生药关于大黄的论文

生药关于大黄的 大黄含量测定 ——中、日、欧药典比较及新测定方法拟定 目录 1.大黄简介………………………………………………………………………3 1.1大黄的产地………………………………………………………………3 1.2大黄的化学成分…………………………………………………………3 1.3大黄的药理…………………………………………………………………3 1.4大黄的功效…………………………………………………………………3 2大黄中国2010药典含量测定及质量标准……………………………………4 3大黄中国2010药典及日本药局方14版比较………………………………5 3.1测定方法……………………………………………………………………5 3.2测定物质……………………………………………………………………5 3.3标准品制备…………………………………………………………………5 3.4供试品制备…………………………………………………………………6 3.5含量规定……………………………………………………………………6 4大黄欧洲2002药典含量测定分析……………………………………………6 5大黄中国2000药典及2010药典比较………………………………………7 6对大黄含量测定新方法的拟定………………………………………………7 7参考文献……………………………………………………………………8 8备注[1][2][3]……………………………………………………………………9 9附录一 2010中国药典大黄 附录二 日本药局方14版大黄、大黄沫 附录三 药典分析比较 关键词:药典 大黄 测定方法 质量标准 对照品 国之四维:礼义廉耻。而中药四维即为:附子、人参、熟地、大黄。 大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄Rheumtanguticum.Maxim.exBalf.或药用大黄RheumoffcihaleBaill.的干燥根和根茎。苦，寒。归脾、胃、大肠、肝、心包经。 大黄的产地包括: 掌叶大黄主要产于甘肃礼县、宏昌、岷县、文县、临夏、武威，青海同仁、同德、贵德，西藏昌都与那曲地区，四川阿坝与甘孜州的产量占大部分。 唐古特大黄主产于青海和甘肃祁连山北麓，西藏东北部及四川西北部亦有少量。 药用大黄产于四川北部、东部、及南部盆地边缘，贵州北部西部，云南西北部，湖北西部，陕西南部、产量很小，多销当地，通称马蹄大黄。 大黄所包含的主要的化学成分是:三种大黄均含有蒽醌及游离蒽醌衍生物，含量以总蒽醌计，约2.0%~6.2%.也含有鞣质、有机酸、糖类、挥发油等。 大黄的主要药理作用:?泻下作用、?抗病原微生物作用?利胆作用 还有抗消化道溃疡、抗肿瘤、免疫调节等作用。 大黄的主要功效包括:泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄。用于实热积滞便秘，血热吐衄，目赤咽肿，痈肿疔疮，肠痈腹痛，瘀血经闭，产后瘀阻，跌打损伤，湿热痢疾，黄疸尿赤，淋证，水肿,外治烧烫伤。酒大黄善清上焦血分热毒。用于目赤咽肿，齿龈肿痛。熟大黄泻下力缓，泻火解毒。用于火毒疮疡。大黄炭凉血化瘀止血。用于血热有瘀出血症。 - 3 - 经过查阅资料得到，最新的2010版中国药典采用高效液相色谱法,HPLC,对其进行含量测定，用甲醇进行提取，以芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品做对照，规定以本品按干燥品计算，含芦荟大黄素(C15H1005)、大黄酸(C15H806)、大黄素(C15H1005)、大黄酚(C15H1004)和大黄素甲醚(C16H1205)的总量不得少于1.5,。 现将2010中国药典药典、日本药局方,第16版,、欧洲药典,2002版,以及中国药典2000版本进行含量测定的比较分析。 ?2010中国药典与日本药典的比较。 两者均采用了HPLC高效液相色谱仪[注1]进行了含量的测定。首先他们均用的C柱[注2]，但流动相不同，中国采用的是甲醇0.1,磷酸溶液(85:15)，而日18 本采用稀醋酸(1?80):乙腈(4:1)，其次检测波长也不相同，中国采用的是254nm，而日本为340nm。当然造成这些差异的主要原因是他们所检查分析的物质不相同，中国检查的是芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚以及大黄素甲醚,结构式如下, ，而日本所检查的却是番泻苷,结构式如下,。 - 4 - 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚、番泻苷全部属于醌类化合物，但前者属于蒽醌类衍生物，而后者属于二蒽酮类衍生物，它是由两分子的蒽酮脱去一分子氢相互结合而形成的化合物。 