耐盐菌株的筛选及其促生作用研究

耐盐菌株的筛选及其促生作用研究 沈阳农业大学学报 ，，,2009)0640(3)360-362 Journal of Shenyang Agricultural Universit，y2009)06，40(3),360-362 耐盐菌株的筛选及其促生作用研究 311233刘延吉 ，王靖 ，田晓艳 ，栾美英 ，李冠男 ，王坤 ,沈阳农业大学 生物科学技术学院 ，沈 阳 ,辽宁石油化工大 学 环境与生物工程学院 ，辽 宁 抚 顺 ,1.1101612.113001 3.辽宁营口沿海产业基地 ，辽 宁 营 口 115003, 摘 要 ,利 用 氨 基 环 丙 烷羧 酸 为 唯 一 氮 源 ，从辽宁省营口沿海产业基地的植物 11(1aminocyclopropane1carboxylic acid, ACC) ------ 根 际 盐 碱 土 中 ，快 速 筛 选 出 了 82 株 具 有 ACC脱氨酶活性的菌 落 。其 中 7 株 的 ACC脱氨酶活性较 高 ，初步的耐盐检测发现,各 菌 株 在 6%盐 浓 度 的 TSB培养基中仍可生 长,并且菌株对草籽 生长有一定的促生作用 ，其 中 菌 株 GP1和 GP2的促生作用最为显 著 ，根 系长度分别比对照提高 29%和 28%， 且 GP1 和 GP2 的 ACC 脱 氨酶比活力分别比作为对照的枯草芽孢杆菌的酶比活力提高了 和 。 867%719% 关 键 词 ,植 物 促 生 菌 ,ACC 脱 氨 酶 ,促 生 作 中 图 分 类 号 ,文 献 标 识 码 , 文 章 编 号 , ,,S156.4 A 1000-1700200903-0360-03 用 Selection for Salt-tolerant Bacteria and Its Promoting Effect on Plant Growth 112333LIU Yan-ji, WANG Jing, TIAN Xiao-yan, LUAN Mei-ying, LI Guan-nan, WANG Kun (1.College of Biological Science and Technology, Shenyang Ag ricultural University, Shenyang 11016hin1a, ; C2.Envrionmental Technology and Biotechnology College, Liaoning University Poef troleum and Cheimcal Technology, Fushun Liaoning 11300Ch1i,na; 3.LiaoningY ingkou Coastal Industrial Base, Y ingkou Liaoning 115003C, hina) Abstract,With 1 -aminocyclopropane -1 -carboxylic acid (ACC) as a sole nitrogen source, 82 rhizobac teria of promoting plant growth (PGPR) were quickly selected from saline s oil in Liaoning Yingkou coastal indus trial base 7 strains of them displayed higher activities of ACC deaminase. All of the 7 bacterial isolates could tolerate 6% NaCl in TSB culture medium. And these strains (especially GP1 and GP2), promoted the growth of grass seed signi ficantly and increased roo t length of grass seed inoculated wi th GP1 and GP2 ,29% and 28% respecitvely,. Their enzyme ac tivities of ACC deaminase increased 867% and 719% compared wi th Bucillus subtilis . Key words,plant growht-promoingt rhizobacteria; 1- aminocyclopropane1-carboxylic acid deaminase; growth promoingt- 土壤盐碱化 问题是目前 全球最严重 的环境问题 之一 ，由于不 适当灌溉 ，植被破坏以 及人口膨胀 等各方面因 [1]盐碱地改良是一 素影响，大面积土地没有得到合理开发利用，逐渐生成新的次生盐碱化土壤盐碱化进程加速。