HPLC柱后衍生化法在伏格列波糖质量控制中应用的研究

HPLC柱后衍生化法在伏格列波糖质量控制中应用的研究 HPLC柱后衍生化法在伏格列波糖质量控制中应用的研 究 :. , 九原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师组的指导下,独立进行 研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个 人或集体已经发或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和 集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。:锄,饼 日期:/工年汐乡月面 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影 印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 ,,“‘ 、, 日期:/年,么月沤司 靴做储:锄互呼摘要 柱后衍生化法 在伏格列波糖质量控制中应用的研究 研究生:靳玉祥 导师:郭昱彤教授 郑州大学药学院药物系 中国郑州 摘要 糖尿病是以慢性高血糖为特征的一组异质性代谢性疾病,由某种原因造成 胰岛素绝对或相对缺乏所引起,以慢性高血糖伴碳水化合物、脂肪和蛋白质的 代谢障碍为特征,糖尿病的患者人数也随着人们生活水平的提高而逐年上升。 目前处于研究阶段的口服糖尿病药物有口服胰岛素制剂、促胰岛素分泌剂、 胰 岛素增敏剂、.葡萄糖苷酶抑制剂等四类。 伏格列波糖是一种新型的【.葡萄糖苷酶抑制剂,由日本武田药品工业株式会 社开发研制,并于年上市,其商品名为倍欣。与其它【.葡萄糖苷酶抑制剂 相比,伏格列波糖具有活性高、剂量小、胃肠道内副作用小等优点。由于分 子 中并无共轭结构和生色团,伏格列波糖无法采用/、/等分析 方法进行检测。国内外研究者曾采用过厂『、/、/、 柱前衍生.、柱前衍生.、柱后衍生荧光分析法等分析法。与其它 分析方法相比,柱后衍生荧光分析法具有选择性好、’灵敏度高等优点,适 合用于伏格列波糖及其制剂的质量控制中。 本文建立了一种用于伏格列波糖及其制剂质量控制的柱后衍生荧光分 析方法,并对可能影响伏格列波糖峰面积的柱后衍生因素进行了考查。 本研究主要分为两个部分:第一部分主要是柱后衍生荧光分析方法的 建立及优化;第二部分是柱后衍生因素的考查。这两部分的主要内容如下: .柱后衍牛荧光分析方法的建立及优化 . 采用 . ;含不同浓度辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲 液为流动相:荧光检测器检测激发波长为,发射波长,设为 ;牛磺酸和高碘酸钠为衍生试剂:反应浴温度,衍生反应管长内摘要 径,.:冷却浴温度,冷却管长内径,. .柱后衍生因素的考查 本部分采用单因素实验考查了形三通接法、反应浴温度、冷却浴温 度、衍生试剂浓度、伏格列波糖浓度、流动相与衍生试剂流速及二者的流速 比 等柱后衍生因素对伏格列波糖峰面积的影响,结论如下: 形三通的接法对伏格列波糖峰面积影响不大,但对其理论塔板数有一定的 影响。 在一定范围内,伏格列波糖峰面积随着反应浴温度的升高而变大。 在一定范围内,冷却浴温度对伏格列波糖峰面积基本无影响。 伏格列波糖峰面积随着衍生试剂浓度的增加先增加再减小,随着伏格列波 糖浓度的增加而变大。流动相流速、衍生试剂流速对伏格列波糖峰面积的影 响 较为明显。 关键词:柱后衍生柱后衍生因素糖尿病口服抗糖尿病药物一糖苷酶抑 制剂伏格列波糖 : : ,, .’码 . ,? , . , ?,仅.,.,, 【 , . , / /. .朗//,/, ,?, ? .. ? , .:? ; . :.枣? 岬 , , ,甜 ,。, 。 ., .. ? , , ,,, . ? : . ,., . ,. . :, ,, ,. , 目录 目录 摘要. ...?.?...?..?.?......?.?...?..?.................................. ....?. 文献综述. 第一章前言? .糖尿病简介?.. .口服抗糖尿病药物简介??。 ..口服胰岛素制剂..促胰岛素分泌剂? ..胰岛素增敏剂?。 ..洳葡萄糖茴酶抑制剂.伏格列波糖及其分析方法? .本研究的研究思路:? .本研究的意义.. 第二章伏格列波糖柱后衍生条件的建立及优化??. .实验材料、试剂与仪器..实验材料。 ..试剂. ..仪器. ..高效液相柱后衍生系统.流动相及荧光衍生试剂溶液的配制 .. .磷酸盐缓冲溶液的配制?. .. .磷酸盐缓冲溶液的配制? .. .%辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制.. .%己烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制.. .%烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制.. .%辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制??. ..荧光衍生试剂溶液的配制 .伏格列波糖标准储备液的配制目录 ..伏格歹波糖含量测定标准储备液的配制 ..伏格列波糖溶出度测定标准储备液的配制..伏格列波糖有关物质测定标 准储备液的配制.. .结果与讨论?. ..柱后衍生系统的建立..含量测定液相条件的优化??。 ..溶出度测定液相条件的优化?.. ..有关物质液相条件的优化??.. .小结? 第三章柱后衍生因素的考查.实验材料、试剂与仪器..实验材料.. ..试剂. ..仪器。??. .高效液相柱后衍生系统.液相及柱后衍生条件 .流动相、荧光衍生试剂及伏格列波糖储备液的配制..流动相溶液的配制??。 ..荧光衍生试剂溶液的配制??.. ..伏格列波糖储备液的配制??。 .实验方法.结果与讨论?. ..预实验?。 ... 形三通接法的影响??. ...反应浴温度的影响 ...冷却浴温度的影响 ..柱后衍生冈索的影响?.. ...反应浴温度的影响 ...衍生反麻温度、衍生反廊管的影响? ...衍生试剂浓度、伏格列波糖浓度的影响 ...衍生试制浓度、流动相流速/衍生试剂流速比例的影响??。 ...冷却浴温度、流速对峰面积的影响.小结? 目录 第四章结论??.. 参考文献??:? 附录??. 致谢??. 综述 文献综述 柱后衍生技术应用研究进展 高效液相色谱技术 是一种 快速、高效的分离分析技术,该技术自上世纪七十年代问世以来已广泛应用于 医药工业、临床卫生、石油化工等领域【】。尽管技术己成为一种广泛应用 的分离、分析手段,但其与气相色谱技术相比仍有些许不足。紫外检测器、荧 光检测器在高效液相色谱技术中得到了广泛的应用,但其对没有紫外吸收或荧 光的化合物却无法进行检测【】。这些化合物需经过化学衍生使得其具有紫外吸收 或荧光,从而使其能够采用紫外、荧光检测器进行分析。 待分析样品的化学衍生法分为柱前衍生法. 和柱后 衍生法. 两种,样品进行衍生的主要目的为提高分析方 法的选择性和灵敏度。柱前衍生技术是指在色谱柱前使待分析样品与衍生 试剂反应,衍生产物在色谱柱上进行分离再进入检测器进行分析。柱后衍 生技术是指待测定样品在色谱柱上进行分离后,在色谱柱后进行化学衍生的技 术,待测定样品进行柱后衍生后通过紫外或荧光检测器进行检测,其灵敏度、 选择性得到了提山 。。这两种分析方法均有其优点和缺点。 与柱前衍生法相比,柱后衍生一般需增加一台高效液相色谱 泵以输送衍生试剂,这增加了对设备的;同时由于样品在色谱柱上分离后 与衍牛试剂需进行衍生反应,柱后反应器的引入必然导致死体积的增加,因此 样品色谱峰的柱效也会下降。但对柱后衍生来说,在色谱柱上进行分离 的为待分析样品而非衍生产物,这避免了衍生试剂及衍生副产物对色谱柱的影 响:另外,的柱后衍生反应不必进行的完全,并且对衍生产物的稳定性要 求不高,柱后衍生分析方法的重现性良好即可。 柱后衍生分析技术的应用日益广泛,并见诸于国内外的文献报道。 本文根据近年来的国内外文献报道,对柱后衍生技术的研究进展进行了 综述。综述 .柱后反应检测系统 .普通柱后衍生反应检测系统 近年来分析工作者采用各种柱后反应检测系统对待测定样品进行柱 后衍生分析,图为一典型的普通柱后衍生检测系统的示意图。待分析 样品在进样后随流动相在色谱柱上进行分离,与衍生试剂在混合器中混合,然 后在反应器中进行柱后反应器中进行柱后衍生反应并进入检测器进行检测,柱 后反应器应控制其反应温度以确保柱后衍生分析的重现性,有时会在柱 后反应器和检测器之间加入冷却器以降低进入检测器的衍生产物温度。 等【】采用该检测系统对健康志愿者尿液中的去甲变肾上腺素、多巴胺、酪 氨酸、 .羟色胺、和色氨酸等化合物进行了检测,待分析样品在未进行预处理的情况 下 依然取得了足够的选择性、灵敏度。 废液 图典型的普通柱后衍生反应检测系统示意图 .固相反应器柱后衍生反应检测系统 图为一固相反应器柱后衍生反应检测系统示意图,进样后待分析样 综述 品在色谱柱上进行分离,然后进入固相反应器进行柱后衍生反应,衍牛产物 进 入检测器进行检测,有时在固相反应器的前后会添加缓冲液以改变其。 掣】采用此类柱后衍生反应检测系统对麻痹性贝毒进行了分析,固相反 应器为一个空色谱柱.,内部装有.的颗粒,在固相反 应器前后分别泵入.磷酸盐缓冲液、.磷酸溶液以调节其,研究结 果表明:尽管此衍生反应会产生多种产物,且其比例随着、温度等条件的改 变而改变,但是该衍生反应仍能应用于麻痹性贝毒的柱后衍生分析。 进样器 . 图固相反应器柱后衍生反应检测系统示意图 .光反应柱后衍生反应检测系统 在上述前两种中柱后衍生反应检测系统中,待分析样品均与化学衍 生试剂发生柱后衍生反应从而进行检测,此外也有分析工作者将光化学反应应 用于柱后衍生分析中。在此类柱后衍牛反应系统中,由于衍生试剂为光, 因此不用另外增加输送衍生试剂的泵,也不会留下未反应的衍生试剂:同时衍 生试剂.光的引入不需任何溶剂,因此待分析样品在该类柱后衍牛分析中 不会被稀释。在光化学柱后衍生反应检测系统中,柱后反应器有流通型 .和缠绕型.两种类型:前者为一个小体积的流通池,外 部采用一合适的光源照射,后者则为一段缠绕的聚四氟乙烯或石英材质的管线, 一般采用光照强度较大的光源;在选择柱后衍牛反应的光源时应考虑光源的波 长分布、照射强度、形状、光源的数量等因素,氢灯、氘灯、汞灯、氙灯等光 源均被应用于光化学柱后衍生检测系统【】。 等【】采用光反应柱后衍生反应检测系统对红酒、白酒中的白藜 芦醇、云杉新甙进行了分析。在其采用的柱后衍牛反应系统中,样品在 色谱柱.上进行分离,其柱后反应器为缠绕着的长度为的聚四氟 综述 乙烯反应管,光源为氙灯,实验结果表明:经紫外光照射后,衍生产物的 荧光强度比白藜芦醇、云杉新甙大大增强,其检测限分别为..和. .~。等【采用光化学柱后衍生反应检测系统对谷类植物中的 黄曲霉毒素进行了分析,结果表明:黄曲霉毒素经紫外光波长照射后, 其荧光特性明显增强,其检测限和定量限分别为....和....