几种食用真菌超氧化物岐化酶的提取及活性测定-生物毕业论文开题报告

几种食用真菌超氧化物岐化酶的提取及活性测定-生物毕业论文开题 毕业设计(论文)开题报告 理工学院 毕业设计(论文)开题报告 题 目:几种食用真菌超氧化物岐化酶的提取及活性测定 学生姓名: 董建峰 学 号: 08L0304102 专 业: 生物科学 指导教师: 李 敏 2012 年 3月 15 日 毕业设计(论文)开题报告 1(结合毕业设计(论文)课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000字左 右的文献综述: 超氧化物歧化酶及应用 1 超氧化物岐化酶的发现和分类地位 超氧物歧化酶(Superoxide Dismutase简称SOD，ECl.15.1.1)是一种新型酶制剂。1938 ,1,年Mann 和KeilinJ首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质 ,2,2—(Hemocupreid),1969年，Mccord和Fridobvich 发现其能催化超氧阴离子(O)的歧化反应而将其命名为超氧化物歧化酶(SOD)，并阐明了超氧阴离子自由基的生物学意义，该酶是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，同时SOD是一种很有用途的药用酶。有关SOD的研究受到国内外学者的广泛关注，涉及到化学、生物、医药、日用化工、食品诸领域，是一个热门研究课题。通过多年努力，在SOD的基础研究方面取得了巨大成果。在SOD的制备、结构功能研究及抗衰老、抗辐射、抗炎和抗癌及其作用机理、吸收机理研究方面已取得很大进展。 CuZnSOD是真核生物酶，主要存在于真核细胞的细胞质和叶绿体的基质中，动物血肝、奶、植物叶、果等均含CuZnSOD。CuZnSOD中一个酶分子的亚基含一分子Cu和一分子Zn,Cu位于酶的活性中心,酶的形状呈一椭圆形狭长的口袋,Cu位于“口袋”的底部,与一分子水和4个组氨酸(His)残基形成配位键,Zn则通过咪唑基与其中之一的 [3]His残基相连。 SOD类型: 超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn—SOD)，最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中;第二种是是含锰(Mn)金属辅基的称(Mn—SOD)，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内;第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe—SOD)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。 2 SOD的生产方式 目前国内已开发的SOD产品绝大分都是Cu/Zn-SOD，它们最早是从动物的血、肝中分离提取的，动物SOD的分离提取技术也较为成熟。人们相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织中分离和纯化出SOD。SOD常用的纯化制备有离子交换 毕业设计(论文)开题报告 法、疏水色谱、凝胶过滤法和金属螯和亲和层析法等。提取方法主要有以下几个: ,4,溶血液制备、选择性热变性、超滤浓缩、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥。 但是，由于这种方法不可避免地发生一些交叉感染，过敏性反应等现象，开发研究从植物中提取SOD就显得尤为重要。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关报道。 ,5,6,,7,,8,许平、袁艺、赵文芝、余旭亚等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取SOD并进行了相关研究，其提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等。除了从动植物中提取SOD外，选育SOD高产菌株进行发酵生产也是比较有价值的一种方法,9，10,。 由于天然SOD来源有限，且具有异体蛋白免疫原性，外源SOD不易被人体接受等缺陷，使之在应用方面受到很大限制。SOD基因工程是广开酶源，降低成本和获得无抗原性的人源SOD的有效途径。与天然SOD相比，SOD的模拟物有着更显著的优点:首先是获取和制备比天然SOD要简单得多，其次，天然SOD作为一种生物大分子，在进入体内时存在着进入细胞能力弱、细胞渗透性差、在血中半衰期短、不能口服、价格昂 ,11,贵等缺点，所以，目前，生物无机化学家们合成和征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD，期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床。 ,12,，5-二异丙基水杨酸铜,Cu(3，5-DIPS),其中研究最多的含铜络合物是3，这是一种低分子量的亲脂性络合物，具有天然Cu/Zn-SOD样活性，可以起到抗炎及减轻由链脲 ,13,菌素诱导产生的糖尿病。刘京萍等合成的铁(?)-酪氨酸模拟SOD金属酶，分子量比天然酶小得多，与天然SOD活性差距较小，且毒性小，从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作。 由于SOD催化的反应的特异性，科学家们一直努力寻找适合其特性的简便、精确的测活方法，多年来相继建立的多种活性测定方法，一般分为两大类:直接法和间接法。而直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器，在一般实验室无法使用，所以多采用间 ,14,接法。 