, 项复杂而艰巨的工作，而在当今提倡生态效益为重的前提下生物改良措施已成为研究的热点。 耐盐碱植物与植, 物促生菌的 应用是生物 改良的两 个主要方面 ，本课题组已 在耐盐碱苗 木的筛选 、鉴 定以及耐 盐机理方面 做了大 [2][3]量 的 研 究 ， 为 辽 宁 营 口 沿 海 产 业 基 地 民 兴 河 地 区 筛 选 出 适 宜 草 种 。 植 物 促 生 菌 (plant growth -omoting pr rhizobacteria,PGPR) 可 以 通 过 间 接 产 生 抗 生 素 和 分 泌 铁 载 体 等 方 式 抑 制 或 减 轻 植 物 病 害 对 植 物 产 生 的 不 良 [4]影 响,并通过解磷 、固氮、产生植 物激素 、酶 解降低乙烯 水平等方式 直接刺激 和 调 节 植 物 生 长。 其 中,一 种 含 1-氨 基 环 丙 烷-1-羧 酸(1-aminocycol-propan-e1-carboxylic acid, ACC脱) 氨 酶 的 PGPR受 到 了 各 国 科 研 工 作 者 的 关 注。它能水 解植物体内 生物合成乙 烯的直接前 体 ACC,产生羟 基丁酸和氨 ，阻止乙烯的 释放 。 当这种 菌附着在种 子表皮时 ，它 能水解 ACC,降低 种子在逆境 条件下大量 产生的植物 生长抑制 剂和植 物 衰 老 促 进 剂 ——乙 烯 的 浓 [5]度,促进根伸 长和植物 生长。 本研究 从辽宁营口 沿海产业基 地 的 植 物 根 际 盐 碱 土 中 ，筛 选 耐 盐 菌 株 ，为 获 得 高 效 PGPR，为辽宁 环黄 、渤海“五 点 一 线 ”开 发 建 设 项 目 的 盐 碱 地 绿 化 提 供 理 论 依 据 ，为 21 世 纪 盐 土 农 业 时 代 的 收 稿 日 期 ,2009-01-10 基 金 项 目 ,辽 宁 ,营 口 ,沿海产业基地盐碱地绿化工程项目 ,, A20060921 盐碱 地改良 、治理 提供技术参 考 。作 者 简 介 ,刘 延 吉 ,,，男 ，沈阳农业大学副教授 ，博 士 ，从事植物耐盐生理 、细胞信号转导研究 。 1959) 供试 土 样 采 自 辽 宁 省 营 口 市 咸 水 河 与 民 兴 河 边 碱 蓬 的 根 际 土 。供 试 购 于 上 海 皓 元 化 学 科 技 有 限 ACC 公 司 ,供 试 草 籽 品 种 为 Top Ganvyegras 。s 供 试 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bucillus subtilis)由 沈 阳 农 业 大 学 植 物 保 护 实 验 室 提 供 。 1.2 方法 [6]1.2.1 ACC 脱 氨 酶 活 性 细 菌 的 富 集 和 分 离 称 取 土 样 1g 悬 浮 于 50mL 的 PAF 液 体 培 养 基中 ，28?振 荡 培 养 24h后 ，转移 1mL 悬浮液至另 一 50mL 的 PAF 液体培 养基 ，同条件 培养 24h后 ，转 移 1mL 悬浮液 至 50mL 的 DF [7][7]培养液中 ，同条件培养 24h 后，转移 1mL 悬 浮 液 至 50mL 的 ADF 培 养 液中 ，同 条 件 培 养 24h。 梯 度 稀 释 ADF 培养液 中菌悬液后 ，涂布于 ADF 平 板，28?恒温培养 72h 后，从 ADF 平板上 挑取形态不 同的单菌落 ，于 ADF 平 [8]板上 反复纯化后 保存于 TSB斜 面 培养基。 1.2.2 ACC 脱氨酶活性 的检测 将分 离所得的菌 株在 TSB培 养 液 中 过 夜 培 养 ，4?离 心 收 集 ，用 DF 培 养 液 [不 加(NH)SO]洗涤离心 2 次，重新悬浮 于 ADF 培养液 ，28?振 荡培养 24h，以 诱导产生 ACC脱 氨酶 。 4?离心收 集 424 -1-1 菌 体 ，用 0.1molLTrisHCl 缓 冲 液(pH 值 为 7.6)洗 涤 离 心 2 次 ，重 悬 浮 于 600μL 0.1 molLTrisHCl 缓 冲 液 --??(pH 值为 8.0) 中， 加入 30μL 甲苯并迅 速振荡 30s 以破 碎细胞 ， 转 移 200μL 含甲苯的细 胞提取物, 加 入 20μL 1 [6][6]- 0.5 molLACC混 匀。 ACC脱 氨酶活性的 测定方法参 照刘维红等的方法 。ACC 脱 氨 酶的单位 酶活为在测 酶? 体系中每分 钟形成 1molα丁酮 酸的活性 。 蛋 白质的测定 采用 Bradford比色 法 ， 以牛 血 清 白 蛋 白 为 蛋 白 质 标 μ- -1准。 比 活力(Umg)为单位 酶活除以酶 蛋白浓度 。 