一。 柱后衍生技术的应用 . 柱后衍生技术在黄曲霉毒素检测中的应用 ,?】是由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等微生物在合 黄曲霉毒素,【 适的温度、湿度条件下产生的次级代谢产物,该毒素于上世纪年代初被发现。 这类化合物的结构及其相似,均为二氢呋喃香豆素的衍生物。黄曲霉毒素的毒 性远远高于氰化物、砷化物,黄曲霉毒素是目前已知化合物中致癌性最强的化 合物,广泛存在于玉米、花生及其它食品或饲料中。目前,国内外均对食品、 饲料中的黄曲霉毒素的限量做出了规定,如在年世界卫生组织规定食品中 黄曲霉毒素的最高允许浓度为.,而欧盟则规定人类生活消费品中黄曲 霉毒素的含量不得超过..。目前,国内外对黄曲霉毒素检测主要有 薄层色谱法、荧光分光光度计法、免疫化学分析法、高效液相色谱法等。这些 分析方法各有优点和缺点,但薄层色谱法、免疫化学分析法的灵敏度及特异性 很难满足国内外标准中黄曲霉毒素限量的要求。 黄曲霉毒素自身具有荧光特性,但其容易在含水溶液中发生荧光猝灭。因 此,近年来国内外的分析工作者曾分别采用柱前衍生化荧光检测法、 柱后溴衍生化荧光检测法、柱后碘衍生化荧光检测法、柱后光化学 衍生化荧光检测法等法对黄曲霉毒素进行了检测【 。掣”】采用 柱前衍生化法对黄曲霉毒素进行了分析,并对其进行了优化。在此柱前衍 生化法中,样品与衍生试剂三氟乙酸进行衍生,然后在三个不同的色谱柱 .,.;.,;.,.上进行分离,实验数据表 明:较短的色谱柱.,.的分析时间较短且其灵敏度较高,更适合 用于黄曲霉毒素的检测。等【】采用柱后溴衍牛化荧光检测法对可 柱, 可豆样品中的黄曲霉毒素进行了检测,待分析样品在免疫亲和柱 综述 上进行净化,然后再进行柱后衍生检测,其检测限可达到./。 等【 】采用柱后碘衍生化荧光检测法对大麦颗粒中的黄曲霉毒素进 行了检测,待分析样品在进行过预处理后进行柱后衍生分析,其检测限 可达到./。等【】采用光化学衍生化荧光检测法对谷类作物中 的黄曲霉毒素进行了检测,样品经预处理后进行柱后衍生荧光检测,其检测 限 和定量限分别为....和.。..~。 柱前衍生化法的灵敏度较高,但该分析的操作较为繁琐、耗时较长 且容易受其它因素的影响。在柱后衍生化方法中,与柱后溴衍生化荧光 检测法相比,柱后碘衍生化荧光检测法的衍生条件较为宽松,其灵敏度较 高、衍生结果较为稳定。与前两种柱后衍生技术相比,光化学柱后衍生荧 光化检测法没有引入任何的化学衍生试剂,其操作也较为简单。 . 柱后衍生技术在生物胺检测中的应用 生物胺 是一类含氮的低分子量碱性有机化合物的总称,其 广泛存在于肉类、蔬菜、发酵类食品及酒中,主要由氨基酸经微生物的降解作 用而生成【 .。在这些食品发生变质时,这些食品或酒中会含有大量的生物胺, 这些生物胺主要有组胺、酪胺、腐胺、尸胺等,这些生物胺已被认为肉类、蔬 菜等食品是否发生变质的标志。此外,组胺、酪胺等化合物还会人体皮肤、胃 肠道、神经等部位的过敏反应【. 。因此近年来国内外研究对生物胺的检测进 行了研究,有些国家还对食品中生物胺的量进行了规定【】。 由于多数的生物胺没有较好的紫外吸收和荧光特性,因此分析工作者一般 采用柱前衍生化技术和柱后衍生技术对生物胺进行检测。在采用 柱前衍生化技术对生物胺进行检测时,衍生试剂一般为邻苯二甲醛、二硝 基甲酰氯、丹磺酰氯掣.。采用柱后衍生化技术对生物胺进行检测时, 衍生试剂多为荧光胺、邻苯二甲醛等。如杨文军等【】建立了一种反相色谱 柱后 衍生法,该分析方法以邻苯二甲醛为衍生试剂,对生物组织中酪胺、亚精胺、 腐胺、尸胺的含量进行了测定,结果表明:其专属性强、准确度及精密度较高, 这几种生物胺的最低检测限可达./。等【】分别建立了一种 柱前衍生分析方法和柱后衍生分析方法对金枪鱼罐头和冰冻鲱鱼中的生 物胺进行了检测,这两种分析方法均采用小粒径的色谱柱.、、分别 综述 以丹磺酰氯、邻苯二甲醛为衍生试剂。与采用普通粒径色谱柱岬的分析方法 相比,等建立的分析方法分析时间及溶剂消耗均有所减少。 . 柱后衍生技术在氨基甲酸酯农药残留检测中的应用 氨基甲酸酯类农药【习是一种高效、广谱型的农药,其代表品种主要有西维 因、呋喃丹、涕灭威、巴沙等。氨基甲酸酯类农药的作用机制为与昆虫神经传 导中的乙酰胆碱酯酶结合以抑制其活性,使其无法水解乙酰胆碱,从而阻断昆 虫的神经传导并导致其死亡。这类农药在进入人体后也会产生类似的作用,因 此其对人体及环境均有害。鉴于氨基甲酸酯类农药的广泛使用及其毒性,国内 外分析工作者采用酶抑制法、生物传感器法、法、法、法等技术 对氨基甲酸酯类农药的残留进行检钡】。 郝学飞等【】分别采用柱后衍生法、./技术对蔬菜中中常 用的氨基甲酸酯类农药进行了测定,并对两种分析方法进行了对比,研究结 果 表明:两种分析方法均能对种氨基甲酸酯农药取得良好的分离效果及良好的 峰形;柱后衍生、./的回收率及检出限分别为.%..%、 ../、.%.%、... /。郝学飞等人的对比研究表明, 柱后衍生法、./两中分析方法均能用于对氨基甲酸酯类农药残留的测 定,但./的灵敏度较高且分析速度较快。与./相比, 柱后衍生化应用于氨基甲酸酯类农药的优点在于其所需设备较为简单,更易 于 实现。 任红波等【】对.法、柱后衍生法检测蔬菜中氨基甲酸酯类农药 残留进行了对比研究,两种分析方法的回收率分别为%.%、.%,两者 /? ./。对比研究表明,. 的检出限分别为././、 的灵敏度较高,但.法不能检出蔬菜中对热不稳定的氨基甲酸酯类农药残 留。与.法相比,柱后衍生法的优点在于其测定的氨基甲酸酯类农 药品种齐全。 . 