壮筋续骨汤对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量和Cbfal基因表达影响的研究

壮筋续骨汤对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量和Cbfal基因表达影响的研究 壮筋续骨汤对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量和 Cbfαl基因表达影响的研究 王力 郑甦 杨凤云 邓运明 王丽华 熊兴勇 (江西中医学院附属医院关节骨科，江西 南昌 330006) 大鼠成骨细胞功能态的影响 方法 采用含药血清的方法体摘要:目的 探讨壮骨续筋汤对 外培养成骨细胞，分壮骨续筋汤组、对照组，观察各组碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量及 Cbfαl基因的表达;结果 壮骨续筋汤组的碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量及Cbfαl基因的表达强于对照组(P,0.05)。结论 壮骨续筋汤能促进成骨细胞功能态的发挥。 关键词:壮骨续筋汤 成骨细胞 碱性磷酸酶比活性 骨钙素 Cbfαl基因 【Abstract】 Objective: To study the effect of Zhuanggu Xutong recipe to the function ，of the SD rats osteoblast . Methods: According to the drug containing serum methods , the osteoblast of SD rats were cultured. They were divided randomly into two groups: Zhuanggu Xutong recipe group and comparison group, the specific activity of alkalinity phosphatase(ALP) , the contents of bone glacontaining protein(BGP) and the expression of core binding factor α1 were observed in each group; Results: the specific activity of ALP , the contents of bone glacontaining protein(BGP) and the expression of core binding factor α1of Zhuanggu Xutong recipe group were higher than comparison group (P,0.05). Conclusion: ，Zhuanggu Xutong can increase the function of the SD rats osteoblast . Key words: Zhuanggu Xutong recipe Osteoblast Specific activity of alkalinity phosphatase Bone glacontaining protein Core binding factor α1 体外培养细胞，有两种基本状态:即增殖态和功能态。功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。本研究以中药壮筋续骨汤作为研究对象，采用中药血清药理学的方法体外培养成骨细胞，观察其对碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量及Cbfal基因的表达等功能态的影响。 1 实验材料 1.1 仪器与试剂 倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)、CO培养箱(德国Heraeus);DU650 紫2 外分光光度计(美国BECKMAN);α,MEM (HyClone)、新生牛血清(NCS, HyClone)、青,链 霉素溶液(HyClone)、HEPES (上海生工)、胰蛋白酶(1:250,AMRESCO)、β,甘油磷酸 _______________________________________________________________________________ 基金项目:江西省自然科学基金课题(课题编号:0640170) 钠(β,GP,Sigma)、地塞米松(Sigma)、VitC(上海化学试剂公司)、碱性磷酸酶(ALP) 和总蛋白试剂盒(南京建成生物工程研究所)、骨钙素(BGP)放免试剂盒(中国原子能科学研究所)、DU650 紫外分光光度计(美国BECKMAN);9600 基因扩增仪(美国PE生物系统公司); GEL DOC 2000凝胶成像系统(美国BIORAD);MILLI-Q Biocel 超纯水装置(美国MILLIPORE); 64R 低温高速离心机(美国BECKMAN);TRIZOL试剂(华美);Taq酶(上海生工);反转录酶(上海生工);引物(上海生工合成)等。 1.2壮筋续骨汤的制备 当归10g、菟丝子20g、西党20g、补骨脂20g、刘寄奴20g、川芎10g、白芍10g、杜仲10g、桂枝10g、三七10g、煅狗骨10g、木瓜310g、熟地40g、川断15g、五加皮15g、骨碎补30g、黄芪30g、蛰虫10g,上药加双蒸水8倍，浸泡2小时，煮沸1小时，收集药液，再加双蒸水6倍，煮沸1h，收集药液，再加双蒸水，煮沸1小时，合并三次药液，以3000r,min离心30min，取上清，4?