系统 ,基中最引人 2 酵母表达基因工程产物不均一现象 、原因及解决 注目的是酵母菌 。 表 1 列举了酵母表达的几种目的基因产物经分 1 酵母表达系统的优缺点 离纯化后发现的不均一现象 。酵母表达基因工程产 首先 ,酵母是真核生物 ,毒性比细菌小 ;其次 ,酵 物具有不均一性的报导很多 ,对产物的纯化非常不 利 。下面就产物不均一性的原因及解决的方法加以 母繁殖速度快 ,能进行高密度培养 ,并且能够耐受较 分析 。 高的流体净压 。因此能够大规模地生产 ,具有降低 211 聚合体的形成基因工程产品成本的潜力 ;第三 ,酵母菌表达外源蛋 研究表明 ,大肠杆菌中合成的基因工程产物形 白可分泌到胞外并可以使某些蛋白质糖基化而更加 成了坚硬的包含体 ,它膨胀了细胞壁 ,占据整个细胞 稳定 ,但于产品的分离精制 ;第四 ,酵母菌 ,主要是酿 体积的 20 - 50 % 。酵母中的基因工程产物也能形 ( ) 酒酵母 S accharomyces cerevisiae 的分子生物学研究 成不溶性复合物 。这些复合物的形成可能是由于高 已取得重大进展 ,已完成了 DNA 的序列分析 ,它具 表达的重组蛋白的积累而产生的沉淀现象 ,也可能 有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达 由于某个阶段蛋白质分子之间的离子键 、疏水键或产物的加工修饰及分泌能力 。因此 ,酵母作为基因 工程的表达系统特别是在大分子真核生物基因方面 13 共价键起作用的结果 。疏水的蛋白分子自身也 得到日益广泛的应用 。1981 年 , Hitzeman 等用酵母 α 可能聚集 , 如在干扰素合成时 , 不的二硫键细胞表达人干扰素基因获得成功 ,此后又成功地表 ( ) 1 —5 Cys1 - Cys98 或 Cys29 - Cys138的形成 , 可导致聚 达了其它多种原核和真核生物的基因。酵母生 14 集现象的发生 。另外 ,超滤也可促使外源基因高 产的 HBsAg 在细胞内以颗粒形式存在 ,其中的亚单 氨基酸数量 含信号肽序列 正常序列 降解 作者 年份 7α166 HPLC Hitzeman 分泌型 1 - 干扰素 1983 ()- 3 47 % 45 % ( )- 14 % 7()α166 HPLC Hitzeman 介质内 - 3 36 % 2 - 干扰素 1983 () 胞内 - 3 55 % ()- 8 11 % 8α166 - 8 1 - 166 HPLC Singh 1 - 干扰素 1984 9α166 20 ,000 HPLC Bitter 14500 - 干扰素 1984 13500 12500 11500 9β2内啡呔 31 1 - 31 Bitter - 2 1 - 9 HPLC 1984 - 4 - C18 1 - 19 20 - 30 10甲状旁腺激素 糖基化 1 - 84 84 1 - 26 HPLC Gabrielsen 1990 1 - 84 - C18 27 - 84 糖基化 27 - 84 1124 HPLC 心钠素 N 端缺 4 个 秦宁 1991 - C18 1260 Lehman 蜱抗凝集素 65 肽 60 肽 N 端有缺失 强阳毛细管 1993 电泳 8 α,在细胞培养条件下或基因工 以干扰素为例 早前肽序列 ,但仍保留干扰素活性。 ααα程技术生产的人干扰素往往有聚合体存在 。Ru2 由于在酵母菌中 MF1 启动子和因子分泌信 () binstein 等发现 ,只有在变性条件下 4M 尿素处理, 号能够指导外源基因的合成分泌 ,因此 , Singh 等通 15 α 凝胶 过 滤 才 能 得 到 较 好 的 层 析 峰。Knight 等 发 过 MF1 和干扰素基因连接处寡核苷酸定向缺失诱8 () N 端 的 成 熟 干 扰 素 的 释 放。变导致 了 含 有 天 然 现 ,人类白细胞干扰素以单体 Mr = 20 KD和二聚体 () Mr = 40 KD形式存在 , 通过加还原剂 、SDS 和加热 美国康乃尔大学吴瑞教授实验室构建了一种质粒载 16 方法可使二聚体转化为单体。