柱后衍生技术在药物分析中的应用 药物分析是分析化学在药学领域的具体应用。随着分析化学的发展,药物 综述 分析已经从专门的技术发展成为一门新的科学.药物分析学,药物分析学具 体包 括药品质量控制、体内药物分析、法医毒物分析等领域【。柱后衍生技术 作为一种选择性好、灵敏度高的分析方法,已应用于药品质量控制、体内药 物 分析等药物分析领域。 双氢青蒿素是一种对青蒿素结构修饰而来的抗疟药,其分子结构无共轭结 构和生色团。吴婧等【】采用一种柱后衍生法同时对双氢青蒿素和哌喹进 行了测定,结果表明:双氢青蒿素、哌喹与碱性试剂进行衍生后,重排形成了 共轭结构,两者在处均有紫外吸收;双氢青蒿素、哌喹分别在 ..?/、../内线性良好;两者的检测限分别为../、 ./。另外吴婧等【】还采用柱后衍生法测定了青蒿素酯的含量并得 出了类似的结论。等【】建立了一种灵敏度高、重现性好的检测普瑞巴林及 其杂质的柱后衍生荧光方法,并能够应用到普瑞巴林片的分析中。 除了用于药品的质量控制,柱后衍生化技术还被应用于人体内药物浓 度的检测。如等【建立了一种柱后衍生分析方法,用于监测完整 的顺铂在血液中的浓度,该方法所需的仪器设备较为简单、易于实现。 等?】采用柱后衍生分析方法监测尿液中卡托普利的浓度,样品在色谱柱 上分离后与衍生试剂进行衍生反映,然后再进入检测器进行分析,其检测波 长 为。与普通的分析方法相比,柱后衍生分析方法的灵敏度较 高,其检测限和定量限分别为/、/。 .结语 柱后衍生化技术提高了分析方法的灵敏度、改善了分析方法的选择性。 作为一种分析手段,柱后衍生化技术在黄曲霉毒素的检测、生物胺的检测、 药物分析等领域均取得了广泛的应用。柱后衍生系统的设计己日趋,目前 市场上已出现商品化的柱后衍生检测系统。随着国内外分析工作者进一步研究, 柱后衍生化技术也一定会得到更广泛的应用。 第一章前言 第一章前言 .糖尿病简介 随着人们生活水平的提高,糖尿病患者的人数也在逐年提升。据国际糖尿 病基金会估计【】,在年全世界范围内.岁的糖尿病患者有.亿,到 年糖尿病患者的人数将会上升到.亿。糖尿病【】已成为继心血管疾病与 肿瘤之后的严重影响人类健康的疾病。 糖尿病【】是以慢性高血糖为特征的一组异质性代谢性疾病,由某种原因造 成胰岛素绝对或相对缺乏所引起,以慢性高血糖伴碳水化合物、脂肪和蛋白质的 代谢障碍为特征。糖尿病患者的主要临床表现为“三多一少”,即多饮、多尿、多 食、体重减少,长期患病的患者还会引起糖尿病并发症。糖尿病并发症分为急 性和慢性两大类,急性并发症有糖尿病酮症、低血糖反应、感染等,慢性并发 症有大血管病变、微血管病变、神经病变及糖尿病足等并发症,其中糖尿病微 血管病变包括糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变以及糖尿病外周神经病变是糖尿 病后期常见的并发症,严重影响了糖尿病患者的生活质量【弼】。 糖尿病在临床上主要分为胰岛素依赖型糖尿病型糖尿病和非胰岛素依 赖型糖尿病型糖尿病两种【。胰岛素依赖型糖尿病,即型糖尿病,是由于 某种原因造成胰岛细胞的破坏,从而引起胰岛素绝对缺乏的疾病。该病其发 病机理上不明确,可能与遗传、环境等因素有关【加】。型糖尿病多发病于儿童、 青少年时期,随着年龄的增长,发病率有所下降,在目前的糖尿病患者中型 糖尿病约占.%【。通过注射胰岛素来控制高血糖、维持生命一直是治疗 型糖尿病的最丰要手段,但该方法有低血糖、体重增加等副作用,还给患者带 来了疼痛以及牛活不便。随着分子生物学技术及现代医学的进步,目前出现了 胰岛移植、肝细胞技术及基因疗法对型糖尿病进行治疗【】。非胰岛素依赖型 糖尿病,又称为型糖尿病,是胰岛素分泌相对不足以及胰岛素作用环节的不 健全而导致的血糖浓度水平升高的疾病,其发病机制主要有细胞分泌胰岛素 不足和周围组织的胰岛素抵抗等两个环节。该病多在岁之后发病,占糖尿病 患者的%以上。型糖尿病的发病是多种因素引起的,与遗传、环境等因素 有关,常见的型糖尿病多伴有肥胖或体重偏重。对于轻度型糖尿病患者, 第一章前言 可以通过调节饮食、坚持适量运动锻炼来控制血糖浓度;而对于通过饮食、运 动无法控制血糖浓度的糖尿病患者,一般通过口服抗糖尿病药物来控制血糖, 从而延缓或阻止糖尿病并发症的发生,改善糖尿病患者的生活质量。在上述方 式均无效的情况下,即可开始口服降糖药物和胰岛素的联合治疗。 .口服抗糖尿病药物简介 目前处于研究阶段和治疗糖尿病的口服抗糖尿病药物主要有口服胰岛素制 剂、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、【一葡萄糖苷酶抑制剂等四类。 ..口服胰岛素制剂 胰岛素是由胰岛细胞分泌的能够降低血糖浓度的一种蛋白质激 素,和于年从胰腺中分离出了胰岛素,并因此获得了诺贝尔 医学奖【引。从此以后胰岛素便一直是治疗糖尿病,尤其是型糖尿病的丰要药 物。但胰岛素用于治疗糖尿病,多采用皮下注射给药,其他给药方式并不常见。 由于糖尿病患者多为长期用药,采用注射给药的方式给患者带来了痛苦和不良 的心理影响,从而降低了治疗的依从性。尽管胰岛素注射笔的发明从部分上消 除了胰岛素注射给药的弊端,但对于糖尿病患者来说口服给药依然是最理想的 给药途径。 早在年,就曾经尝试口服胰岛素的途径来治疗糖尿病,但是其 效果并不理想?】。这是由于肽类或蛋白质药物在经胃肠道时会被胃肠道内的蛋 白酶水解,从而无法发挥药效;另外肽类或蛋白质的分子量往往较大,而无法 在胃肠道内被吸收【。近年来国内外有许多关于口服胰岛素制剂的报道,有的 掣】分别以甘氨胆酸钠、胆酸钠、脱 甚至已处于临床研究阶段。 