[工程科技]生物无机化学讲义

[工程科技]生物无机化学讲义 第一章 生物配体及其配合物 在大多数情况下，金属元素并不是以自由离子形式存在于生物体内，而是与生物体中具有生物功能的配体形成各式各样的配合物，这些生命内的配位体称为生物配体。按照相对分子量的大小，生物配体可分为两大类:一类为大分子配体，包括蛋白质、多糖、核酸等，其分子量大小从几千到数百万不等;另一类为小分子配体，包括氨基酸、羧酸、卟啉等。 第一节 氨基酸 氨基酸是指含有氨基的羧酸，为蛋白质的基本组成单位。按照软硬酸碱理论，氨基酸具有碱性较强的氨基及碱性较弱的羧基，故氨基酸具有很强的配位能力，能与大多数过渡及稀土元素形成配合物。 一、 氨基酸的结构通式 自然界中已发现氨基酸有上百种，但从蛋白质水解产物中分解出来的氨基酸通常只有20种，而且这些氨基酸，除脯氨酸外，具有相似的结构，均为α-氨基酸，即羧酸分子中α-碳原子的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。其结构通式可用下式表示。式中R 为α-氨基酸的侧链，方框内的基团为各种氨基酸的共同的结构。 -COOHCOO ,,+NHCCNHHH23 RR 不带电形式 带电形式 图1-1 氨基酸结构通式 二、 氨基酸的分类 氨基酸分类法有多种，这里根据组成蛋白质的20种氨基酸的侧链R基的化学结构的不同，分为4大类: 1、 脂肪族氨基酸:? 一氨基一羧基氨基酸:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸;?一 1 氨基二羧基氨基酸及其酰胺:谷氨酸、谷氨酰胺 、天冬氨酸、天冬 酰胺;?二氨基一羧基氨基酸:赖氨酸、精氨酸; 2、 芳香族氨基酸:苯丙氨酸、酪氨酸; 3、 杂环氨基酸:组氨酸、色氨酸; 4、 杂环亚氨酸:脯氨酸。 表1-1 氨基酸分类表 普通名称 中英文简称 结构式 等电点 1、脂肪族氨基酸 -HCHCOO 5.97 甘氨酸 甘 +NH Gly 3 -HCCHCOO 36.00 丙氨酸 丙 + NHAla 3 5.96 缬氨酸 缬 HC3 -COOCHCH2 Val +CH3NH3 HC5.98 亮氨酸 亮 3一 -COOCHCHCH22Leu 氨 CH3+NH3 基 -COOHCCHCHCH6.02 异亮氨酸 异亮 322一 +NH3Lle CH3 羧 HH22-5.74 蛋氨酸 蛋 HCSCCCHCOO3基 +Met (甲硫氨酸) NH3 氨 基 H25.07 半胱氨酸 半胱 -CHCOOHSC酸 +NHCys 3 -5.68 HOCH丝氨酸 丝 CHCOO2 +NH3Ser -CHCOOHCCH36.16 苏氨酸 苏 +OHNH3Thr 2 H3.22 一氨 谷氨酸 谷 2--CHCOOOOCCHC2 +NH3Glu 基二 --HCCHCOOOOC2羧基 2.77 天冬氨酸 天 NH3 氨基 Asp 酸 9.74 二 赖氨酸 赖 NH-(CH)CHCOO224 +NHLys 氨 3 HN2基 10.76 精氨酸 精 -(CH)CHNCHCOO23+HN2+一 Ary NH 3羧 基 氨 基 酸 2、芳香族氨基酸 -5.48 苯丙氨酸 苯 HCCHCOO2 +Phe NH3 -5.66 酪氨酸 酪 HCCHCOOHO2 +Tyr NH3 3、杂环氨基酸及杂环亚氨基酸 -+COOHNHCCH27.59 组氨酸 组 +NHis NH3H -COO5.89 色氨酸 色 HCCH2 +NTry NH3H 6.30 脯氨酸 脯 -COO N+Pro H2 三、 氨基酸的立体异构和旋光性 从上述结构通式可看出，除R为H(甘氨酸)外，所有α-氨基酸分子中α- 3 碳原子都为不对称碳原子。因此，第一，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光 平面向左或右旋转，左旋者通常用(—)表示，右旋者用(+)表示;第二， 每一种氨基酸都D-型和L-型两种立体异构体。蛋白质水解产物中的α-氨基 酸都属于L-型，即与L-甘油醛同型。生物体中，特别是在细菌中也有D-型 氨基酸。D-型氨基酸和L-型氨基酸结构式如图1-2所示。 COOHCOOH CNHHHNCH22 RR D-型氨基酸 L-型氨基酸 图1-2 D-型和L-型氨基酸 四、 氨基酸的酸碱性质 实验证明，氨基酸在水溶液中或晶体状态时都以离子形式存在，与无机盐不同的 -CHRCOO +NH3是它以两性离子的形式存在，即 ，所谓两性离子是指在同一个 +-NHCOO3氨基酸分子上带有能放出质子的 正离子和能接受质子的负离子。因此氨基酸是两性电解质。 氨基酸的两性离子在水溶液中有如下平衡: -OH-OH-CHCOOH-RCHRCHCOORCOO+H+H++NH3NHNH32 正离子 两性离子 负离子 上述三种离子的浓度，随溶液pH而变。如果适当调节水溶液pH，使氨基酸的酸性电离和碱性电离恰好相抵消，氨基酸在溶液中只以两性离子的形式存在，分子的净电荷为零，这时的pH称为氨基酸的等电点(pI)。在等电点的氨基酸分子很容易聚集并沉淀析出，利用各种氨基酸的等电点不同，可使它们彼此分离。 4 第二节 蛋白质 蛋白质是动物、植物和微生物细胞中最重要的有机物质之一。除含有碳、氢、氧、氮外，含有少量的硫。不同蛋白质的含氮均有一定的比例，这是蛋白质的一重要特点。一般蛋白质含氮在15%~17.6%，平均值为16%，因此只要测定样品的含氮量就可以计算求出样品蛋白质含量。实验已经证明蛋白质是由各种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链，再由一条或多条肽链按各自特殊方式组合成完整生物活性的大分子。随着肽链数目、氨基酸组成及其排列顺序的不同，就有不同的三维结构也就形成了不同蛋白质。 一、 蛋白质的一级结构 蛋白质的结构分为四级。蛋白质的一级结构是指肽链的数目、肽链中氨基酸的连接方式和排列顺序，以及二硫键的数目和位置。二级以上是指空间结构。 肽链中的肽键是由一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合去一个水分子而成。下图为蛋白质中多肽链一个片断的结构通式，表示氨基酸的种类、连接方式和排列顺序。 CHCHCOOHHNCNHCHCNHNHCH2 OORR3nRR21 肽链上的R、R、R„代表各种氨基酸的不同侧链。它们对维持蛋白质分123 子的立体结构和行使蛋白质功能都起着重要作用。方框内为肽键，多个氨基酸以这种方式首尾相连而形成肽链。肽链中的氨基酸已不是原来完整的分子，而是具 HNCHC RO有 结构的氨基酸残基。 