滇池束丝藻水华毒性生物检测_cropped

滇池束丝藻水华毒性生物检测_cropped 第 28 卷 第 2 期 Vol . 2 8 , No . 2 水 生 生 物 学 报 2 0 0 4 年 3 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Mar . , 2 0 0 4 研究简报 滇池束丝藻水华毒性生物检测 刘永梅 刘永定 李敦海 沈银武 王海珍 ()中国科学院水生生物研究所 ,武汉 430072 BIOASSAY FO R THE TO XICITY OF A P HANI ZOM ENON FLOS2AQUA E BLOOM FROM LAKE D IANCHI LIU Yong2Mei ,LIU Yong2Ding ,LI Dun2Hai ,SHEN Yin2Wu and WANG Hai2Zhen ( )Institute of Hydrobiology , the Chinese Academy of Sciences , Wuhan 430072 关键词 :蓝藻水华 ;水华束丝藻 ;生物检测 ;麻痹性贝毒毒素 ( )Key words : Cyanobacterial bloom ; Aphanizomenon f los2aquae ;Bioassay ; Paralytic shellfish poison PSP () 文章编号 :100023207 20040220216203 中图分类号 :X174 文献标识码 :A ,由于外源污染物大量入湖 ,致使滇池水体呈富营 采用日本 DKK1TOA1 公司生产的 HM220P、DO224p 水质自动测 近年来 1 定仪进行测定 。总氮采用过硫酸钾氧化 - 紫外分光光度法测 养状态 ,蓝藻水华频繁爆发。束丝藻属与微囊藻属随季节 6 定 ,总磷采用过硫酸钾氧化 - 钼锑抗分光光度法测定。 演替 ,成为滇池蓝藻水华的两大优势种群 。束丝藻水华暴发 期间 ,滇池放养的滤食性鱼类出现死亡 ,其原因可能是由于丝 113 藻类种群优势度确定 样品用 Lugol’s solution 固定后 ,采 状藻体堵塞鱼鳃部而引起 ,但也不能排除束丝藻毒素的影响 。 用血球计数板进行群体计数 。 有毒束丝藻水华对鱼类的危害主要现在几个方面 :鱼类受 114 干重测定 称取 1g 经浓缩获得的鲜藻体 ,105 ?烘干至到有毒束丝藻细胞所分泌毒素 ,如四氢嘌呤碱等毒性毒害 ;与 恒重 ,称重为 01041g。 束丝藻共生细菌毒害 ;或束丝藻死亡后分解消耗水体中溶解 2 115 粗毒素的提取 称取鲜藻体 18185g ,加入 50mL 011mol/ L氧造成水体缺氧等都是可以使鱼致死的原因。由于束丝藻 3 (高产毒的特性使之已成为普遍关注的热点之一。国外曾报 乙酸溶液 ,用 J Y922?型超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物技术 4 ,5 道蓝藻水华产生的毒素使牛和野生动物中毒死亡,而滇池 ) 研究所处理 15min ,再用磁力搅拌器搅拌 30min ,5000r/ min 离 束丝藻水华毒性尚未见报道 。本文采用一种国际常用的检测 心 15min ,收集上清 。向沉淀部分再加入 25mL 011mol/ L 乙酸方法 ———小白鼠腹腔注射法 ,对滇池束丝藻水华的毒性进行 溶液 ,重复上述操作 ,离心 ,合并上清 ,得到毒素粗提品 。 了检验 。 116 毒素粗提物初步纯化处理 向粗提物中加入 10mL 无水 乙醇 ,混匀 ,以沉淀蛋白质和核酸等大分子 。将混合物 4200r/ min 离心 15min ,收集上清 ,并用旋转蒸发仪浓缩干燥 。浓缩的 样品用 011mol/ L 乙酸重新溶解 ,再加入 10mL 无水乙醇 ,重复 1 与方法 操作 。将最终所得浓缩样品用 50mol/ L 0101mol/ L 乙酸溶解 ,111 材料 水华束丝藻从滇池蓝藻水华中用浮游植物网采 得到比较澄清的毒素提取物 ,并用 1mol/ L NaHCO调 p H 值为 3 集 。带回实验室后 ,依次过 100 、150 、300 目筛网 ,除去浮游动 6 左右 。物及枯草等杂质 。