中国大黄检测的标准品的制备如下:精密称取芦荟大黄素对照品、大黄酸对照品、大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各80μg，大黄素甲醚40μg的溶液,分别精密量取上述对照品溶液各2ml，混匀，即得(每1m1中含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚各16pg，含大黄素甲醚8μg)。 日本标准品的制备为:PO减压干燥12小时以上，取10mg用碳酸氢钠溶液25 ,1?1000,溶解至50mL，取5mL稀释至20mL。 中国测定的供试品溶液的制备:取本品粉末(过四号筛)约0.15g，精密称定，臵具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，臵烧瓶 - 5 - 中，挥去溶剂，加8,盐酸溶液10ml，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流1小时，放冷，臵分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 日本的则为:取0.5g，精密加碳酸氢钠溶液,1?1000,50mL，振摇30min，滤过，即得。 中国药典2010版规定，含芦荟大黄素(C15H1005)、大黄酸(C15H806)、大黄素(C15H1005)、大黄酚(C15H1004)和大黄素甲醚(C16H1205)的总量不得少于1.5,。日本的则规定以干燥品计，含番泻甘A0.25%以上。 ?对欧洲药典的含量测定方法进行分析 欧洲采用的UV法[注3]测定总蒽醌的含量。供试液的制备:0.1g，加水30mL，水浴回流提取15min，加50mg碳酸氢钠，离心，吸取10.0mL，臵100mL圆底烧瓶中，加20mL三氯化铁溶液，水浴回流提取20min，加1mL盐酸，加热20min，并时时振摇，过滤，滤液用乙醚提取3次，每次25mL，乙醚液用水洗2次，每次15mL，乙醚液用棉花滤过，定容至100mL. 检测时，精密吸取10.0mL，水浴上蒸干，加0.5%醋酸镁溶液溶解并定容至10mL。于515nm处测定吸收值。 计算如下:A*0.64/m 式中，A为515nm处波长吸收度,m为药材的质量,g, 欧洲药典02版规定，以大黄酸计算含的总醌量不得低于2.2%。 - 6 - ?中国药典2005与2010版对照 相较于10版的药典2005版的中国药典中大黄含量测定所采用的方法基本相同，不同的仅仅是对照品，只包括了大黄素和大黄酚。规定，其以干燥品计算，大黄素和大黄酚的总量不得少于0.5%。 ?大黄含量测定新方法的拟定 根据大黄所含的主要成分不仅包括各种蒽醌类，还含有有机酸、糖醇类化合物，我们可以采用离子色谱法进行含量的测定。 离子色谱法系采用高压输液泵系统将规定的洗脱液泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。注入的供试品由洗脱液带入色谱柱内进行分离后，经过抑制器或衍生系统进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。离子色谱法常用于无机阴离子、无机阳离子、有机酸、糖醇类、氨基糖类、氨基酸、蛋白质、糖蛋白等物质的定性和定量分析。它的分离机理主要为离子交换，即基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换,离子色谱的其他分离机理还有离子对色谱、离子排阻色谱等。 采用的填充柱为聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物，以碳酸盐缓冲液作为洗脱液，。通过增加或减少洗脱液中酸碱溶液的浓度可提高或降低洗脱液的洗脱能力,在洗脱液内加入适当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。样品处理需要通过稀释和0.45μm滤膜过滤后直接进样分析。如果是基质复杂的样品，可通过微波消解、紫外光降解，固相萃取等方法去除干扰物后进样分析。 至于含量的规定，需要大量实验后才能获得数据，本论文只提供方法。 - 7 - 参考文献 中国药典2010版 中国药典2000版 中国药典2005版 日本药局方14版 日本药局方16版 欧洲药典2001版 - 8 - [注1]高效液相色谱法简介 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱:柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。检查项目包括?色谱柱 ?检测器?流动相。色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更重要的参数。常用的测定测定法包括?内标法?外标法?加校正因子的主成分自身对照法?不加校正因子的主成分自身对照法?面积归一化法, 注2]碳十八柱简介 [ 碳十八柱为,ODS/C18)，ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱,ODS柱是十八烷基硅烷键合硅胶填料,Octadecylsilyl，简称ODS,。