在蛋白质和多肽分子中，连接氨基酸残基的共价键除肽键外，较常见的还有二硫键，它由两个半胱氨酸残基的巯基脱氢氧化连接而成。它可以使两条肽键共价交联，或使一条肽链的某一部分成环。 5 R 1R2 HNCHCONHCHCONHCHCOCH2SSS SCH2HNCHCONHCHCONHCHCO SSR34 R 图1-3 蛋白质肽链中和肽键间二硫键示意图 二、 蛋白质的二级结构 蛋白质分子的多肽链并非呈直线伸展，而是盘曲和折叠成特有的空间构象。蛋白质二级结构指多肽链盘曲折叠方式。目前公认二级结构主要指α-螺旋、β-折叠结构。 1、 α-螺旋结构 其要点如下:?α-螺旋结构中，每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升1圈。螺旋沿螺旋体的中心轴每上升1圈相当于向上平移0.54nm，即每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm。螺旋上升时，每个残基沿轴旋转100?。?α-螺旋体中氨基酸残基侧链伸向外侧，相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键取向几乎与中心轴平行。氢键是由每个氨基酸残基的N-H 与前面隔三个氨基酸残基的C=O形成的。α-螺旋体的结构允许所有肽键都能参与链内氢键的形成，正是由于氢键的作用，α-螺旋的构想非常稳定。螺旋体内氢键形成示意图如下: HO CNHNHCCO3R α-螺旋结构有左手螺旋和右手螺旋两种，天然蛋白质的α-螺旋绝大多数为右手 结构。蛋白质多肽链螺旋。近年来，也偶尔发现极少数蛋白质中存在左手α-螺旋 能否形成α-螺旋结构以及形成的螺旋体是否稳定，与它的氨基酸组成和序列有直接关系。如多肽链中有脯氨酸时，α-螺旋就会被中断，并产生一个结点，这是因为脯氨酸的α-亚氨基上氢原子参与形成肽键后，再没有多余氢原子形成氢键，所以肽链序列上有脯氨酸残基时，肽链就不转弯不再形成α-螺旋。 2、β-折叠结构 在β-折叠结构中，肽链采取较伸展的形式，各条肽链的长轴平行，相邻肽链之间借助氢键连接成如图1-4的片状结构。这种由一条肽链的羰基和另一个肽链 6 的亚氨基形成。在β-折叠结构中，所有肽链均参与构成链间的氢键，并且氢键与肽链长轴接近垂直。 NHCOO RCCR-2 HNOC OCHN RRCC COHN HNOC CRRC NHCO OHNC RCCR 图1-4 β-折叠结构 三、 蛋白质的三级结构及四级结构 多肽链首先在某些区域相邻氨基酸形成有规则的二级结构，然后以相邻的二级结构片段集装成超二级结构，进而折叠绕曲成结构域，由两个或两个以上的结构域组装成三级结构。蛋白质三级结构是指多肽链上的所有原子在三维空间的分布。 大多数相对分子质量大的蛋白质都是由几个多肽链组成为1个活性单位。这些肽链相互以非共价联结成一个相当稳定的单位，这种肽链就称为该蛋白质的亚基。蛋白质的四级结构是指亚基之间的相互关系，空间排布，亚基间通过非共价键聚合而成的特定构象。亚基单独存在，无生物活性或活性很小，只有通过亚基相互聚合成四级结构时，蛋白质才是具有完整的生物活性。 四、 蛋白质分子中的共价键及非共价键 蛋白质分子的一级结构是由共价键形成，如肽键和二硫键都属于共价键。而维持蛋白质的空间构象的作用力主要是非共价键作用，包括氢键、盐键、疏水键范德华力等。氢键是维持蛋白质二级结构如α-螺旋结构、β-折叠结构等构象的作 7 用力，如前所述，这种氢键不但存在于多肽链的链内，而且链间的也存在大量的氢键。疏水键是指多肽链上疏水性较强的氨基酸如缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等具有芳环或杂环等疏水侧基可以避开水而相互聚集在一起，形成孔穴，对维持蛋白质的三级结构起着重要作用。盐键是指蛋白质中正负电荷的侧基相互接近，通过静电吸引而形成的非共价键，如羧基和氨基、咪唑等基团之间的作用力。范德华力是指分子间非极性基团的偶极与偶极之间的相互作用，以及极性基团的偶极与偶极之间的相互作用。 8 第三节 核酸 1869年Miescher 从脓细胞的细胞核中分离出含磷很高的酸性化合物，称为核素，1889年Altman 制备了不含蛋白质的同类物质，首次使用“核酸”这一名称，以后四五十年里，Kossel等人在确定核酸组分方面做了大量而卓有成绩的工作，逐步明确了核酸可分为两大类，含脱氧核糖的称为脱氧核糖核酸(DNA)，含核糖的称为核糖核酸(RNA)。1943年Avery通过细菌转化实验证明了DNA是重要遗传物质，第一次向人们展示了DNA的生理功能。1953年，两个年轻科学家在前人工作的基础上，提出了DNA的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生命遗传物质，提出DNA的半保留复制机理，为现代分子生物学奠定基础。 1975年Berg建立了DNA体外重组技术 — 基因工程，使核酸的研究取得了迅猛的发展，并逐步转向实际应用。所有这些划时代的发现，无不改变人们的生活，成为人们探索生命奥秘和创造最大财富的武器。2001年，美、英、日、法、德和中国科学家宣布共同完成了人类基因组序列的测试工作，这是继发现DNA结构后生命科学中的又一里程碑，标志着人类基因组时代的到来。 在揭示核酸这一生命遗传物价的遗传奥秘的进程，一系列工具酶的使用起着重要作用，使人们有可能对DNA和RNA的结构进行详细，并有可能将不同来源的遗传物质重新组合，赋予生物体新的性状，或按照拟定的蓝图出新的生物体。 一、 核酸的化学组成与分类 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。核酸的逐步水解过程如下图: 9 核酸 核苷酸 (碱基-戊糖-磷酸) 核苷酸 磷酸 (碱基-戊糖) 嘌呤和嘧啶 核糖或脱氧核糖 (碱基) (戊糖) 图1-5 核酸连续水解的降解产物 1、核糖和脱氧核糖 RNA和DNA两类核酸是因所含的戊糖不同而分类的。核酸分子中的戊糖都是β-D-型，RNA含D-核糖，DNA含D-2-脱氧核糖，两者不同之处在于核糖的第二个碳原子上羟基甲基化。为了避免与碱基环上的原子编号混淆，糖环碳原子编号通常加“?”。 ,,55OHOHHOHCHOHC22OO,,,,44,, ,,,,,,,, OHOHOH β-D-核糖 β-D-脱氧核糖 图1-6 核糖和脱氧核糖结构图 2、嘌呤碱和嘧啶碱 两类核酸所含的主要碱基都是4种，两种嘌呤碱为嘌呤的衍生物，两种嘧啶碱为嘧啶衍生物。它们所含的两种嘌呤碱完全相同，即腺嘌呤和鸟嘌呤。DNA和RNA所含的嘧啶碱有所不同。