氧胆酸盐为载体材料采用逆向蒸发法制备了包含胰岛素的脂质体,动物实验表 明:与普通口服制剂相比,这些脂质体在经口服后能够提高血液中的胰岛素浓 %。 度水平,并且具有持续降低血糖浓度的作用,其相对生物利用度可达到 等】以聚乳酸羟基乙酸乳化膜为载体材料将胰岛素制备成纳米粒子, 然后将这些胰岛素纳米粒子装填入肠溶胶囊中,体外实验结果显示:胰岛素在 .时的突释明显减少:体内实验表明,其生物利用度可达到.%。. 第一章前言 等 】采用乳化.化学交联法以戊二醛为交联剂、壳聚糖为载体材料将胰岛素制备 成微球,体内试验研究表明:与皮下注射胰岛素相比,该制剂经口服后也能够 明显地降低了动物体内的血糖浓度。谢坤【驯在专利 中公布了一 种用“微胶囊”技术制备口服胰岛素干粉的方法,实验研究表明该口服胰岛素干粉 能够明显延长胰岛素的半衰期,能够较好的降低、维持血糖水平。总之,目前 口服胰岛素制剂尚处于研究阶段,相信随着制剂技术的改进,口服胰岛素制剂 的生物利用度也会得到进一步提高,该制剂也会实现临床应用。 ..促胰岛素分泌剂 非胰岛素依赖性糖尿病是胰岛素分泌相对不足的一种疾病。促胰岛素分泌 剂是通过促进胰岛细胞分泌胰岛素,从而提高糖尿病患者体内的胰岛素浓度、 降低血糖浓度的一类药物。按照化学结构的不同,促胰岛素分泌剂可以分为磺 酰脲类和非磺酰脲类两种【。 磺酰脲类降糖药通过与胰岛细胞上的特异性受体结合,抑制敏感的 通道,外流减少、内流增加,从而促进胰岛素分泌的增加闭】。该类药 物按其发明时间的先后又可以分为三代,其共同的化学结构为 。第一代磺酰脲类降糖药主要有甲苯磺丁脲、氯 磺丙脲等,第一代磺脲类药物作用较弱,已逐渐被第二、三代 磺酰脲类降糖药所代替;第二代磺酰脲类降糖药主要有格列波脲、 格列吡嗪、格列本脲?锄、格列喹酮、格列齐特 等,第二代磺脲类药降糖作用要比第一代强,副作用也较轻且发生率 也比较低,其降糖作用的强弱为格列本脲、格列波脲、格嗪、格列齐特、 格列喹酮,格列本脲作用强而持久,格列喹酮作用较弱,其排泄仪%经肾排泄, 为同时患肾病、糖尿病的首选药物:第三代磺酰脲类降糖药主要有格列美脲 等,第三代磺酰脲类降糖药除了具有前两代降糖药的作用机制外, 还能够增加组织对胰岛素的敏感性,另外该类药物剂量较小,目前上市的格 列 .。 美脲片剂其规格仪为 非磺酰脲类降糖药主要有美格列定及其类似物、美格列奈 、瑞格列定、瑞格列奈、那格列定 、吗啉胍类化合物】。该类药物作用机制与磺酰脲类降糖 药相似,其不同之处在于其与胰岛细胞的结合部位不同,其特点是起效快、 第一章前言 作用时间短、耐受性好、安全性高,尤其适用老年人、肥胖以及肾功能不全 的 糖尿病患者【蚓。另外该类药物的作用强度与患者体内的血糖水平正相关, 因而 其可以有效地模拟胰岛素的生理分泌,其“进餐时用药,不进餐不服药”的用 药原 则给用药带来了更大的灵活性【。 ..胰岛素增敏剂 胰岛素抵抗,即体内组织对胰岛素的敏感性下降,是型糖尿病患者的主 要显著特征。胰岛素增敏剂 ,又称“胰岛素增敏因子”,其降糖 作用不依赖胰岛素分泌的增加,而是通过加强胰岛素的介导发挥降糖作用的。 胰岛素增敏剂类药物包括双胍类药物和噻唑烷二酮类药物。 双胍类药物主要有苯乙双胍、二甲双胍以及丁双胍等。该类药物的作用机 制为增加胰岛素与受体的结合,从而促进了细胞对葡萄糖的无氧酵解、抑制阻 止呼吸和肝糖元异生【”。上世纪五十年代,苯乙双胍、丁双胍、二甲双胍在法、 德等国已有较多应用,但由于苯乙双胍、丁双胍可能会引起乳酸中毒等不良反 应,因此苯乙双胍、丁双胍在国外发达国家已基本停止使用,苯乙双胍在国内 的临床应用也较少,目前丁双胍在国内并无临床应用. 。二甲双胍不单能控制 糖尿病患者的血糖,而且还能防治糖尿病患者的并发症,其在临床上的应用十 分广泛。由于二甲双胍半衰期较短、普通制剂生物利用度低,目前市场上已有 关于二甲双胍的缓释制剂,并且国内外文献中也有关于二甲双胍的文献报道。 如 等【】制备了二甲双胍的缓释微丸制剂,并考察了该制剂在体内外的溶 出行为,结果表明:二甲双胍的缓释微丸的体内外释放行为有着良好的相关性; 与普通的二甲双胍片剂相比,其生物利用度大大提高。 噻唑烷二酮类药物是近年来新研制的增加胰岛素敏感性的口服降糖药,主 要有曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮、达 格列酮、环格列酮、恩格列酮等。环格列 酮、恩格列酮是最早被开发出来的噻唑烷二酮类药物,由于其较低的药效、严 重的不良反应已被淘汰【。曲格列酮是第一个用于治疗型糖尿病的噻唑烷二 酮类药物,该药由日本三共制药公司研制,于年被美国获准上市, 但在随后的肝功能监测中发现其具有肝毒性,并且有该药导致死亡的病例报道, 随后该药撤出市场【.删。罗格列酮、吡格列酮分别由葛兰素史克、日本武田制 药研制,并于年由美国获准上市【。目前罗格列酮、吡格列酮在困第一章前言 内分别上市,除了单方制剂外,目前国内还将其分别与二甲双胍组成复方制剂 用于治疗型糖尿病,其剂型主要为普通片剂、口腔崩解片、分散片、胶囊剂, 并无缓控释剂型上市。吕青远【】在专利中公布了一种酒石酸罗格 列酮缓释片的制备方法,该缓释片减少了糖尿病患者的服药次数,但目前并没 有在国内上市。 ..仅一葡萄糖苷酶抑制剂 仅.葡萄糖苷酶抑制剂是一类通过抑制小肠上端的仅.葡萄糖苷酶活性从而延 缓碳水化合物吸收以实现治疗糖尿病的口服降糖药,该药对型、型糖尿病 患者均使用【。目前该类药物的品种主要有阿卡波糖、米格列 醇.、乙格列酯、伏格列波糖。米格列醇,其先导 化合物为.