取 ACC脱氨酶 比 活力较高的 7 株菌株进行 后续试验 。 ? 1.2.3 酶 活 菌 株 耐 盐 性 初 步 检 测 将 过 夜 培 养 的 GP1、GP2、GP3、GP4、GP5、GP6 和 GP7菌 株 的 菌 悬 液 接 入 促 生 试 验将 、、、、、和 菌 株 接 种 于 培 养 液 中 ，下 振 荡 培 养 1.2.4 GP1GP2GP3GP4GP5GP6 GP7 TSB 28? 到24h 后，离心收集用无菌水 洗涤离心 次 后重悬浮于 无菌水中 ，在 处 用 无 菌 水 调 整 菌 悬 液 光 密 度 为 4?,2 600nm 0.5NaCl浓 度 分别为 0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%的液 体 TSB培养基 中 ，28?震 荡 培 养 24h， 在 600nm波 ? 0.02，即可得到菌 悬液 。 将供 试 草籽浸于 70%酒 精消毒 5min，再 用 10%的 双 氧 水 表 面 消 毒 5min，最 后 用 无 菌 水 长下测量 各处理菌 液的 OD 值，用 OD 值 来 表 示 其 在 梯 度 盐 浓 度 培 养 基 中 培 养 的 生 物 量 ，OD 值 越 大 ，则 表 明 [8,9][10]洗 4:5 次。 室温下 将种子浸 于菌悬液 、枯 草芽孢杆菌 悬液和无菌 水 ,CK,中 12h 后，置于 培养皿中 用 无 菌 水 生 物湿 量润的滤纸 就越大 上。,每皿放置 20 粒 饱满种子 ，28?恒 温暗培养 7d 后，测根长和 茎叶长 ，试验 设 3 次重复 。 结果与分析2 2.1 ACC 脱氨酶活性 细菌的富集 与分离结果 PAF 培 养 基 中 含 有 一 定 量 的 甘 油 ，在 PAF 培 养 基 中 的 培 养 有 利 于 假 单 胞 菌 的 富 集 ，并 且 可 以 抑 制 培 养 -1基 中真菌和放线菌的生长。DF 是一种以(NH)SO(2.0g?L)为氮源的基本培养基，而 ADF 是一种以 424 1-ACC(0.3033gL) 代替(NH)SO作为唯 一氮源的基 本培养基 。通 过 PAF、DF 和 ADF 培养基 定向富集筛 选 ，试验?424 共 获得 ACC脱 氨 酶活性细菌 共 82 株。 脱氨酶活性 检测结果2.2 ACC 由图 1 可知，筛 选出的细菌 脱氨酶活性 差异性较大 。 菌株 GP1和 GP2的 酶 比活力明 显高于其他 各菌株 ，分 -1 -1别 为 ,0.2602?0.0069,Umg和 ,0.2204?0.0058,Umg， 菌 株 GP3、GP4、GP5、GP6 和 GP7的 酶 比 活 力 较 为 接 ?? 近 ，而枯草芽孢 杆菌的 ACC脱 氨 酶比活力 很低 ，趋近于 0。 2.3 菌株的耐盐 性检测结果 由图 2 可知，7 个 菌株都表现 出一定的耐 盐性 ，当 NaCl浓 度 低于 5%时，菌株 GP4、GP5 和 GP7表 现 出 较 高 的 生 物 量 ，盐 浓 度 高 于 5%后 ，GP4、GP5 和 GP7菌 株 的 相 对 生 物 量 明 显 下 降 ，而 菌 株 GP1和 GP2相 对 平 稳 ，当 盐 浓 度 达 到 8%时 ，GP1 和 GP2的 相 对 生 物 量 最 高 ，OD 值 分 别 为 0.306和 0.332，GP7 的 最 低 ，菌 株 GP1和 ??362 卷第 沈 阳 农 业 大 学 学 报 40 图 1 部 分 菌 株 的 ACC 脱 氨 酶 比 活 力 图 2 酶活菌株耐盐性 Figure 1 Enzyme activities of ACC deaminase of strains Figure 2 Salt resistence of bacterium 表 脱氨酶活性细菌对草 籽 生长的影响 1 ACC 促生试验结 果2.4 Table 1 Effect of Acc deaminase on grass seedling growth 各 酶 活 菌 株 对 草 籽 都 有 一 定 的 促 生 作 用 ，菌 株 根 长/mm 根 相 对 伸 长/% 茎 叶 长/mm 茎 叶 相 对 伸 长/% 但 不同 酶活菌株的 促生效果 不同 。由 表 1 可 知，各Bacteria Root ength Relative rootength Stak ength Relativest ak length lllll 活 ※※33.8?1.0 34.9?2.4 GP1 129 124 ※※性菌株对 草 的 根 和 茎 叶 都 有 促 生 效 果 。 