RNA主要含胞嘧啶和尿嘧啶，大多数DNA也含胞嘧啶，但不含尿嘧啶而以胸腺嘧啶代之。嘌呤碱和嘧啶碱分子中都有共轭双键，各有特征的紫外吸收光谱。 10 NH2O NNNNNNH NNNNNHNN2HHH 腺嘌呤 Ade 鸟嘌呤Gua 嘌呤 OONH2 NHNHNN NONONONHHH 嘧啶 胞嘧啶 Cyt 尿嘧啶Ura 胸腺嘧啶 Thy 图 1-7 嘌呤碱和嘧啶碱 3、核苷 核苷由碱基和核糖或脱氧核糖缩合而成。戊糖的第1个碳原子(C?)通常1与嘌呤碱的第9个氮原子或嘧啶碱的第1个氮原子相连。连接碱基和戊糖的N-C键称为N-糖苷键。X-射线结构分析证实，核苷的碱基与糖环平面相互垂直，如图1-8 为腺嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的结构。 NH2NH2 NNN19CHOHCHOHN2NO2NOO,,11 OHOHOH 腺嘌呤核苷 胞嘧啶脱氧核苷 图1-8核苷 核苷用碱基第一个字母符号表示(A、G、C、U)表示，脱氧核苷则在单字符号加小写的d(dA、dG、dC、dT)。常见的核糖核苷有四种:腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)、尿嘧啶核苷(U);常见的脱氧核糖核苷有四种:腺嘌呤脱氧核苷(dA)、鸟嘌呤脱氧核苷(dG)、胞嘧啶脱氧核苷(dC)、胸腺嘧啶脱氧核苷(dT); 11 4、核苷酸 核苷中的戊糖上羟基与磷酸酯化后就形成核苷酸。根据戊糖的不同，把核酸分为两大类:核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。核糖核苷酸的糖环上有三个自由羟基，能形成2?—，3?—，5?—三种不同核苷酸;脱氧核糖苷则只能形成3?—和5?—两种核苷酸。 NH2 ON 5,1-OOPHC2ONO,1-O OH 图1-9 5?-胞嘧啶脱氧核苷酸 二、 核酸结构 1、 核酸的一级结构 构成核酸大分子的基本单位是核苷酸。研究证明DNA和RNA都是没有分支的多核苷酸长链。链中每个核苷酸的3?-羟基和相邻核苷酸的戊糖上5?-磷酸相连。因此，核苷酸间的连接键是3?，5?磷酸二脂键，由相间排列的戊糖和磷酸构成核酸大分子的主链，而代表其特性的碱基则可以看成是有次序地连接在主链的侧链基团。主链上的磷酸基是酸性的，在生物体内pH条件下带负电荷;而嘌呤和嘧啶碱基因相对不溶于水而具有疏水性质。另外，由于所有核苷酸间的磷酸二酯键有相同的走向，RNA和DNA链都有特殊的方向性，而每条线形核酸链都有一个5?-末端和一个3?-末端。 12 ,端基5 NH2 NON腺嘌呤OPOCHN2NO-O NH2OH胞嘧啶NO ONPOCHO2O-O OOHNNH鸟嘌呤O OPCHNONHN22O-O OHO NHO尿嘧啶 OPCHNOO2O-O OH ,3端基 ,端基5 NH2 NON腺嘌呤OPOCHNN2O-O NH2 胞嘧啶NO OPNOOCH2O-O O NNH鸟嘌呤O OPOCHNNH2N2O-O O NHO胸腺嘧啶 OPOCHNO2O-O ,3端基 图1-10 核酸(上图)和脱氧核糖核酸(下图)片段结构 13 2、 DNA的双螺旋二级结构 1953年年轻科学家Watson和Crick 在前人工作基础上提出著名的双螺旋结构模型，后人许多工作证明，这个模型基本是正确的。其要点: (1)DNA分子是由两条方向相反的平行多核苷酸链构成的，一条链5?-末端与另一条3?-末端相对(如图1-11)。两条链的糖-磷酸主链都是右螺旋，有一共同的螺旋轴，螺旋表面有一条大沟和一条小沟。 PP2,3,5,1,1,A4,T4,3,5,2,PP CG PP CG PP CT PP 图1-11 DNA双螺旋的两条链 (2)两条链上的碱基均在主链的内侧，一条链上的A一定与另一条链上的T配对，G一定与C配对，其间距离刚好与双螺旋的直径吻合。根据碱基构象研究结果，A与T配对形成两条氢键，G与C配对形成3个氢键(图1-12)。由于碱基对的大小基本相同，所以无论碱基序列如何，双螺旋DNA分子整个长度的直径相同，螺旋直径为2nm。 H HCH3NCCHCCHHCOHTGOCCHNNNACNNHCNC1,HNCCNCNC1,OHCHCOCHCCHNNNNN HC1,C1, 14 图1-12 DNA 双螺旋结构中碱基对间氢键 A-T 碱基对间两条氢键;G-C碱基对间三条氢键;C1 表示脱氧核糖中第1个碳原子 (3)成对碱基对大致处于同一平面，该平面与螺旋轴基本垂直。糖环平面与螺旋轴基本平行，磷酸基连在糖环的外侧。相邻碱基对平面间距离为3.4Å，该距离使碱基平面间π电子云可在一定程度上相互交盖，形成碱基堆积力。双螺旋每转一周有10个碱基对，因而每转的高度为34 Å。 维持DNA双螺旋结构的主要作用力是碱基对堆积力，它是由芳环族碱基的π电子相互作用引起的。DNA分子中碱基层层堆积，在DNA分子内部形成了一个疏水环境，从而促使互补碱基对间形成氢键。第二种力是互补碱基对间的氢键 ，它在使碱基形成特异配对时起重要作用。第三种力是磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子之间的形成的离子键，因为在生理pH条件下，DNA带有大量负电荷，如果没有阳离子与它成键，由于自身不同部位的负电荷间的排斥作用，将使DNA非常不稳定。 图1-13 DNA双螺旋结构模型 15 3、 DNA的三级结构 在双螺旋结构的基础上，DNA还可以形成三级结构。除了上述链状结构外，生物体普遍采取双链环型DNA的形式。完整的双链环型DNA在某些情况下可以扭曲成麻花状的超螺旋或超卷曲结构。 4、 DNA的构型 DNA的主要结构形式有B型、A型和Z型。另外，还有其他如发卡结构等一些不规则的结构形式。DNA 中最常见的结构为B型，它的主要结构特点是; ?右手螺旋结构;?分子以大沟和小沟交替缠绕;?平行的碱基对之间平均距离为0.34nm;?碱基中糖环采取C2?向内的折叠形式。A型DNA也是右手螺旋结构，但碱基中的糖环取C3?向内的折叠形式，所以与B型DNA相比，它的形状较宽，大沟较深，小沟较窄，碱基对之间的平均距离为0.23nm。Z型DNA为左手螺旋，它的碱基序列特点是嘌呤和嘧啶交替伸展，没有明显的大沟、小沟之间的差异。 16 第四节 氨基酸、肽、蛋白质的金属配合物 一、氨基酸、肽的金属配合物 氨基酸具有很强的配位能力，多作为二齿配体，以α-碳上的氨基和羧基作为 配位基团与金属离子配位，形成具有五元环结构的稳定螯合物，如图1-14 所示 在一定条件下，某些氨基酸的侧链上的基团如咪唑环等也可以参加配位。 