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70,80%的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。按键合到基质上的官能团可分为:?反相柱:填料是非极性的，官能团为烷烃，例如:C18(ODS)、C8、C4等。?正相柱:填料是极性的，官能团为,CN氰基、,NH2氨基等。?离子交换键合相: 阳离子官能团:,SO3H磺酸基、,COOH羧基等。 阴离子官能团:―R4N+季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH=2,7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相: 反相色 - 9 - 谱最常用的流动相及其冲洗强度如下: H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成是:"甲醇-H2O"和"乙腈-H2O"，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑"甲醇-H2O"流动相。 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸,TFA,，使用浓度为0.1%，使流动相的pH值为2,3，这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使其疏水性增加，延长洗脱时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷,A+,相反的离子,B,,，称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是: 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇 其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80%的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。流动相的选择原则是:?样品易溶，且溶解度尽可能大。?化学性质稳定，不损坏柱子。?不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。?粘度低，流动性好。?易于从其中回收样品。?无毒或低毒，易于操作。?易于制成高纯度，即色谱纯。?废液易处理，不污染环境。, [注3]紫外分光光度法简介 紫外分光光度法的工作原理是:许多有机化合物在紫外区具有特征的吸收光谱，因此可用紫外分光光度法对有机物质进行定性鉴定，结构分析及定量测定,紫 - 10 - 外分光光度法定量测定的依据是比耳定律。首先确定化合物的紫外吸收光谱，确定最大吸收波长。在选定的波长下，作出化合物溶液的工作曲线，根据在相同条件下测得待测液的吸光度值来确定待测液中化合物的含量。物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或 测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸 收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律。即物质在一定浓度 的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比。凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。含量测定 一般有以下几种。?对照品比较法 按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100%?10,，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度: cX=,AX,AR,cR 式中cX 为供试品溶液的浓度,AX 为供试品溶液的吸光度,cR 为对照品溶液的浓度,AR 为对照品溶液的吸光度。 ?吸收系数法 按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收 - 11 - 系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。?计算分光光度法 计算分光光度法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品的测试条件应尽可能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。?比色法 供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法为比色法。