活 性 菌 33.4?0.2 33.7?2.5 GP2 128 120 ※※29.9?1.8 32.7?0.7 株GP3 114 117 ※※29.6?2.3 32.3?1.4 GP4 113 115 的 促 生 效 果 最 为 显 著 ， 可 使 根 相 对 伸 GP1 29.5?1.9 ※GP5 120 105 31.3?1.7 长30.8?1.3 ※GP6 30.1?1.9 115 110 ※129%，茎 叶 相 对 伸 长 124%。 而 不 具 有 ACC脱 氨 33.4?3.6 ※31.1?2.4 119 119 GP7 讨论3 27.4?2.8 酶 活性的枯 草 芽 孢 杆 菌 处 理 的 草 籽 与 对 照 相 比 99 98 Bucillus subtilis 25.9?1.8 28.1?0.9 无 明显差异 ，可见它对 草籽并无促 生作用 。 采 用 定 向 富 集 筛 选 的 方 法 可 以 简 化 细 菌 筛 对 照(CK) 26.1?1.1 100 100 ※注 ,表 示 LSD 检验与对照差异显著(p<0.05, 。选 工 作 。 以 ACC为 唯 一 氮 源 ，可 从 土 壤 中 快 速 ※Note: means significant relatotive contr astby LSD a5%t level. 筛 选 到大量 具有 ACC 脱氨酶 活性的植物 根际细 菌 。本 研究结果表 明 ，株 均能不 同程度的促 进植物生长 ， 菌 株 、的 脱氨 酶活性最 高 ，稳定性 最 7 PGPR GP1GP2 ACC [11]好 ，能够使根和 茎叶相对伸 长 和 。 经研究 表明 ，凡是具 有 脱氨酶活 性的菌株都是 。 从129%124%ACC ,PGPR 植物根际盐 碱土中筛选 出的 PGPR相对 于 肥沃土壤中 筛出的 PGPR更 能 适应 盐 碱 环 境 ，所 以 用 于 盐 碱 地 改 良 、 盐碱地绿 化 ，更具有实 用性 。 在 菌 株耐盐性的 初步检测中 可以把这些 菌株大致分 为两类 ,一 类是在无盐 培养基 中 生 长 最 好 ，随 着 培 养 基 盐 浓 度 的 增 加 ，菌 株 生 长 情 况 越 来 越 差 ，例 如 菌 株 GP1和 GP2,另 一 类 是 在 无 盐 培 养 基 中 生 长 的 并 不 很 好 ，在 一 定 盐 浓 度 范 围 内 ，随 着 盐 浓 度 的 增 加 ，菌 株 生 长 越 来 越 好 ，盐 浓 度 超 出 范 围 后 ，随 着 盐浓度 的增加 ，菌量 逐渐减少 ，例 如菌株 GP4。 由 于菌株在盐 胁迫培养基 中的生长状 况是与培养 基的营养 状况 有密切关系 ， 以上菌株 之 所以可以在 6%NaCl培养基中 依 然能够生长 ， 这 与 TSB培 养 基丰富的营 养有直接关 系 。 虽 然 菌 株 可 以 在 高 盐 浓 度 的 培 养 基 中 生 长 ，但 与 盐 碱 土 壤 的 环 境 存 在 一 定 区 别 ，所 以 对 于 盐 碱 地 土 壤 李 兰 晓王 海 鹰杨 涛等土壤微生物菌肥在盐碱地造林中的作用西北林学院学报[1] ,,,.[J].,2005,20(4):60-63. 刘 延 吉,张 珊 珊,田 晓 艳,等.盐 胁 迫 对 NHC 牧草叶片保护酶系统 、MDA 含量及膜透性的影响[J].草 原 与 草 坪,2008,127(2):30-34. [2] 改 良、盐碱地绿 化中的应用 尚需进一步 的研究工作 。 田 晓 艳,刘 延 吉,郭 迎 春,等.辽宁营口沿海产业基地民兴河盐碱土对 3 种引进草种耐盐性的影响[J].草 业 科 学,2008,25(8):63-67. [3] 参考文献 ,吉 云 秀,黄 晓 东.植物促生菌对燕麦初生苗盐分胁迫下的促生效应[J].大连海事大学学报,2007,33(3):86-89. [4] 许 煜 泉,石 荣,林 志 新.具 有 ACC脱氨酶活性及抗枯萎病菌的假单胞菌 株 B*8[J].上海交通大学学报,1999,33(2):206-209. [5] 刘 维 红,闫 淑 珍 ,杨 启 银 ,等 .ACC脱氨酶活性细菌筛选及其对番茄初生苗生长的影 响 [J].江 苏 农 业 科 学 ,2006,(2):80-84. [6] [7] 岳 海 涛.具 ACC脱氨酶活性解盐促生菌筛选及其对棉花吸收离子的影 响[D].石 河 子:石 河 子 大 学,2007. [8] 刘 秀 花,梁 峰.小麦根际促生菌的筛选与促生作用研究[J].安 徽 农 业 科 学,2006,34(20):5300-5301. [9] 莫 文 萍.棉花解盐促生菌的筛选及其解盐促生机理的初步研究[D].石 河 子:石 河 子 大 学,2006. 王 春 霞王 道 本周 启棉花根际促生菌的分离和筛选华中农业大学学报[10] ,,.[J].,1996,15(3):233-236. [11] 王 灿 华,祝 新 德,许 煜 泉,等.假 单 胞 菌 株 M18 分泌羧基吩嗪抑制黄瓜枯萎病害[J].上海交通大学学报,2000,34(11):1574-1578. 编辑 马迎杰[]