图1-14 L-酪氨酸与铜离子、钯离子形成的配合物 肽与金属离子配位时，除末端氨基、羧基和氨基酸残基侧链的某些基团可作为配位基团外，肽键中羰基和亚氨基也可能参与配位，一般金属-蛋白质配合物的结构相对较为复杂。 二 、蛋白质的金属配合物 蛋白质与金属离子的配位与氨基酸和寡肽有显著的不同，在金属蛋白质分子中，两个配位原子之间往往隔有一定数目的氨基酸残基。金属离子和蛋白质形成配合物后，金属可影响蛋白质电子结构和反应能力，并对蛋白质的结构起稳定作 17 用。金属-蛋白质配合物的结构可分为两类:一类是金属离子与蛋白质牢固结合在一起，金属离子是蛋白质的组成部分，当金属离子移去或被取代后，金属蛋白的活性将随之失去。在这一类金属蛋白质中，金属与蛋白质之比为一恒定常数，金属与蛋白质组成一个稳定的配合物。另一类是金属和蛋白质结合较弱，金属极易通过渗析法除去，且金属与蛋白质的比例不恒定。 18 第二章 金属配合物与DNA相互作用的研究 众所周知，核酸是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基因表达的物质基础，它在生物的生长、发育和繁衍等活动中起着十分重要作用。Watson 提出的DNA双螺旋二级结构给分子生物学带来了希望之光，但是，他们提出的DNA的主链形成的右手螺旋的假设即B-DNA 一直没有得到有力的证明，曾在国际上存在一系列的争论。而且，科学家们还在兔血中证实了左手螺旋DNA即Z型DNA的存在，生物体中B-DNA和Z型DNA之间存在一定平衡状态。目前，从天然及合成的核酸的X射线衍射分析还发现有A-DNA、C-DNA、D-DNA等构型，尽管它们都为双螺旋结构，但它们的结构具有明显不同。这一发现能够解释许多特征生命现象，引起世界各国科学家的高度重视。20世纪80年代，生物无机化学家在研究金属离子与核酸的相互作用机制时，发现某些金属配合物可作为DNA的结构探针，用于判别B-DNA和Z型DNA。 B-DNA的疏水型碱基位于螺旋的内侧，具有亲水性的磷酸二酯键形成多聚核苷酸为主链外侧，由于Z-DNA中碱基鸟嘌呤的C-8和N-7暴露于双螺旋的外侧，受保护程度小，容易受化学致癌剂攻击而引起化学反应，因此，Z-DNA可能与突变、基因表达和调控有关。DNA为抗癌药物的重要靶标之一，科学家们已经证实临床顺铂的抗癌机理，顺伯中的Pt原子能够与DNA小沟中的同一链上相邻鸟嘌呤[dGPG]的N7共价结合形成链内加合物，使DNA双链解旋并弯曲，从而起到抗癌作用。 因此，金属配合物和大分子DNA相互作用研究来探索DNA的结构与功能，将有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质，并从基因水平上理解癌症、遗传病、艾滋病等疾病的发病机理和药物作用机理，从而使通过分子设计寻找有效的治疗药物成为可能。插入DNA的某些配合物将可作为人工核酸酶、DNA结构探针、DNA分子光开关试剂、DNA断裂试剂和抗癌药物等。 19 第一节 配合物与DNA的作用方式 核酸由平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条有核苷酸链形成的大沟、小沟组成了配合物分子识别的位点。小分子与DNA的结合常常诱发很多生物效应，这种结合按化学键来划分主要有非共价键结合和共价键结合。 一、非共价结合 非共价结合包括静电力结合、沟内结合和嵌插结合，如图2-1所示。另外氢键、范德华力、疏水键等弱相互作用使配合物小分子通过沟内或嵌插结合在DNA的螺旋沟或碱基中，加上静电力作用，会诱导许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达。 图2-1 DNA与小分子的非共价结合的三种模式 (1)外部静电结合 核酸是一个高度带电的聚合电解质，它的阴离子磷酸根部分强烈地影响DNA的构象及其反应。小分子与DNA 的静电结合即小分子通过非特异性的相互作用结合于带负电的DNA双螺旋外部的磷酸骨架，如图2-1(1)示。有些小分子与DNA的静电作用队其与DNA间的嵌插作用起重要的稳定作用。 (2)沟内结合 很多蛋白质与DNA的特异性结合是发生在DNA的大沟内，而小分子一般在小沟区作用。大、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大的不同。大多数的沟内结合的小分子含有芳香杂环结构如呋喃、吡咯或苯环，这些苯环有扭转自由的键连接着，由此产生合适的扭转力来配合小沟内螺旋曲线，取代沟区内的水分子并于DNA双螺旋链中的沟区的碱基对边缘通过范德华 20 力形成接触，小分子在小沟区结合的特异性也缘于此。 沟内结合的小分子就是这样选择性的作用于DNA双螺旋结构中AT较为丰富的片段，通过氢键、范德华力等作用，非嵌入性地捆缚住DNA，从而阻止DNA的模版复制，起到抗病毒、抗肿瘤的作用。 (3)嵌插结合 嵌插结合是药物分子与DNA发生作用的重要形式之一。它是以平面或几乎平面的芳香杂环嵌入DNA的碱基对中如图2.2(3)。这是芳环的离域π体系与碱基π体系的π-π相互作用及疏水作用的结果。当小分子嵌入DNA碱基对后，有的可能抑制DNA复制与转录功能，有的则在经过进一步活化后使DNA断裂 时具有识别DNA构受损而影响其功能。而且手型配合物与DNA 发生嵌插结合 2+3+ 型等的能力，如科学家们在研究[Zn(phen)]、[Co(phen)]和[ Ru(bipy)(HNOIP)]3322+等手性配合物与DNA的作用时发现，这类手性金属配合物与DNA作用时，只有一个Phen 插入到DNA的碱基对之中，另外的两个phen留在DNA的双螺旋 2+外，?型[Zn(phen)]与右手螺旋的DNA作用时，未插入DNA的两个phen刚3 2+好与B型DNA分子空间匹配;?型[ Ru(bipy)(HNOIP)]的两个bipy与右手螺2 旋的DNA的磷酸骨架碰撞，而未能插入B型DNA中。当与左手螺旋的Z型DNA作用时，情况刚好相反，?型配合物优先与其发生嵌插作用，?型配合物由于手性不能匹配，未能插入。这表明手性配合物对DNA作用具有立体选择性分子识别能力，可作为DNA二级结构的结构探针。 图2-2 手性配合物的分子结构图 二、共价结合 共价结合包括与亲核试剂的作用和与亲电试剂的反应。主要表现为DNA的烷基化及DNA的链间交联和链内交联等，与非共价结合相比，DNA靶向分子与 21 DNA共价结合序列特异性识别能力要强的多。小分子与特定碱基作用并形成加合物，使DNA双链解旋并弯曲。如顺伯中的Pt原子能够与DNA小沟中的同一链上相邻鸟嘌呤的N7共价结合形成链内加合物，使DNA双链解旋并弯曲。 