3 SOD作用机理 SOD的作用底物是生物体内产生的超氧阴离子自由基, ，作用机理是: 毕业设计(论文)开题报告 2- -SOD + OSOD + O 2 (还原型) (氧化型) +2H+ - SOD + OSOD + HO 222 (还原型) (氧化型) 2-+2O + 2H O+ HO 2 22 CAT(eatalase) HO + O 222 4 SOD的应用 人体内超氧阴离子自由基如果得不到清除就会引起衰老自身免疫能力下降以及产生一系列病变。目前人们已经开始研究SOD的广泛应用。 4.1 在药用方面 在美国等工业发达国家SOD应用广泛。目前临床上应用主要是用于清除炎症，抗病毒及增强免疫力等，特别是用于内风湿、关节炎及放射性治疗后引起的皮肤炎症SOD在防止癌细胞扩散和作为抗衰老的药物已引起医药界人士的极大兴趣,如即将获得二类新药证书的国产注射用SOD注射液的临床应用(包括抗炎、抗辐射损伤和抗缺血再灌损伤)。 4.2 在食品工业上的应用 目前,SOD及化学修饰SOD在食品工业中的应用日益广泛,远远超过了相应的理论研究水平，SOD在食品工业中也有很多应用。作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂: 现已证实,该类保健食品具有良好的抗衰老、抗疾病、抗辐射、抗癌、治艾滋病、防治感冒、抗心血管病、抗疲劳和保健强身的效果"目前已有添加有SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮等类型的保健食品面市。各种剂型的SOD或复合型食品:现已有胶囊、片剂、口服液、脂质体、颗粒剂等形式的SOD保健食品问世。用作抗氧化剂:与其它抗氧剂一样，SOD可作为罐头食品、果汁、啤酒等抗氧剂、防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象此外,还可作为水果、蔬菜良好的保鲜剂。加工成保健食品:以富含SOD原料未经提取,直接修饰加工制成保健食品, 毕业设计(论文)开题报告 [13]如大蒜饮料、刺梨汁、余甘子粉(汁)等,这也是一种新的发展趋势。 4.3 作为化妆品的添加剂 根据衰老的自由基学说,老化是自由基产生和消除功能发生障碍的结果。在正常情况下产生与消除处于平衡状态,但随着机体的衰老或某些外界因素的影响,这种平衡往往被打破,多余的自由基就能够通过多种渠道损害机体,例如氧自由基能引起脂质过氧化,过氧化脂质会与蛋白质交联,产生不溶性蛋白质,这种变化以结缔组织中胶原蛋白最明显,它能导致胶原变韧长度缩、使皮肤失去膨胀力即所谓皱纹;此外,过氧化脂质在氧化酶的作用下能分解成丙二醛等物质,并与磷脂酰乙醇胺交连生成黄色色素,然后再与蛋白质、核酸等物质形成紫褐质即所谓老年斑。其实紫褐质不仅出现在面部,亦出现在体内其他部位如脑、心、肝等。而SOD是超氧化自由基清除剂,通过适当途径对机体不断补充外源能有效防止或延缓上述过程的发生。 4.4 医学上的应用 在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病、癌和癌的放射治疗预防以及人类长寿等领域的研究中也己有突破性进展。SOD被批准用于临床使用，它对一些由于年龄、疾病或伤害造成的组织硬化以及纤维化显示出强大的再生修复能力。SOD已被成功的应用于放疗后的辅助治疗、控制心脏病人的进展、用于治疗严重的风湿性关节炎，红斑狼疮等疾病。通过测定SOD酶活性及MDA水平，可以间接了解体内自由基的代谢状况。了解患者体内自由基的活动情况，从而对患者进行相应的治疗。 预防下列疾病:急性炎症和水肿、氧中毒预防(预防措施，进入高压氧舱的工作人员，可预先注射SOD)、氧中毒治疗、自身免疫性疾病(早期治疗)、肺气肿、辐射病 ,3，5,及辐射防护、老年性白内障、抗衰老。 5 SOD的活力测定 5.1 邻苯三酚自氧化法测定SOD活力 2 -邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30,45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间 毕业设计(论文)开题报告 2 -+物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O与H结合生成O和HO，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。 222 5.2 化学发光法测定SOD活力 化学发光法原理是黄嘌呤氧化酶在有氧条件下，催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤发生氧化反应生成尿酸，同时产生O 。后者可与化学发光剂鲁米诺反应，使其产生激发。SOD2 能清除O从而抑制鲁米诺的化学发光。本法可应用于SOD的微量测定，不仅灵敏度高，2 简便易行，而且特异性与准确性至少与细胞色素C还原法类似。 5.3 电泳法电泳染色定位法 电泳法电泳染色定位法的基本原理是根据光化学法与NBT还原法。电泳则采取垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。既可采用SOD活性正染色(呈现棕色区带)也可采取SOD活性负染色(呈现无色透明区带)。根据凝胶上电泳分离的SOD区带的着色深浅与面积大小，对样品进行半定量分析，也可制作校正曲线计算样品中的SOD含量。染色定位法常用于鉴定SOD，很少为了定量，主要原因是它不及化学法简便，但鉴定SOD却较化学法为优。用电泳法可鉴定SOD是否掺有杂质蛋白，有无同工酶，且可半定量地确定SOD的活性大小。 