将浓缩的藻浆铺于滤纸上脱水 。实验用昆 117 小鼠生物实验 按照 AOAC 小鼠生物检测方法 ,采用纯 ( ) 明小白鼠 KM购自中国科学院昆明动物研究所 ,属昆明品系 , 种昆明小白鼠 。毒素提取物用 0101mol/ L 乙酸适当稀释 ,并调 雄性 ,体重 18 —22g。 p H 为 6 。将 18 只小鼠按体重分为 6 组 ,每组平均体重均为() 112 样品采集时水体理化因子测定 水温 、p H、溶解氧 DO 收稿日期 :2003211217 ;修订日期 :2003212210 () ( () ) 基金项目 :国家 973 项目 2002CB412300;国家重大环境课题 K99205235201;中国科学院方向性创新课题 220316资助 () 作者简介 :刘永梅 1979 —,女 ,河南唐河人 ,博士 ,从事藻类生物学研究 通讯作者 :刘永定 ,liuyd @ihb. ac . cn () 20133 ?1158g ,以 p H 为 6 的乙酸溶液为对照组 ,按毒素提取物 ODS 柱 416mm ×150mm, 检 测 波 长 238nm , 流 动 相 为 60 %甲 () 原液 、1/ 2 、1/ 4 、1/ 8 、1/ 16 毒素提取物原液的梯度进行腹腔注 醇 ,40 %磷酸缓冲液 0105mol/ L KHPO,调 p H 为 3,流速为 2 4 7 射 ,每组 3 个重复 。根据 Sommer’S 表,用小鼠体重及死亡时 μ110mL/ min ,进样量 10L 。() 间进行校正 ,确定材料的毒性 ,以鼠单位 MU表示 。其定义为 8 15min 内使小鼠中毒致死所需的毒素量。实验组小鼠死亡 2 结果与讨论 后立即解剖 ,取肝脏和肺 ,用 p H712 的磷酸缓冲液冲洗去血 后 ,称重 。同时与注射 1mL 微囊藻毒素死亡的小鼠进行比较 。 211 束丝藻水华暴发时水体理化条件及样品优势度 ( 118 提取物中微囊藻毒素检测 用高效液相色谱仪 HPLC2束丝藻水华在滇池暴发时环境温度较低 ,水体偏碱性 ,采 ) UV对提取物中微囊藻毒素含量进行测定 。色谱条件 : 岛津样同时测定结果如表 1 。 表 1 采样时滇池水体理化指标 Tab . 1 Physical and chemical values of the water in Dianchi Lake when sampling ( )()()()水温 ? 溶解氧 mg/ L 总氮 mg/ L 总磷 mg/ L p H Water temp . Dissolved oxygen Total nitrogen Total phosphorus 12. 8 8. 89 7. 45 3. 122 0. 313 () 根据近三年来 2000 —2003 年对滇池实验区 25 个采样点 30min 内 ,而注射提取液浓度较低时 ,小鼠死亡 亡时间出现在 每月取样监测结果 ,滇池束丝藻在每年的 11 月份开始出现 , 时间则相对较长 ,出现在注射后的数小时内 ,这可能是由于束 10 到次年的 3 、4 月份消失 ,在此期间大量生长 ,形成水华 。而对 丝藻毒素的延缓性毒性效应引起的。提取物的 HPLC 分析 () 这期间滇池水体理化参数的监测结果 未列出表明 ,在束丝 结果发现微囊藻毒素含量非常低 ,且小鼠中毒症状并非为典 藻与微囊藻水华的季节演替过程中 ,温度变化是一个与该过 () 型的肝毒素中毒症状 微囊藻毒素为肝毒素,所以可以排除 程相关性较大的因子 。束丝藻水华暴发时要求的环境温度较 微囊藻毒素中毒致死的原因 。小鼠解剖实验发现 :微囊藻注 低 ,一般为 10 ?左右 ,不超过 15 ?;当 3 、4 月份滇池表面水温 () 射组小鼠肝脏重量均超过体重的 7 % 表 2,肺部颜色亮白 , 达 17 ?以上时 ,束丝藻水华很快消失 ,取而代之的是微囊藻形 与对照组无差异 ;而束丝藻提取物注射组小鼠肝脏均占体重 成的水华 。另外 ,光照强度可能也是束丝藻水华暴发的一个 不足 7 % ,而肺部则颜色发红 ,表现出充血 ,组织受损 。 关键因子 。滇池束丝藻水华暴发的环境依赖因子 ,还有待进 一步研究 。 () ( 样品 1mL经镜检发现 ,绝对优势的是水华束丝藻 Apha2 表 2 微囊藻毒素和束丝藻提取物注射组小鼠肝/ 体重 5) () nizomenon f los2aquae. 占 8211 % 23 ×10ind. / mL,其次是少量 Liver/ body weight of the mice injected with MC2LR and Tab . 2 5( ) () 的微囊藻 Microcystis sp . 占 7. 14 % 2 ×10ind. / mL、鱼腥藻 extracts of Aphanizomenon sp . 5( ) () Anabaena sp1占3. 57 % 1 ×10ind. / mL及 其 它 藻 属 的 一 些 注射毒素 微囊藻毒素 束丝藻提取物 种 。 Toxin injected Microcystin LR Extracts of Aphanizomenon sp . 212 小白鼠生物检测 各组小鼠在进行腹腔注射后几分钟内 ,均略有不适感 ,身 ( )肝重/ 体重 % 体缩成一团 ,可能是由于提取物的酸性引起的 。但对照组和 Liver weight/ Body 8125 ?01405 5139 ?01406 低浓度注射组随后即恢复正常 ,可自如爬动 、饮水和进食 ;原 weight 液和高浓度注射组则表现出精神萎靡 ,行动困难 ,爬行时后肢 麻痹 、无力 、拖地 。十几分钟后 ,即表现出典型的麻痹性贝毒 8 ,9 毒素中毒症状:肌肉颤动 、痉挛 、呼吸困难 、张口 、跳跃 ,终 小鼠中毒症状和解剖实验结果分析表明 ,本次采集的滇 因呼吸困难而死亡 。由于本研究中小鼠中毒症状和死亡时间 池束丝藻水华具有毒性 ,并且可能是麻痹性贝毒毒素 。有关 与报道的麻痹性贝毒致毒症状非常接近 ,为对其毒性大小做 滇池束丝藻水华产毒的种类和产量 ,还有待进一步研究 。 一直观的表达 ,本文按照麻痹性贝毒毒素的计算方法 ,根据 Sommer’s 表 计 算 受 试 材 料 的 毒 性 为 1136MU/ mg 干 藻 。比 参考文献 : Paulo Pereira 等利用从 Montargil 水库中分离纯培养的水华束丝 8 () 1 Wu W L ,Lin X Y ,Liu L P. et al ,Research of Toxins of Main Algaes 藻测得的毒性稍低2123MU/ mg,但比 Lagos 报道的 Cylin2 () drospermopsis raciborskii 的毒性 0181MU/ mg要高 0168 倍 。 () in the Dian Chi Lake J 1Yunnan Environmental of Sci11997 ,16 2: 从小鼠中毒症状及死亡时间看 ,滇池束丝藻水华可能产 26 —291[ 吴为 ,林雄毅 ,刘丽萍 ,等. 滇池水体中主要藻种毒 () 生麻痹性贝毒毒素 。注射高浓度毒素提取液时 ,小鼠中毒死 素研究. 云南环境科学 ,1997 ,16 2:26 —29 Huang Z M1Prevention and cure of Aphanizomenon bloomJ 1 Inland 2 () Aquiculture. 1997 ,11 1:241[ 黄章梅 1 束丝藻水华防治J 1 内陆 () 水产 ,1997 ,11 1:24 Miyoshi Ikawa , John J Sasner , et al1 , Pterins of the cyanobacterium 3 ( ) Aphanizomenon f los2aquae J 1 Phytochemistry , 1995 , 38 5: 1229 — 218 水 生 生 物 学 报 28 卷 8 1232 2 Paulo Pereira , Paralytic shellfish toxins in the freshwater cyanobacteri um Aphanizomenon f los2aquae ,isolated from Montargil reservoir , Portu2 4 In : Lag J . 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