图2-3 cis-[Pt(NH)]离子与DNA片段分子d(GGAGACCAGAGG)(上图)和(dpGpG)(下32 图)形成的链内加合物晶体结构 22 第二节 配合物与DNA作用的研究手段 为探讨DNA与金属配合物间的相互作用及作用机理，许多研究方法和技术被引入此研究领域。 一、 紫外/可见光谱法 含有碱基生色团的双螺旋结构DNA分子，其UV/Vis吸收光谱在260nm附近有一强吸收峰，当小分子与核酸结合后，对核酸或小分子吸收峰的吸收光谱都会引起变化，可根据相互作用前后DNA或其它分子的吸收谱带的变化对金属配合物与作用模式进行判断。 对于DNA的吸收光谱来说，如导致构象变化，则产生减色效应和红移现? 象，且作用越强减色效应越明显;如导致DNA双螺旋结构的破坏，则产生增色效应。 ? 对于金属配合物等小分子的特征吸收谱带。当金属配合物嵌插如DNA碱基对中，即发生插入作用时，将会发生减色效应，这是因为DNA碱基对与插入配体间发生π电子嘴积，使后者的π*空轨道上也有一定的电子填充，从而使MLCT跃迁的几率减少。减色效应的强弱，能够反映插入能力的大小，插入能力越强，减色效应越强。与DNA发生插入作用后的配合物，插入配体与DNA碱基对间发生π电子堆积后，配合物的配体共轭性加强，产生红移现象，红移程度反映出插入能力的大小。插入能力强的配合物，红移较大，插入能力弱的配合物，红移较小。如图2-4所示，我们课组合成的[Pd(phen)(trp)]Cl?5HO和[ Pd 2(NOphen)(trp)]Cl?5HO与DNA相互作用的紫外光谱图，配合物与DNA发生后22 发生红移和减色效应，证明与DNA发生了嵌插作用。 图2-4 [Pd (phen)(trp)]Cl?5HO及[Pd(NOphen)(trp) ]Cl?5HO与DNA作用的紫外光谱图 222 23 二、荧光光谱法 荧光光谱作为一种快速、灵敏的谱学技术应用于DNA与小分子相互作用的研究。可根据两者相互作用前后荧光强度的变化判断小分子与DNA的作用模式。溴化乙锭(EB)是应用最早的荧光探针，被广泛应用于抗癌药物的筛选和小分子与DNA作用的研究，它是一共轭平面分子，本身荧光很弱，但能专一地插入DNA双螺旋或三螺旋内部的碱基对之间，形成EB-DNA复合物，因而荧光强度大大加强。当有能与其竞争插入DNA的配合物存在时，EB会被配合物从DNA中挤出来，而体系的荧光强度减弱。李志良等报道的荧光筛选法:如果药物使EB-DNA体系荧光减弱50%以上，且药物与DNA的物质的量浓度比不超过 -100，以此为标准，认为药物与DNA发生了显著作用。 另外，I和 [Fe(CN)4-]都是典型的荧光猝灭剂，通过考察它对小分子荧光的猝灭作用可判断小分子4 与DNA的作用方式。若小分子与DNA发生插入结合，带有负电荷的DNA磷酸 4-骨架对[Fe(CN)]有强烈的排斥作用，因而插入结合的阳配离子受到保护，被4 4-[Fe(CN)]猝灭发光的可能性小。图2-5 为溴化乙锭的结构图，图2-6 为我4 们合成的钯(?)-联喹啉-丙二酸 [Pd(biqu)(mal) ]?H2O 与鱼精DNA发生嵌插作用的荧光光谱图。a为 配合物的荧光光谱，b-e为向配合物的溶液中滴加DNA的荧光光谱, 由图可看出随DNA 量的增加，配合物荧光强度逐渐增强，这是由于配合物插入DNA 后，DNA 碱基对的疏水环境对配合物荧光发光具有保护作用，从而证明配合物与DNA 发生了嵌插作用。 CHCH32NH2+N -Br NH2 图2-5溴化乙锭的结构图 24 -6 DNA对[Pd(biqu)(mal) ]?H2O 荧光光谱的影响 图2 三、圆二色光谱法 圆二色光谱 (CD)以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研究提供了很多信息，是目前研究有机化合物和生物大分子的构型、构象和三维空间结构强有力的工具，可现场检测构象己知的生物大分子构象变化过程。CD谱是DNA螺旋构象的非常敏感的指示剂，可给出与DNA作用的小分子的某些基团跃迁谱带变化的信息，进而可获得二者键合方式的信息。一方面根据DNA在260nm处的吸收提供有关结构信息，另一方面对一些本身没有CD信号，但与DNA结合后能产生诱导CD信号的分子，可获得一定的有关其结构的间接信息。CD光谱是研究配合物与DNA作用方式的重要方法，根据光谱形状和吸收强弱可以判断DNA构型的转变。图2-7 鱼精DNA及配合物[Pd(L-tyr)] ?0.5HO /DNA 复合物的CD光谱图，a 为鱼精DNA，22 b、c为配合物/DNA 复合物的CD，由图可看出，当向DNA溶液中加入配合物后，DNA的正负吸收均有增加，形状并没有发生变化，因而此化合物主要以插入作用与DNA发生了相互作用。 25 图2-7 鱼精DNA及配合物[Pd(L-tyr)] ?0.5HO /DNA 复合物的CD光谱图 22 四、黏度法 通常在缺少高精度晶体结构数据和核磁数据时，黏度这种流体力学方法是检测溶液状态下配合物与DNA作用方式的有效的重要手段。当小分子配合物与DNA发生插入作用时，DNA的相邻的碱基对之间的距离会变大以容纳插入型配体，导致DNA双螺旋的链增长，DNA的黏度增加;当配合物以静电或沟面结合等非插入模式与DNA作用时，DNA双螺旋长度基本不变，DNA溶液的乃浓度也没有明显变化，而当配合物以部分插入方式同DNA作用时，会使DNA双螺旋扭结，以至于DNA双螺旋长度减少，进而导致DNA溶液黏度减小。 五、凝胶电泳法 在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态的蛋白分子，将向着与其相反的电极移动，这种现象称为电泳。核酸DNA在一定的PH值下带有负电荷，在电场中向正电极移动。以琼脂糖为支持介质的凝胶电泳广泛应用于分子生物学领域，是定量、分离、鉴定和纯化DNA片段的主要方法。 带电颗粒在电场中的泳动速度主要取决于它所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。当带电颗粒在电场中泳动时，受到两种方向相反的力的作用:电场力，摩擦力，而DNA通过琼脂糖凝胶的电泳速率取决于以下4个主要参数: (1) DNA分子大小线状双链DNA分子被认为是以一端向前方移动，它在凝胶基质中的迁移速率与其碱基对数目以10为底的对数值成反比，分子越大，越 26 难于在凝胶中孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 (2)琼脂糖凝胶浓度同样大小的DNA片段在不同浓度琼脂糖凝胶中迁移速率不同。因此，利用不同浓度琼脂糖凝胶可以分辨范围广泛大小不同的DNA片段。 (3) DNA构型相同分子量，不同构型的DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同。