脱氧野尻霉素,其结构与葡萄糖相类似,是由德国拜耳公司于上世 纪研制成功并上市的一种铲葡萄糖苷酶抑制剂。该药可用于型糖尿病患者的 治疗,从而可以减少餐后高血糖的发生和胰岛素的用量,另外也可用于单靠饮 食疗法无法控制血糖的型糖尿病患者哪】。阿卡波糖也是由德国拜耳公司研发 并上市,也是第一个用于治疗型糖尿病的【一葡萄糖苷酶抑制剂,伏格列波糖 是日本武田制药株式会社研发并上市的仅.葡萄苷酶抑制剂,目前除乙格列酯外, 上述几种铲葡萄糖苷酶抑制剂在国内均已上市,其剂型主要为片剂、胶囊剂。 本类药物的副作用主要有腹胀、肠鸣音亢进偶有腹痛、腹泻】。 .伏格列波糖及其分析方法 伏格列波糖,其化学名为羟基一一羟甲基一乙胺一羟甲基环己烷,,, 四醇分子结构式如图.所示,是一种是从放线菌培养液中发现的天然糖类似 物,属于.葡萄糖苷酶抑制剂类口服降糖药,由日本武田药品工业株式会社开发 研制,其商品名倍欣,该药于年首次在日本上市【朋】。 第一章前言 图.伏格列波糖分子结构式 伏格列波糖的作用机制是对双糖水解酶有着较强的抑制作用,对.淀粉酶的 抑制作用较弱,这样有些未转变为双糖的碳水化合物在进入大肠前已被消化吸 收,而不会进入大肠内分解产酸、产气。因此,与其它【.葡萄糖苷酶抑制剂相比, 伏格列波糖的剂量较小.,其肠道内的副作用也较小。王吉影等【】对两种 .葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖、伏格列波糖治疗型糖尿病的疗效与安全性进行 了评价比较,其在原治疗不变的基础上加服阿卡波糖或伏格列波糖剂量分 别为、.,结果表明:两者均为有效降低餐后血糖和的药物, 两者对空腹血糖、餐后血糖的控制的疗效相同,两者的疗效、安全性均良好。 总之,与其它的【.葡萄糖苷酶抑制剂相比,伏格列波糖有许多优势,如较高 的活性、用药剂量小、肠道内的副作用较小、对【一葡萄糖苷酶的选择性较 高。 然而作为一种天然糖类似物,伏格列波糖并无共轭结构,因此伏格列波糖无法 采用.或/来检测,国内外许多的分析工作者对伏格列波糖 的检测进行了报道。王翰斌,陈刚等【】在专利中公布了一种伏格列波糖及其制 剂的高效液相分析测定方法,该方法运用伏格列波糖的紫外末端吸收. 对其进行分析测定,但是由于伏格列波糖片剂的规格仪为.,在进行溶出度 测定及含量测定时很难满足检测要求。王欣荣,孙敏等【】报道了. 法在伏格列波糖生产中的应用,其中井岗霉醇胺、伏格列波糖的最低检测限分 别是/、/,然而其线性曲线的均与其最低检测限很接近,而且伏格 列波糖片的规格仪为.,因此采用.法测定伏格列波糖的灵敏度 较低,很难符合伏格列波糖及其制剂检测的要求。曾洁【】用.法对伏 格列波糖口腔崩解片中伏格列波糖的含量进行了测定,该方法的灵敏度同样很 低,因此在对灵敏度要求较高的情况下.法很难满足伏格列波糖及其 制剂的质量控制的要求。楼永明【『建立了一种柱前衍生的气相色谱方法对伏格 第~章前言 列波糖片的含量进行测定,该方法以。甲基咪唑为催化剂,从而使伏格列波糖 与乙酸酐进行乙酰化反应、以正三十二烷为内标用气相色谱进行测定。 等【】用高碘酸钠、.甲基..苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物与伏格列波糖进行柱 前衍生,衍生产物在普通碳十八色谱柱上进行分离从而测定伏格列波糖片的含 量。张秀玲、左文坚掣‘】采用普通的反相色谱柱,建立了一种柱后 衍生荧光测定伏格列糖片含量及有关物质的方法。等【巧同样也采用 法柱后衍生荧光测定了伏格列波糖片的含量的方法,并对衍生管长、衍生温度 对伏格列波糖峰面积的影响进行了考查。在这些分析方法中,柱后衍生荧 光法的选择性好、灵敏度较高,比较适合用于伏格列波糖及其制剂的质量控制。 .本研究的研究思路 通过文献调研,/、/、柱前衍生法、柱前衍 生法等方法在伏格列波糖质量控制中的应用均有报道。与其它分析方法相比, 柱后衍生荧光分析技术选择性好、灵敏度好,具有应用于伏格列波糖质量 控制的潜力。 本研究设想建立一种柱后衍生荧光分析方法,用于对伏格列波糖及 其制剂的质量进行控制。在进行柱后衍生分析时,一般均采用自行组建 的柱后衍生系统。因此,本文将对可能影响柱后衍生系统的柱后衍生因 素进行了考查。 .本研究的意义 随着人们生活水平的提高,糖尿病患者的数量也在逐年提升。在上述四类 口服降糖药中,口服胰岛素目前还处于研究阶段,促胰岛素分泌剂、胰岛素增 敏剂均有着各种不良作用。伏格列波糖,作为一种新型的仅一葡萄糖苷酶抑制剂, 其在肠道内的不良反应较小,且其活性较高、剂量较小。 在关于伏格列波糖检测的报道中,柱后衍.牛荧光分析法的选择性好、 灵敏度较高,适合用于伏格列波糖原料及其制剂质量的控制。柱后衍生荧 光分析法是指被分析物在色谱柱上进行分离后与荧光试剂进行衍生反应,然 后衍牛产物随流动相进入检测器进行检测的分析方法。目前国内外市场上均有 商业化的柱后衍生装置,然而该装置的价格昂贵。因此许多分析工作者多自行 第一章前言 组建柱后衍生系统来进行柱后衍生分析。在柱后衍生荧光分析法中, 衍生管长度、衍生反应温度、冷却温度、冷却管长度、衍生试剂浓度、衍生试 剂及流动相的流速等柱后衍生因素均有可能影响伏格列波糖的峰面积。而在关 于柱后衍生荧光分析伏格列波糖的文献报道中,仅等【】对衍生管长、 衍生温度对伏格列波糖峰面积的影响进行了考察。综上所述,在进行柱后 衍生荧光分析时,尤其采用自行组建的柱后衍生系统的情况下,考查柱后衍生 因素对伏格列波糖峰面积的影响很有必要。 第二二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条什的优化 第二章伏格列波糖柱后衍生条件的建立及优化 .