用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后，按上述,1,法计算供试品浓度。当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。 [注4]离子色谱法简介 1. 对仪器的一般要求 离子色谱仪器中所有与洗脱液或供试品接触的管道、器件均应使用惰性材料，如聚醚醚酮(PEEK)等。仪器应定期检定并符合有关规定。 (1)色谱柱 离子交换色谱的色谱柱填充剂有两种，分别是有机聚合物载体 填充剂和无机载体填充剂。有机聚合物载体填充剂最为常用，填充剂的载体一般为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有机聚合物。这类载体的表面通过离子键附聚了大量具有阴 - 12 - 离子交换功能基(如烷基季铵基、烷醇季铵基等)或阳离子交换功能基(如磺酸、羧酸、羧酸-膦酸和羧酸-膦酸冠醚等)的乳胶微粒，可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。有机聚合物载体填充剂在较宽的酸碱范围(pH=0,14)内可有较高的稳定性，且有一定的耐有机溶剂腐蚀性。无机载体填充剂一般以硅胶为载体。在硅胶表面的硅醇基通过化学键合季铵基等阴离子交换功能基或磺酸基、羧酸基等阳离子交换功能基，可分别用于阴离子或阳离子的交换分离。硅胶载体填充剂机械稳定性好、在有机溶剂中不会溶胀或收缩。硅胶载体填充剂在pH2,8 的洗脱液中稳定，一般适用于阳离子样品的分离。 (2) 洗脱液 离子色谱对复杂样品的分离主要依赖于色谱柱的填充剂，而洗脱液相对较为简单。分离阴离子常采用稀碱溶液、碳酸盐缓冲液等作为洗脱液,分离阳离子常采用稀甲烷磺酸溶液等作为洗脱液。通过增加或减少洗脱液中酸碱溶液的浓度可提高或降低洗脱液的洗脱能力,在洗脱液内加入适当比例的有机改性剂，如甲醇、乙腈等可改善色谱峰峰形。制备洗脱液的去离子水应经过纯化处理，电阻率一般大于18.2MΩ。使用的洗脱液需经脱气处理，常采用氦气在线脱气的方法，也可采用超声、减压过滤或冷冻的方式进行离线脱气。 (3) 检测器 电导检测器是离子色谱常用的检测器，其他检测器有紫外检测器、安培检测器、蒸发光散射检测器等。电导检测器主要用于测定无机阴离子、无机阳离子和部分极性有机物，如羧酸等。离子色谱法中常采用抑制型电导检测器，即使用抑制器将具有较高电导率的洗脱液在进入检测器之前中和成具有极低电导率的水或其他较低电导率的溶液，从而显著提高电导检测的灵敏度。安培检测器也用于分析解离度低、用电导检测器难于检测的离子。直流安培检测器可以测定碘离子(I-)、硫氰酸根离子(SCN-)和各种酚类化合物等。积分安培和脉冲安培 - 13 - 检测器则常用于测定糖类和氨基酸类化合物。 紫外检测器适用于在高浓度氯离子等存在下痕量的溴离子(Br-)、亚硝酸根离子(NO2-)、硝酸根离子(NO3-)以及其它具有强紫外吸收成分的测定。柱后衍生-紫外检测法常用于分离分析过渡金属离子和镧系金属等。 蒸发光散射检测器、原子吸收、原子发射光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、质谱,包括电感耦合等离子体质谱,也可作为离子色谱的检测器。离子色谱在与蒸发光散射检测器或/和质谱检测器等联用时，一般采用带有抑制器的离子色谱系统。 2,样品处理 离子色谱的色谱柱填充剂大多数不兼容有机溶剂，一旦污染后不能用有机溶剂清洗，所以离子色谱法对样品处理的要求较高。对于澄清的，基质简单的水溶液一般通过稀释和0.45μm 滤膜过滤后直接进样分析。对于基质复杂的样品，可通过微波消解、紫外光降解，固相萃取等方法去除干扰物后进样分析。 3,系统适用性试验 参照“高效液相色谱法”项下相应的规定。 4,测定法 (1) 内标法加校正因子测定供试品中的主成分含量 (2) 外标法测定供试品中某杂质或主成分含量 (3) 面积归一化法 上述(1),(3)法的具体内容均同“高效液相色谱法”,附录V D,项下相应的规定。 (4) 标准曲线法 - 14 - 按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品适量配制成储备溶液。分别量取储备溶液配制成一系列不同浓度的对照品溶液。量取一定量上述一系列不同浓度 的对照品溶液注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液中待测组分的峰面积或峰 高。以对照品溶液的峰面积或峰高为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，回归计算 标准曲线，其公式为: 再取各品种项下供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶 待测成分(或其杂质)的峰面积或峰高。按下式计算其浓度: 因为离子色谱在药学方面的主要应用是药物的含量测定和有关物质检 查，所以常用的测定法是外标法和标准曲线法。 - 15 -