毕业设计(论文)开题报告 参考文献 1 Mann T，Keilin D.Haemocuprein and hepatocuprein，copper-protein compounds of blood and liver in mammals,J,.Proc R Soc B，1938，126:303,315 2 McCord J.M.，Irw in Fridovich.Superoxide dismutase:An enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein) ,J,.J Biol Chem，1969，244:6049,6055 3 Grace S.C..Phylogenetic distribution of mitochondria,J,.Life Sciences，1990，47:1875,1886 4 许平，袁原.大蒜超氧化物歧化酶活性测定及某些性质研究,J,.渝州大学学报(自然科学报)，1997;14 (1):43,47 5 袁艺，李纯，张小青.桑叶超氧化物歧化酶的提纯和性质研究,J,.安徽农业大学学报，1997:24(3):296, 301 赵文芝，辛玉华，魏建民，等.沙棘超氧化物歧化酶提纯的研究,J,.内蒙古石油化6 工，1998，24(2):31,32 7 余旭亚，赵声兰，李涛，等.生物工程超氧化物歧化酶的纯化及其部分性质研究,J,.精细化工，2002;19 (4):234,237 8 王岁楼，张平之，张欣，等.酵母SOD形成的生理学研究,J,.工业微生物，1997;27(3):21,23 9 吴思芳，方尚玲，童振球，等.啤酒废酵母提取SOD研究,J,.食品科学，2000;21(3):22,25 10 Riley D.P.Functional Minics of Superoxide Dismutase Enzymes as Therapeutic Agents,J,.Chemical Reviews，1999;99(9):2573,2588 11 张龙泽，马书林.SOD模拟化合物的研究进展,J,.药学学报，2002;37(3):235,240 12 刘京萍，李金，葛兴，等.模拟金属酶-铁(II)酪氨酸配合物的合成及SOD样活性,J,.北京联合大学学报(自然科学版)，2003;17(3):40,43 13 谢秋玲，郭勇.超氧化物歧化酶活力测定方法及其进展,J,.广东药学，1997;4:1,4 毕业设计(论文)开题报告 14 丁书茂，杨旭.超氧化物歧化酶及其模拟化合物研究进展,J,.高等函授学报(自然 科学版)，2004;2(17):1,5 毕业设计(论文)开题报告 ,(本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段及途径: 1 研究意义 SOD是一种生化新药,能治疗由自由基引发的疾病,目前国内外的临床应用主要集中在自身免疫性疾病和抗辐射上,且应用范围正在扩大已开展的临术应用主要在:炎症、辐射损伤、家庭性肌萎缩性侧硬化、关节痛、自身免疫性疾病、缺血再灌注综合症、氧中毒、肿瘤的放疗与化疗、老年性白内障、烧伤及多种皮肤病等。其生理功能的基础同 —样是清除过量的O可以概括为:抗衰老,包括皮肤的抗皱与去斑;提高机体对多种疾病2 的抵抗力;增强机体对外界环境的适应力。因此研究SOD具有很重要的意义。 本课题通过提取不同生活中常用真菌的SOD测定他们之间含量和活力的区别来确定真菌的营养含量，并对人们的饮食具有指导意义。 2 粗酶液的获得 一系列真菌类食物粗酶制取: 取以上真菌加适量 pH7.8 50mmol/L磷酸钾缓冲液(PE)，破碎后，0~4C环境中浸提3h，用4层纱布过滤，5000rpm、4C高速冷冻离心40min后即的粗酶液 3 样品蛋白质浓度测定 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。 在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。 4 酶活性的测定 配制10 mmol /L 盐酸、50mmol /L 邻苯三酚和0.05 mol /L Tris Hcl (pH 8.37) 缓冲液,按表1 的试剂用量,将缓冲液加入试管并在25 ?保温25 min ,样品管加入样品溶液,然后加入同样预热的邻苯三酚,用微型混合器迅速混匀,倾入1 cm 的比色杯中,在325 nm 处每隔30 s 测定吸光度1 次,选择时间范围,控制对照管每分钟吸光度的变化 毕业设计(论文)开题报告 速率在0.070 左右,样品溶液每分钟吸光度变化值?A325 。酶活力的计算:SOD 活力(U?mg - 1 ) = (0.070 - ?A325 ) ×100 % ×V总/0.070 ×50 %?V定义?V样。其中: V总代表反应总体积,V样代表加入样品液的体积,V定义代表活力单位定义体积(1 ml) 5 丙酮沉淀超氧化物歧化酶 与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 选用SOD酶含量最高的香菇酶液做纯化。把粗酶液分五个试管，都加入10毫升的粗酶液，然后加入丙酮的量依次为酶液体积的0.2倍、0.4倍、0.6倍、0.8倍、1.0倍， 20min、30min、40min。然后12000rpm离心10min，去上清，沉淀用低温放置10min、 缓冲液溶解。进行蛋白浓度和活力测定。 毕业设计(论文)开题报告 指导教师意见 1(对“文献综述”的评语: 该文对镰刀菌的性状，致病因素及作用的进行了较全面的概述，也对生物防治的方法和应用意义等进行了概述，语言逻辑清晰流畅，对本课题的研究开展提供了参考，书写格式正确。 2(对本课题的深度、广度及工作量的意见和对设计(论文)结果的预测: 本研究以几种食用真菌为原料，提取SOD，并对酶的活力进行确定。同时探讨了丙酮沉淀纯化SOD的方法和条件。 本课题具有一定的适用性，任务量适中，通过学生认真做可以完成。 指导教师: 年 月 日