实验材料、试剂与仪器 ..实验材料 伏格列波糖原料上海天伟生物制药有限公司批号: ..试剂 二水合磷酸二氢钠 生产厂家:国药集团化学试剂有限公司;批号: ,分析纯 十二水磷酸氢二钠 生产厂家:国药集团化学试剂有限公司:批号: , 分析纯 磷酸 生产厂家:国药集团化学试剂有限公司;批号: , 分析纯 辛烷磺酸钠 生产厂家:美国公司;批号: 己烷磺酸钠 生产厂家:美国公司;批号: 高碘酸钠 生产厂家:公司; 牛磺酸 生产厂家:公司; 纯净水 生产厂家:娃哈哈集团有限公司 ..仪器 高效液相色谱仪 生产厂家:安捷伦科技有限公司;型号: 荧光检测器 生产厂家:安捷伦科技有限公司:型号: 十万分之一电子天平 . 生产厂家:梅特勒托利多公司;型号: 万分之一电子天平 生产厂家:梅特勒托利多公司;型号:. 液相泵 生产厂家:岛津公司:型号:. 第二章伏格列波糖桴后衍生花衍生条什的优化 智能恒温水浴锅 生产厂家:河南省巩义市予华仪器有限责任公司:型 号:. 崩解时限测试仪 生产厂家:天津市国铭医药设备有限公司;型号:. 超声波清洗器 生产厂家:昆山市超声仪器有限公司;型号: ..高效液相柱后衍生系统 废液 图. 柱后衍生荧光检测系统示意图 本实验自行组建的柱后衍生荧光系统如图.所示,流动相采用含 液相色谱 有辛烷磺酸钠或己烷磺酸钠的%的磷酸盐缓冲液,由 仪的四元泵来输送。待分析样品在进样后进入色谱柱进行分离,在分离后通 过 一形三通与荧光试剂进行混合,荧光试剂由一岛津.泵来输送。在 形三通内混合完全以后,含有待分析样品的流动相与荧光衍牛试剂的混合液 进 入聚四氟乙烯材质的衍生反应管,衍生反应的温度通过.智能恒温水浴锅来 控制。在恒温水浴锅中反应后,混合液再进入聚四氟乙烯材质的冷却管,冷却 浴温度通过向崩解仪中加入冰来控制其温度。混合液在冷却以后进入荧光检 测 第二章伏格列波糖枇后衍生花衍生条,:的优化 器进行检测。 .流动相及荧光衍生试剂溶液的配制 .. .磷酸盐缓冲溶液的配制 称量二水合磷酸二氢钠.,加水,搅拌使其溶解,然后再用% ’ 磷酸调节其至..,即得。 .. .磷酸盐缓冲溶液的配制 溶液:称量二水合磷酸二氢钠.,加水,搅拌使其溶解,即 得。 溶液:称量十二水合磷酸氢二钠.,加水,搅拌使其溶解,即 得。 用溶液去调节溶液的至.,即得。 .. .%辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制 称量辛烷磺酸钠.,加至.磷酸盐缓冲液中,用玻棒搅拌使 其溶解,即得。 .. .%己烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制 称量己烷磺酸钠.,加至.磷酸盐缓冲液中,用玻棒搅拌使 其溶解,即得。 .. .%己烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制 称量辛烷磺酸钠.,加至.磷酸盐缓冲液中,用玻棒搅拌使 其溶解,即得。 .. . %辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲溶液的配制 称量辛烷磺酸钠.,加至.磷酸盐缓冲液中,用玻棒搅拌使其 溶解,即得。 第二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条什的优化 ..荧光衍生试剂溶液的配制 分别称量高碘酸钠、牛磺酸.、.,加水,用玻棒搅拌使其 溶解,超声脱气,即得。 .伏格列波糖标准储备液的配制 ..伏格列波糖含量测定标准储备液的配制 称量伏格列波糖原料药.,置于容量瓶内,先加入流动相含 .%辛烷磺酸钠的.磷酸盐缓冲液适量,轻轻振摇使其溶解,然后再加 流动相至刻度。振摇混匀,用..滤膜过滤,弃去初滤液,取续滤液,精密 移取续滤液至容量瓶内,用流动相稀释至刻度。用.“滤膜过滤, 弃去初滤液,取续滤液,作为含量测定液相条件优化的标准储备液。 ’ ..伏格列波糖溶出度测定标准储备液的配制 称量伏格列波糖原料.,置于容量瓶内,先加入.磷酸 盐缓冲液溶出介质适量,轻轻振摇使其溶解,然后再加.磷酸盐缓冲液至 刻度。振摇混匀,用.滤膜过滤,弃去初滤液,取续滤液,精密移取续滤 液至容量瓶内,用.磷酸盐缓冲液稀释并定容。振摇混匀,用 .滤膜过滤,弃去初滤液,取续滤液,作为溶出度测定液相条件优化的标 准储备液。 ..伏格列波糖有关物质测定标准储备液的配制 称量伏格列波糖原料.,置于容量瓶内,先加入流动相含.% 辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲液适量,轻轻振摇使其溶解,再加入流动相至刻 度,摇匀。用..滤膜过滤,取续滤液,作为有关物质液相条件优化的标准 储备液。 .结果与讨论 ..柱后衍生系统的建立 第二二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条什的优化 图. 柱后衍生系统建立时用乳糖进样的色谱图 为了考察自行组建的柱后衍生系统的可行性、有效性,本文以乙腈/.% 己烷磺酸钠.磷酸盐缓冲液为流动相、用一定浓度的乳糖溶液进样。实验 结果表明:乳糖在色谱柱上分离后进行柱后衍生,荧光检测器能够检测到乳 糖, 但乳糖的峰面积较小,具体如图.所示。这表明:本文自行组建的柱后衍生 系统能够使待分析样品在柱后衍生后用荧光检测器检测到。由于乳糖的峰面 积 较小,结果并不令人满意。因此,本文从流动相、色谱柱、荧光检测器的参数 设置等方面去优化伏格列波糖柱后衍生液相条件。 ..