Rybacek 等应用快 α体 p YA - 4 ,它适合于酵母表达中任何从下游与因 速单抗亲和层析和反相层析串联方法纯化酵母表达 子前导肽编码顺序连接的其它基因 。这个质粒包含 α的人干扰素 ,发现第一峰是单体 ,第三个峰是由二 17 α酵母因子启动子和前导肽的编码顺序直到第 85 硫键连接的寡聚体。类似的例子很多 。从药物 () α个密码子 精氨酸密码子。已知酵母细胞中因子 应用观点看 ,寡聚体没有生物学活性或活性很低 ,并 且明显地影响纯化过程中的产率提高 ,选用一种方 蛋白质前体的成熟加工就发生在这个位置 ,在加工 17 法解聚非常重要。除上面提到的方法外 ,还可以 αα过程中 , 因子前导肽被切除 ,但释放的因子的氨 用盐酸胍 、去污剂等进行解聚 。 基末端仍带有 4 个多余的氨基酸残基 ,它们随被一 212 信号肽加工不完全 酵母表达基因工程产物的α种二氨基肽酶除去从而形成成熟的因子 。经验证 第二个问题是信号肽 明 ,当细胞内有大量外源蛋白合成时 ,酵母二氨基肽 切除加工不完全 ,因此表达的外源基因产物比设计酶的活力不足以除去它们氨基末端的 4 个附加的氨 基酸残基 ,酵母菌自身平衡调节机制受到破坏 ,出现 的多几个氨基酸 。Hitzeman 等发现 , 在酵母表达干 信号肽切除不完全现象 。因此 , 在构建 p YA - 4 载 扰素时 ,正常序列占 64 % , 但仍存在着分别含有信 体时 ,已预先切除了前导肽编码顺序第 85 密码子下 7 号肽上 - 3 、- 8 甚至 - 14 个氨基酸。Singh 等报游的 4 个密码子共 12 个碱基对 ,并在第 85 密码子 α导了酵母表达人干扰素时 ,所分泌的产物 N 端含 处重建了一个 Hind ?位点 ,使它能直接与外源基因 有 8 个多余的氨基酸 ,其中 4 个是由加到干扰素基 的编码相连接 。使用这种质粒载体表达克隆基因可 以绕过对大量二氨基肽酶的需求 ,并使分泌到培养 α因上的 DNA 序列编码的 ,4 个来源于酵母因子的 75 2yeast . Nature . 293 ,717 ,1981 . 。 基中的成熟蛋白不含多余的氨基酸残基李育阳 ,外源基因在酵母中表达产物的分泌 ,生物工程学报 , 2 213 内部降解 酵母表达基因产物的第三个问题是() 1987 ,3 2:81 . 李文清 ,何呜 ,罗进贤 ,黑曲霉葡萄淀粉酶基因在酿酒酵母中 内部降解 。 3 () 的表达和分泌 ,中国科学 B 辑 ,1994 ,24 9:942 . αBitter 等应用酿酒酵母表达人干扰素 ,完整的干扰 王洪海 ,高卜渝 ,陈佩丽等 ,酵母表达基因工程产物不均一性 素 分 子 量 为 20 KD , 主 要 的 降 解 碎 片 分 子 量 为 4 () 分析及对策 ,中国科学 B 辑 ,1994 ,24 12:127 . 1415 KD ,另外还有降解碎片分别为 1315 KD 、1215 KD Stefan Schneider , Michael Buchert , Christopher M. Hovens , An in β9 vitro assay of 2galactosidase from yeast . Biotechniques , 1996 , 20 : 5 和 1115 KD。Gabrielsen 等用酿酒酵母表达人类甲 960 . () 状腺激素 84 肽,和未插入外源基因的原始菌株比 汪恩浩 ,大规模生产重组 DNA 酵母乙肝疫苗工艺概述 ,生物 () 工程进展 ,1993 ,13 4:45 . 较 ,发现多达五条电泳带出现 。序列分析表明 ,只有 6 Hitzeman , R. A. ,Leung , D. W. , Perry ,L . J . et al , Science , 1993 : ( ) 第二条带是正确的 1 - 84, 第一条是 1 - 84 糖基 219 :620 . 7 () 化 ,由于在两个碱性氨基酸 Arg25 ,Arg26的右侧断 Singh A. ,Lugovoy J . M. , Kohv W. J . , et al , Nucleic Acid Res. , ( ) 裂 ,所以又出现了 27 - 84 糖基化 第三条带,27 - 1984 ,12 :8927 . 