在TAE缓冲液中，迁移速率:超螺旋(CCC)>线状(OP)>开环(OC)o (4)应用的电流在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。但是当电场强度增加时，DNA片段的迁移速率的增大是不同的。因此，琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段最大的分辨力，凝胶电泳不应超过5伏/厘米。 图2-8 为Inorg.Chem.在近期发表的配合物 对DNA的切割电泳图，M 为Marker DNA ,1为纯 pBRDNA ,2-7为向pBRDNA加入一定量后DNA谱带的变化。其中，?为超螺带，?缺口环化带，?线性带。 图2-8 对DNA的切割电泳图 六、X-射线单晶衍射法 X-射线单晶衍射法用于生物大分子的结构研究开始于20世纪60年代，是研究配合物与DNA作用的最有效的方法。它能够提供配合物与DNA的具体键合位点，并给出配合物-DNA加合物的真实的立体结构。顺铂的抗癌机理在科学家们研究20余年后正是利用此手段证实了其机理的。但是要进行X-射线单晶结构分析，首先要得到一定大小和质量好的单晶。而由于制备配合物-DNA加合物单晶极其困难，所以关于配合物-DNA的单晶数据很少，科学家们多采用DNA的核苷酸片断或碱基对来合成配合物-DNA的单晶。我们课题组通过活性钯配合物与DNA的碱基对之一腺嘌呤反应，成功合成了活性配合物单晶，发现 2+[Pd(phen)]与腺嘌呤的N3配位，这为钯配合物的抗肿瘤机理提供一定的科学依2 据。 27 图2-9 配合物[Pd(phen) (ade)]的分子结构图 222 28 第三章 无机抗癌药物 第一节 铂配合物抗癌药物进展及其抗癌机理 一、铂配合物抗癌药物进展 1、第一代铂药物 1965年美国密执安州立大学科学家B.Rosenberg 等在研究电场对细菌生长的影响时偶然发现，在含NHCl的大肠杆菌培养液中用铂电极通入直流电，大4 肠杆菌细胞分裂就会受到抑制，生长成相当于正常细胞300倍大的菌丝。但更换其它电极就观察不到这种现象。进一步研究表明，电流使微量的铂进入培养液，生成顺二氯二氨合铂(cis-dichlorodiammineplatinum,cis-DDP)，cis-[Pt(NH)Cl] 322(简称顺铂) ，这种配合物对细胞分裂有强烈抑制作用。1969年B.Rosenberg 等又首次报道了顺铂具有很强的抗癌活性，这些发现开创了金属配合物抗肿瘤药物研究的新领域。经过一系列后续研究，cis-DDP于1971年进入临床试验，1978年美国FDA批准，cis-DDP为睾丸肿瘤和卵巢癌的治疗药物，故称为第一代铂类药物。目前，它是最有效的抗癌药物，其特点是抗癌活性高，抗癌作用强，与其它抗癌药物交叉耐药小，可联合用药。 cis-DDP除用于生殖癌细胞的治疗外，还可以用作黑色素瘤、头颈部癌、甲状腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、食道癌、肝胚细胞瘤、神经细胞瘤、骨肉瘤、视网膜细胞瘤等多种癌症治疗，具有抗癌广普性。cis-DDP与紫杉醇和5-氟尿嘧啶药物联合使用，可显著提高对某些癌症的治疗效果，已经成为全球最广泛使用的抗肿瘤药物之一，每年的销售额达5亿美元。但cis-DDP在临床应用中也存在一些缺点，有较严重的毒副作用，如肾毒性、神经毒性、耳毒性和胃肠道毒性等，又由于其溶解度较低，也限制其使用。 2、第二代铂药物-卡铂 为了克服顺铂在临床上的缺点，科学家们研制出第二代铂类抗肿瘤药物-卡铂，其分子结构式见图3.1。卡铂是顺式1，1?环丁烷二酸二氨合铂的简称，是美国施宝公司、英国癌症研究所及Johnson Matthey 公司于80年代合作开发的，与1986年在美国上市，1988年由山东大学王慧才教授在国内研制成功，于我国上市。 卡铂的主要特点:(1)化学稳定性好，水溶性比顺铂高;(2)毒副作用低于 29 顺铂，主要毒副作用是骨髓抑制;(3)作用机理与顺铂相同，可以替代顺铂用于一些癌症的治疗;(4)与非铂类抗癌药物无交叉耐药性，可以与多种抗癌药物联合用药。卡铂由于其毒副作用较少，抗癌活性与顺铂相当已被患者接受，是非小细胞肺癌、小细胞肺癌、卵巢癌、胚细胞癌和肝胚细胞等5种癌症的首选药物。 O NHO3CHNCl3Pt PtOCHN3 ClNHO3 ONH2OOONH2CH2PtPt OONHNH2O2O 图3-1 顺铂、卡铂、澳沙利铂和奈卡铂的结构图 3、第三代铂类抗癌药物- 奥沙利铂、奈卡铂 虽然顺铂和卡铂在临床上对多种癌症具有很好的抑制作用，但是其对如结肠直肠癌等癌症的抗癌活性很低，其它癌症如卵巢癌等在初期治疗后也对顺铂产生后天耐药性，因而它们的使用具有局限性，因而科学家们研制出了能够克服顺铂和卡铂交叉耐药性的第三代铂类药物-奥沙利铂和奈卡铂。 第三代铂类药物具有三个明显的优点:(1)与顺铂无交叉耐药性;(2)口服吸收好;(3)与顺铂具有不同剂量限制性和毒谱性。 奥沙利铂全称草酸合铂，由瑞士Debiopharm 公司研制开发，法国Sanofi 公司生产销售，并于1996年在法国率先上市，我国于1999年批准奥沙利铂针剂进口，2000年南京制药厂研制开发国产奥沙利铂获国家药检局批准，命名为奥铂。 奥沙利铂作为一种稳定的、水溶性铂类烷化剂，是第一明显对结肠癌有效以及在体内外均有光谱抗肿瘤活性的铂类抗肿瘤药物，它对耐顺铂的肿瘤细胞亦有较好的抑制活性。 奈卡铂是日本盐野义研制开发的一种抗肿顺铂药物。1995年在日本首次批准上市，可用于治疗头部肿瘤、食道癌、小细胞癌、卵巢癌等肿瘤。它对头部肿瘤有40%以上有效，优于顺铂，对肺癌有效率与顺铂相当，对食道癌有效率大于50%，高于顺铂20%，对宫颈癌的有效率亦在40%以上。 30 4、其它铂类药物 铂,?,配合物 除Pt(?)以外的Pt(?)配合物是另一类抗癌药物的研究对象。具有脂溶性的Pt(?)配合物被认为是口服铂抗癌药的选择之一。主要有:?、异丙铂(iproplatin,CHIP,JM-9)，即二氯二羟基?二异丙胺合铂;?、奥马铂(ormaplatin),即四氯?环己二胺合铂;?、JM216(Saraplatin)，即二氯?二乙酸根?一氨?环己胺合铂;?、其它混胺类Pt(?)配合物，其中配体中含有脂肪链烃、脂环烃或芳烃，上述这些Pt(?)配合物对卵巢癌、亚系L1210、前列腺癌、SKOV-3等都 [7~12]有一定的效果，但由于毒性等因素尚不能作为药物使用。 反式铂配合物 研究发现，反铂中NH被其它配体如吡啶、喹啉、亚胺基醚、RNH2等配体3 取代时，配合物也显示出一定的抗癌活性，原因之一可能是反式构型能异构成顺式构型。