冰箱保存。 1(3实验动物的购买及饲养 SD大鼠60只(清洁级30天龄)，雌雄各半，每只体重280?20g，购自浙江省实验动物中心。动物进入动物实验中心后适应性饲养三天，给予普通饲料饲养、自由活动、自由饮水、通风、光照充足、温度在21?，相对湿度控制在70,80%，动物的饲养在江西中医学院动物实验中心进行。 2 实验方法 2(1动物的分组:按实验要求对实验动物进行随机分组，共分成2组:壮筋续骨汤组(A组)30只、对照组(B组)30只。 2(2动物灌胃:灌胃时分别制成1g/ml生药的混悬液200ml，，一日剂量分2次灌胃，每次灌1g/ml生药0.25ml/100g，第4天1次灌胃全天剂量，采血前禁食12小时，末次给药1小时后采血。对照组的大鼠给予等量生理盐水灌胃。 2(3含壮筋续骨汤血清的制备:各组灌胃后，氯胺酮0. 5ml/100g，安定0. 5ml/100g min离心15min，腹腔注射，待麻药起效后腹主动脉取血，取血后静置1h后，以3000r,分离血清，取上清液，再经0.22μm的针头滤器过滤除菌，56?水浴，30分钟灭活，-20?冰箱保存备用，血清制备完成。 2(4成骨细胞的分离与培养;取1,2日龄的SD大鼠乳鼠的颅盖骨，以胰酶-胶原酶消化法分离获得成骨细胞。具体方法为:?取新生SD乳鼠1,2天龄2只，75%的酒精中浸泡3,5分钟并且用薄膜封闭;?揭去头顶皮肤，剪下头盖骨，并且将头盖骨置入PBS溶液中;?清除骨膜、血管等软组织，再用PBS液清洗3次后将洗净的头盖骨剪成1mm×1mm的小片;?将小骨片移入0.25%胰蛋白酶(3,5ml)以覆盖为度，37?预消化20分钟; ?再将组织块移入0.1%?型胶原酶溶液(3,5ml)中37?振荡(60次/分)90分钟;?将0.1%?型胶原酶消化过的组织液即细胞悬液在1000r/min的离心机上离心10分钟后吸 的NCS、10mmol/Lhepes液取上清液;?将沉淀的细胞团块加入培养液(培养液为含10% 1ml、100μ/ml青霉素-链霉素1ml的α-MEM，并且用7.4%的NaHCO3调节PH值在7.2,7.4范围)吹打并且加至10 ml;?细胞计数后分装25 ml的培养瓶中置于倒置显微镜下观察后放入CO2培养箱37?培养24小时后贴壁2,3天换液一次等到汇合长满培养瓶时就开始传代即原代培养结束。 2.5 碱性磷酸酶比活性的测定:每组各设3孔，各组分别诱导至第1、3、6、9、12天进行碱性磷酸酶比活性的测定，测定时取培养液，分别按碱性磷酸酶和总蛋白试剂盒说明书进行操作，碱性磷酸酶比活性计算:碱性磷酸酶比活性(U/mg)=碱性磷酸酶活性(U/L)?蛋白浓度(mg/L)。 2.6骨钙素含量测定:每组各设3孔，各组分别诱导至第6、12、18、24天分别取培养液进行骨钙素含量的测定，按骨钙素放免试剂盒说明书进行操作。 2.7运用RT-PCR法观察壮筋续骨汤对成骨细胞分化过程Cbfαl mRNA的表达的影响:分别在3、6、9、12、18天采用RT-PCR 法检测Cbfα1 mRNA 的表达(每天共三瓶)，并与对照组对照;(1)总RNA 的提取: 在各培养瓶中分别加入TRIZOL 1ml，按试剂说明书提取，最后加适量无RNA酶的超纯水溶解，稀释60倍以紫外分光光度计测A260，A280 的值，计算出浓度及纯度;(2)反转录 取1ug 总RNA，oligo(dT) 0.5ug，加DEPC处理去18 离子水至11ul，70? 5min后依次加5×buffer 4ul，10mM dNTP mix 2ul，rRNasin 20U，加DEPC处理去离子水至19ul，37? 5min，取出加反转录酶(M-MuLV)200U后42? 60min，70? 10min 结束反应;(3)PCR反应体系:DEPC处理去离子水18.3ul，10×buffer 2.5ul，10mM dNTP mix 0.5ul，25pmol β-actin 上下引物各0.2ul，Cbfα1上下引物各0.4ul， ? 4min 后进入循环，94? 30s, 2.5U/ul Taq 酶0.5ul。总反应体系25ul。反应温度，94 62? 30s, 72? 30s，35个循环，72? 10min。引物:Cbfα1 sense 5’-GAG GGC CAC AAG TTCTAT CTG GA-3’; Cbfα1 antisense 5’-GGT GGT CCG CGA TGA TCT C-3’, β-actin sense 5’-CCC ATT GAA CAC GGC ATT -3’ , β-actin antisense 5’-GGT ACG ACC AGA GGC ATA CA -3’。产物放在1.5,凝胶上电泳，凝胶用GEL DOC 2000 凝胶成像系统扫描分析，计算Cbfα1 表达量与β-actin 表达量的比值。 3(统计方法:采用单因素方差分析，所有数据分析均在SPSS12.0软件上进行，以,=0.05为显著性差异。 4. 