8 10 () ) (84 未糖基化 第四条带以及 1 - 26 第五条。秦 Bitter G. A. ,Chen K. K. ,Banks A. R. , et al ,Proc . Natl . sci . USA , α宁等用酵母表达化学合成的人工心钠素基因 ,对 1984 ,81 :5330 . 9 α纯化产物的 N 端分析表明 ,人心钠素的前 4 个氨 11 10 Gabrielsen C. S. ,Reppe S. ,Saether O. , et al , Gene ,1990 . 90 :255 . 基酸残基被缺失了。Lehman 等用酿酒酵母表达 11 秦宁 ,魏楠 ,姚锡惠等 ,人心钠素在酵母细胞中的合成与分泌 , ( ) 蜱抗血凝集肽 60 肽 ,MW = 6977Da ,p I = 419,用强 中国科学 B 辑 ,1991 ,1 :62 . 阳离子交换层析 ,出现三个层析峰 ,其中第一峰为 N 12 Lehman E. D. ,Joyce J . G. , Freymeyer D. K. , et al ,Biotech ,1993 , 端缩短了的肽 ,第二峰为正确序列 ,第三峰则是带有 11 :207 . 12 13 Marston F. A. O. ,Review ;Biochem J . ,1986 ,240 :1 . () 信号肽前体中 5 个氨基酸的抗凝集肽 65 肽。 14 Wetxel R. ,Nature ,1981 ,289 :606 . 虽然酵母表达基因工程产物存在不均一性问 15 Rubinstein M. , Rubinstein S. , Familletti P. C. , et al , Pro . Natl . 题 ,但是成功地应用于蛋白分泌的酵母表达系统发 Acad. Sci . USA. 1979 ,76 :640 . 展仍然十分迅速 。酵母提供了一个很好的研究分泌 16 Knight E. ,Fakey D. ,J . Biol ,Chem. ,1981 ,256 :3609 . 表达的系统 ,并将在研究蛋白质分泌机制方面产生 17 Kybacek L . , DandreaM. , TarnowskiS. J . ,J . chromatography , 1987 , 397 :355 许多新观点 。 参考文献 1 Hitzeman R. A. , et al . Expression of a human gene for interferon in The Property Analysis of Genetic Engineering Products Expressed in Yea st Liu Wen Hu Wei Wang Hong2hai ( )Engineering Department of Biology and Chemistry Zibo college ,Zibo 255013 Abstract The review illustrates the advantages of Yeast expresing system in expressing exogenous gene ,especially large molecule eukaryotic gene . The disadvantages of it ,such as the presence of polymer ,the incomplete processing of sin2 gle peptide and the internal degradation of products result in heterogenetity of gene products. Solution to the problems are discussed. Key words Yeast ,genetic engineering ,expression product