含量测定液相条件的优化 色谱柱长度、填料的类型等因素均会直接影响色谱柱的柱效。根据张秀玲、 等报道【?,他们所使用的色谱柱分别是日本岛津公司生产的 色谱柱.?,岬、 日本 公司生产的 .色谱柱.,.,色谱柱内径越大,其溶剂的用量越 大,因此本实验选择了美国奥泰公司生产的的十八烷基反相色谱柱 .,“。并上述报道中的流动相,以乙腈/.%辛烷磺酸钠的. 磷酸盐缓冲液体系为流动相,实验结果表明:选用该色谱柱及流动相时,色谱 柱柱效较差,理论塔板数仪为~,如图.、表.所示。 第二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条,:的优化 图.伏格列波糖含量测定液相条件色谱图 表.伏格列波糖含量测定液相条件 为了提高柱效,本实验考虑选择柱长为的色谱柱;同时为使色谱峰 的保留时间延长、理论塔板数的提高,本实验选择了不含有机相的.%辛烷磺 酸钠的.磷酸盐缓冲液为流动相。但在%的水相的情况下,普通的 反相色谱柱会出现柱床塌陷的现象。综合考虑上述因素,本实验选择了可以 耐 受%水相的公司生产的 .色谱柱.,。实验 结果表明:选用该色谱柱及流动相时,色谱峰的保留时间延长;色谱柱的柱效 有了较大的提高,理论塔板数约为,如图.、表.所示。 第二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条什的优化‘?.。‘々.?.、?抟?. . 晷立 ’『 一 一。 一 一 ?、 ???’??。’?。’一 ? , , , ; ; ,毛 图.伏格列波糖含量测定液相条件色谱图 表.伏格列波糖含量测定液相条件 荧光检测器测定的是在很弱背景上的荧光强度,荧光检测器需通过光电倍增 管将微弱的荧光信号转化成电信号,因此荧光检测器的灵 敏度取决于光电倍增管的放大倍数,但是光电倍增管的放大倍数过大会缩短 荧 光检测的寿命【。因此,本实验将荧光检测器的增益分别设置为、、 、,对荧光检测器的增益进行了选择,实验结果如表.所示。实验 结果表明:荧光检测器的荧光强度随着增益数值的变大而变强,但基线的 噪音也随之变大。增益为时,伏格列波糖峰面积仪为.,噪音仅为 .;当增益设置为时,伏格列波糖峰面积为.,荧光强度明显 变强,但噪音也随之变大为.?~。从表.可知,当荧光检测器的增益 设置为时,其信噪比最大,这表明:增益设置为时,荧光检测器的 灵敏度最高,增益设置为较为合适。第二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条什 的优化 表.荧光检测器增益的选择 峰面积 信噪比 样品名称 保留时间 噪音~ . .木 .. . .?? .. . .母。 . .. . .?? . 经过以上液相条件的优化并参考文献报道【】,伏格列波糖含量测定液相条 件的优化结果为: .幸 ? 流动相:.%辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲液 流动相流速:./ 进样量:山 柱温:? 激发波长::发射波长:;增益, 荧光试剂溶液分别称量高碘酸钠、牛磺酸.、.,加水,用 玻棒搅拌使其溶解,脱气,即得。 荧光试剂溶液流速:与流动相流速相同 衍生反应浴温度:? 衍生反应管长:内径,. 冷却浴温度:? 冷却管长:为径,. ..溶出度测定液相条件的优化 由于伏格列波糖制剂溶出度的溶出介质为.磷酸盐缓冲液,因此本实验 首先考虑选择.磷酸盐缓冲液为流动相。同时由于伏格列波糖的水溶性较 好,采用.磷酸盐缓冲也为流动相时,伏格列波糖在色谱柱上的保留较弱, 因此考虑在.磷酸盐缓冲液加入离子对试剂以增强伏格列波糖在色谱柱上 的保留。本文首先选择.%己烷磺酸钠.磷酸盐缓冲液,实验结果表明: 第二二章伏格列波糖柱后衍生花衍生条:的优化 选择该流动相时色谱峰的理论塔板数较低、柱效较差,具体如图.、表.所 不 .. ??。.々.,讲..‘?尹::,:?:?.; ‘ 譬 ?’? 一 :一??~~一一~.、。一?,~?。~~~一~~??一?一一~~.一,/.一一、、?、一‘: ” 图.伏格列波糖溶出度液相条件色谱图 表.伏格列波糖溶出度测定液相条件 鉴于上述情况,本实验考虑选择更换离子对,为此本文考察了.%辛烷磺 酸钠.磷酸盐缓冲液为流动相时的效果。通过实验,结果表明:选用.% 辛烷磺酸钠时,伏格列波糖的色谱峰柱效有了明显的提升,如图.、表.所 示。 第二二章伏格列波糖梓后衍生花衍生条件的优化 图.伏格列波糖溶出度测定液相条件色谱图 表.伏格列波糖溶出度测定液相条件 离子对试剂加入到含水流动相中,被分析的伏格列波糖与在流动相中与离子 对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对,从而增强溶质伏格列波糖与固定 相 的作用,色谱柱的柱效提高、理论塔板数提高【。在上述两种流动相中,己烷 磺酸钠的浓度比辛烷磺酸钠的浓度要高,但伏格列波糖却在选用后者为流动相 时保留时间较长、理论塔板数较高。这可能是由于己烷磺酸钠的极性比辛烷磺 酸钠的极性小,伏格列波糖与后者生成的不荷电的中性离子对的极性要比与前 者生成的不荷电的中性离子对的极性小。在选择含辛烷磺酸钠磷酸盐缓冲液为 流动相时,伏格列波糖更容易在色谱柱上保留,因此此时保留时间较长、柱效 较高。 综上所述,伏格列波糖制剂溶出度测定液相条件的优化结果为: .木 岬 流动相:.%辛烷磺酸钠.磷酸盐缓冲液第二章伏格列波糖梓后衍生花衍生条,:的优化 流动相流速:./ 进样量:“ 柱温: 激发波长:;发射波长:; 荧光试剂溶液分别称量高碘酸钠、牛磺酸.、.,加