另外，cis-DDP与反铂的差异在于反铂的动力学反应活性较大，易被失 [16~18]活。由于反式构型的DNA加合物不同于顺式构型，因此它可能克服耐药性。通式为PtCl(L)(L?)的三个系列反式配合物:(1) L= L?=吡啶或N-甲基 2 咪唑或噻唑;(2) L=喹啉，L?=RR?SO;(3) L=喹啉，L?= NH ，抗药性细胞株3 L1210的活性比cis-DDP强。此外，含有脂肪链或亚胺基醚配体配合物在对P388肉瘤、卵巢癌的治疗中也有较好的效果。 多核铂配合物 为了寻找新的构效关系，人们尝试设计了桥联的多核铂配合物。其中三核配 4+合物[Pt (Cl) (NH)-NH- (CH) NH -Pt (NH)- NH(CH) NH-PtCl (NH)]已3226232226232于1998年进入?期临床。另有一些脂肪二胺桥联Pt(?)双核、三核、四核和涉及硫脲、精胺、亚精胺配合物也具有显著的活性，开辟了多核配合物研究领域。 铂高分子配合物 为克服cis-DDP的半衰期短，毒副作用大，水溶性小等缺点，人们设计将cis-DDP结合到高分子链上，以达到高效、低毒和缓释的作用。美国Allcock小组选用生物相容性好，水溶性的甲氨基聚膦腈高分子，将cis-DDP与聚腈链上的氮原子络合，生成Pt高聚物。药理研究表明，该化合物抗癌效果显著，武汉大学和山东医科大学的学者也制备了不同载体系列铂高分子配合物，其毒性明显低 31 于cis-DDP，但疗效与cis-DDP相当。 二、顺铂抗癌机理 顺铂类抗癌药物是一类不同于有机抗癌药物的新药物家族，其抗癌机理与有机药物不同，经过科学家们对其抗癌机理一系列研究，目前已初步确定铂类抗癌药物的抗癌机制可分为四个步骤:跨膜运转、水合离解、靶向迁移和与DNA的加合。每一个步骤均对其最终的抗癌起着重要的作用。具体分述如下: (1).跨膜运转 铂类抗癌药物进入体内后，首先碰到细胞膜的障碍，细胞膜具有脂质双层结构，而药物的透过是采用浓差扩散的方式，扩散速度正比于浓度差，而扩散能力则由药物的化学特性决定。一般来说，脂溶性好、分子体积小的药物容易穿过细胞膜。铂族抗癌药物均含有氨或胺，整个分子为电中性，有一定的脂溶性，同时分子体积比有机药物小，所以容易跨膜运转进入细胞。 (2).水合解离 顺铂类抗癌药进入细胞后，由于细胞内的氯离子浓度低，它很快就发生水合解离，生成带正电荷的水合配离子，而四价铂离子在细胞内很不稳定，首先会被细胞内的抗氧化剂还原成二价，再发生类似水合解离反应。 (3).定向迁移 DNA是细胞的遗传物质，位于细胞核，带有负电荷。当顺铂水合解离形成 十Cis-Pt(NH)(HO)]后，受DNA的静电吸引力，定向快速往细胞核迁移到达靶32222 目标。 (4).与DNA的加合 cis-[Pt(NH)(HO)的化学性质活泼，水合分子很容易被其他配合体取代。当它322 到DNA链时，DNA链的碱基pT*(N7)取代配位水，形成Cis-[Pt(NH3)2]/DNA加合物。加合作用改变了DNA正常复制模板的功能，引起DNA复制障碍，从而抑制癌细胞的分裂。 32 第二节 钯类抗肿瘤配合物及其它金属配合物 一、单核钯配合物的抗肿瘤活性 1984年，Gill指出钯配合物具有较好的抗肿瘤活性，自此掀起了钯配合物在抗肿瘤活性方面的研究高潮。较早系统开展这方面工作是印度科技大学和孟买肿瘤研究所的科技人员。Puthraye等人研究了十六组Pd(bipy)(Aa) 混配配合物(Aa为氨基酸根)对L1210淋巴白血病细胞、S180肉瘤、P388淋细胞及艾氏腹水瘤细胞的抑制活性。抗肿瘤活性指数ID值(化合物杀死癌细胞50,时的浓度)与50 顺铂(Cis-DDP)比较，发现部分化合物的活性优于顺铂。表3.1列出了部分活性较好的钯混配配合物实验结果。 表3.1 Pd(bipy)(Aa)配合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度ID(μg/ml) 50 艾氏腹水 Complex L1210 P388 S180 瘤 [Pd(bipy)(gly)]Cl?2HO 1.0 >20.0 >100.0 17.0 2 [Pd(bipy)(ser)]Cl?HO 6.0 >20.0 >100.0 >20.0 2 [Pd(bipy)(lys)]Cl?HO 2.5 4.0 19.0 8.0 2 [Pd(bipy)(gln)]Cl?2HO >20.0 >20.0 >20.0 12.5 2 [Pd(bipy)(asp)] 12.0 10.0 12.5 4.5 [Pd(bipy)(glu)]Cl?2HO 7.0 2.5 11.0 >20.0 2 Cis-DDP 8.0 5.0 29.0 19.0 注:gly:甘氨酸根，Ser:丝氨酸根，lys:赖氨酸根，gln:谷氨酰胺，asp:天冬氨酸根，glu:谷氨酸根 表3.1中结果显示，部分钯配合物对某些肿瘤细胞的活性优于Cis-DDP。而对四种肿瘤细胞抑制活性普遍高于或接近Cis-DDP的有[Pd(bipy)(lys)]Cl?HO、2[Pd(bipy)(asp)]和[Pd(bipy)(glu)]Cl?2HO三个配合物。这一结果已初步显示这些配2 合物具有抗癌广谱性。 ,, Tusek-Bozic等研究了十余个2,取代喹啉和Cl或Br与Pd(II) 的混配配合物对L1210、KB、Molt4/C8及CEM/O等肿瘤细胞的抑制活性，大部分化合物也已显示出较好的活性。 我国学者对钯配合物的抗肿瘤活性研究起步相对较晚。毕琼斯等研究了 33 [Pd(phen)(Aa)]Cl型配合物对Raji、MCF-7细胞的毒性，对S180实体瘤株的抑制也进行了研究，得到较好的实验结果。他们进一步研究了钯,葡聚糖,二卤胺混配配合物对人大肠腺癌细胞的杀伤活性，结果显示，部分钯配合物与结构相似的铂配合物比，有明显优势，由IC值看出，Cis-DDP的活性远远低于钯配合物，50 这一结果对治疗肠癌颇具意义，因为现有药物对肠癌的治疗均不理想。Zhao,G..H等等人测定了Pd(L)Cl(L=2,9-二取代邻菲洛啉)型或[Pd(en)(R-py)Cl]NO(R-py:取23代吡啶)型配合物分别对L1210、Be17402或HL-60细胞的杀伤活性，结果发现，有些化合物的活性也好于Cis-DDP。他们就一些钯的双核配合物针对L1210、HCT8细胞的活性研究也得到了满意的结果。 二、双核钯配合物抗肿瘤活性 钯(II)和铂(II)在形成配合物时，均以4配位平面四边形结构为共同特征，化合物的性质也多有相似。