实验结果 _4.1 碱性磷酸酶比活性测定结果(U/mg，?S): x 组别 时 间(天) 1 3 6 9 12 A组 1.2100?0.2867* 2.1331?0.2583* 2.0856?0.0355* 1.5081?0.3293* 1.1323?0.0861* B组 1.0535?0.0167 1.4053?0.0980 1.1705?0.0197 1.2587?0.1051 1.0816?0.0445 *表示使用SPSS12.0软件分析在同一时间点与B组比较P,0.05，有显著性差异. _4.2骨钙素(BGP)含量测定(ng/ml，?S) x 组别 时 间(天) 6 12 18 24 A组 0.1464?0.0047* 0.3417?0.0015* 0.5056?0.0511* 1.1813?0.1129* B组 0.0840?0.0037 0.1436?0.0100 0.2236?0.0146 0.6005?0.1210 *表示使用SPSS12.0软件分析在同一时间点与B组比较P,0.05，有显著性差异. _ 4.3 各组cbfα1基因 的相对表达量(n=10, ?S) x 组别 时 间(天) 18 3 6 9 12 A组 0.5331?0.1231 0.6920?0.1352 0.9351?0.1457* 1.6360?0.1572* 1.7552?0.1230* B组 0.5350?0.1241 0.7952?0.1213 1.1362?0.2181 1.3522?0.1252 1.3274?0.1100 *与相应对照组比较， P<0.05 4 讨论 骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝;其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化 而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。 [1]中药血清药理学最初由日本学者田代真一在1985年提出，它是指将中药或中药复方经口灌服动物一定时间后采取血液、分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种方法学。中药血清药理学提供了利用现代化手段来研究中医药，从细胞、分子、基因水平研究中药的作用与其机理的方法，并有助于中药化学成分研究及中药药动学研究的深入，为中药与西药的研究在实验方法上找到了结合点。它既具有体外实验条件可控性强、药物效应易于检测，便于从细胞生物学和分子生物学来角度入手则可深入揭示药物作用机理，又能够防止中药组制剂本身的理化性质对实验的干扰，还能反映中药在胃肠道消化吸收，再经生物转化，最后产生药理效应的真实过程，其原有成分或在体内转化为活性成分，或代谢后失活，或没有被吸收入体内，或通过第二信使而间接起作用都可以通过血清药理学反映出来，理论 [2]上更具备科学性、真实性。 核心结合子α(core binding factor a,Cbfα)Cbfαl是骨形成的关键基因,又是成骨细胞(0B)分化和功能的中心调控因子，是0B分化最早且最具特异性的标志，决定着成骨细胞的发生与分化， Cbfαl在成骨部位的高表达以及在骨形成过程中的重要作用，提示它是成骨分化不可缺少的转录因子。成骨细胞又称为骨形成细胞，由具备多向分化潜能的间充质细胞、前成骨细胞分化而来，一旦完成终末分化，分泌产生各种细胞外基质蛋白，并控制骨基质的矿化过程。Cbfαl可与骨钙素基因(Bgp)的启动于区0B特异性的顺式作用元件 specificcis-acting element)2结合，是0B分化所必需的。Cbfαl除对0SE(osteoblast— [3]成骨细胞的发育和分化有作用之外，还对骨基质的沉积率有调节作用。细胞分化并不是最后目的，成骨细胞进行分化之后，必须完成它们的功能，细胞外基质沉积和逐渐矿化。 cbfαl的生物学特征提示它的功能不仅限于发育和分化。首先，cbfαl在出生后及整个成骨细胞分化阶段都保持着表达;其次，Cbfαl是骨钙素的主要调节因子，骨钙素基因在胚胎发育处于静止状态，而在成熟的成骨细胞是非常特异的表型。这两个特点使cbfal能在决定这些细胞的命运及保持它们的功能方面起作用。 肾主骨，藏精，骨的愈合、生长有赖精血的充养，正如《黄帝内经》曰:“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也，„„，其充在骨”、“肾生骨髓”、“肾之合骨也”。中医临床已充分证实使用中药补肾益精能使骨愈合加快，治疗骨折迟缓愈合、不愈合效果明显。壮筋续骨汤出自《伤科大成》，由当归、菟丝子、西党、补骨脂、刘寄奴、川芎、白芍、杜仲、桂枝、三七、煅狗骨、木瓜、熟地、川断、五加皮、骨碎补、黄芪、土鳖虫等组成，具有补益肝肾、 [4]强筋健骨之功效。自从1962年刘润田首次报道中药促进骨折愈合的动物实验研究以来，人们根据中医理体系和现代科技成果，采用各种不同实验手段和方法，从不同角度进行了深入的研究，并取得较为理想的结果，显示出中医药促进骨折愈合的优势。既往研究的主要成果有:中药能促进骨折部位骨基质钙盐沉积，提高骨痂质量，促进生长激素的分泌及具有提 [5] [6][7] [8]高BMP的含量、促进成骨细胞分泌TGF-β等对骨生长因子的调控作用等。 本课题主要通过血清药理学的方法来探讨壮骨续筋汤对成骨细胞功能态影响以及中药血清药理学方法在分子生物学中的应用。从分子生物学水平探讨补肾强骨类中药促进成骨的机制，旨在为中药促进骨折愈合，治疗骨折迟缓愈合、不愈合以及中药在骨组织修复工程中的应用等提供科学依据，也为新药开发、中医药现代化研究提供科学的理论依据。 成骨细胞功能成熟，除了细胞形态的变化，ALP活性增强和细胞外基质钙化是两个重要 3-标志。ALP是成熟成骨细胞的标志酶之一，其主要作用为水解有机磷酸酶，使局部PO浓度4升高，结合钙，启动钙化。在钙化期，细胞逐渐出现变性，其分泌的胶原纤维亲和钙盐，形成钙化结节。所以壮骨续筋汤水提物促进骨愈合作用，主要通过增强成骨细胞内ALP的活性、增加BPG的含量和加强Cbfal基因的表达而发挥作用。 参考文献 [1] 田代真一.じト由来培养细胞ぎ用ぃた汉方药理学研究系の开发。和汉医药学会志， 1985，2:106,107. 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