因此对结构类似的Pd(II)、Pt(II)配合物的抗肿瘤活性比较，以期有目标、选择性的深入研究其中一种金属配合物具有重要意 ,2+2+义。Mital等人详细研究了M(L)(Aa)(M=Pd、Pt，L=bipy、phen，Aa氨基酸根)单核混配型配合物及双核混配配合物M(bipy)(L)(L=烷撑基双甘氨酸根)对老22 鼠肝脏细胞转录的抑制活性。表3.2和表3.3分别给出了实验结果。双核配合物的结构见图3.1。 表3.2 M(L)(Aa)型配合物对老鼠肝细胞转录的抑制活性 (mmol) ID50,Aa Pt(bipy)(Aa) Pd(bipy)(Aa) Pt(phen)(Aa) Pd(phen)(Aa) alanine , 0.14 2.85 0.33 leucine , , 4.10 0.30 methionine 1.75 0.38 , , phenylalanine 2.50 0.30 1.45 0.25 tryptophan , 0.27 2.40 , glycine 2.00 0.40 2.35 0.35 tyrosine 3.00 0.28 1.15 0.46 glutamine 3.75 0.10 , , glutamate 5.55 0.14 , , lysine , , , , histidine 5.05 , , , Chloride 0.94 0.08 1.02 0.82 注:配体从上至下分别为:丙氨酸根、亮氨酸根、甲硫氨酸根、苯丙氨酸根、色氨酸根、甘氨酸根、酪氨酸根、谷氨酸根、谷氨酰胺、赖氨酸根、组氨酸根、氯 34 离子 表3.2中数据表明，无论bipy还是phen体系，对应的Pd(II)配合物总体上说均比Pt(II)配合物有较高的活性。 表3.3的结果显示，双核配合物，随着脂肪链的增加，Pt(II)配合物的活性明显增强，辛烷(X=8)比丁烷链(X=4)活性高8.3倍，这可能在于长链会使两个端基更灵活地与细胞结合。尽管对于Pd(II)配合物，X,4、8时没有测出ID值，50但X=6时，其活性也确实好于相应Pt(II)配合物。 表3.3双核配合物对老鼠肝细胞转录的抑制活性ID(mmol) 50 -(CH2)M= Pt(II) M= Pd(II) X Butane(X=4) 1.00 , Hexane(X=6) 0.23 0.15 Octane(X=8) 0.12 , ONOMHNN 2)(CHx NNHMONO 图3-1 双核Pd(II)、Pt(II)配合物结构示意图 Quiroga等对[M(TSCN)(μ,Cl)]和[M(TSCN,NMe)]型配合物224 2+2+(M=Pd,Pt)对多种肿瘤细胞的活性进行了详细研究，表1.4列出了其中两组配合物的活性结果。配合物的结构简式见图3.2。 35 2+2+表3.4 Pd、Pt配合物对多种肿瘤细胞的半数杀伤浓度IC(μmol) 50Complex PAM-ras GLIOMA#112 HL-60 U-937 HeLa 3T3 PAM TSCN 65 75 57 76 78 97 88 2+Pd 47 67 22 38 58 0.05 72 2+Pt 21 59 30 45 45 0.1 124 Cis-DDP 157 120 7 22 7 35 164 H2N SClC M N N2 C H3)2 2+2+CH(CH图3-2 配合物[M(TSCN)(μ-Cl)]2(M=Pd、Pt)结构示意图 2+2+表3.4中结果显示，两种Pd,Pt配合物，对7种肿瘤细胞的杀伤活性普遍高于有机配体TSCN。对HL-60、L-937、3T3和PAM4种肿瘤细胞的活性顺序为2+2+2+Pd>Pt.对PAM,ras、GLIOMA#112、HeLa、3T3和PAM的活性，无论Pd 2+还是Pt配合物，均好于Cis-DDP。 三、钌配合物抗癌活性 大量研究表明，钌配合物具有低毒性、易吸收、排泄快等优点，是最有前途的抗癌药物之一。欧盟于1997年成立了钌抗癌药物研究和发展工作组，进一步加强了钌抗癌药物的研究，目前已有多个钌金属配合物进入临床实验阶段。其中，以DMSO为配体的钌(?)、钌(?)配合物作为抗肿瘤药物的研究取得了令人满意的效果，对其中几个化合物进行了相应得动物模型试验，结果发现[Trans-Ru (DMSO)(Im)(Cl)]?Im (结构图3-3)具有很好的抗癌活性，1999年在荷兰的癌4 症学会进入一期临床阶段，2002年进入二期临床阶段。 36 - HN N H+ClClNRu NHClClCHS3OCH 3 )]?Im 的结构 图3-3 [Trans-Ru (DMSO)(Im)(Cl4 四、其它金属配合物 cis-DDP作为临床药物的使用，使金属配合物的研究方兴未艾。科学家可以有目的的选择配位结构稳定的金属配合物作为研究对象。除上述提到的铂、钯、锡、锗等，对常见的，如铜、钴、镍、锌乃至钌、锗甚至稀土等配合物无所不入。这些化合物不仅结构多样，对多种肿瘤细胞表现出较强的抑制能力，并具有规律性，为开发研制新型无机药物分子提供了有价值的信息。 37 第三节 抗肿瘤配合物的体外筛选 抗肿瘤药物筛选是抗肿瘤药物研究工作中非常重要的一个环节, 建立合理的筛选体系, 提高筛选质量, 发现新的抗癌药物, 是90 年代肿瘤药理研究的一项重大课题。80 年代中期以前,普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病/ 淋巴瘤模型P388 和L1210为基础的,所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388 和L1210 作为第一轮初筛,能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉,无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷,1985 年之后以美国NCI 为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法,即放弃体内小鼠筛选,代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。 体外筛选方法主要有:MTT 比色分析法、SRB法、酸性磷酸酶法ATP生物发光法等方法，其中MTT法是目前各实验室最常用的体外抗肿瘤药物筛选法。根据活的增殖细胞能代谢MTT使MTT开环,形成一种蓝紫色的化合物甲臢沉积于细胞内或细胞周围,形的甲臢的量与细胞增殖程度成正比例关系,而建立的MTT比色分析法。该法具有不涉及使用放射性元素,所用试剂少,仪器简单,耗时少,出结果快,结果与同位素掺入法一致等优点,适用于大量抗癌药物的筛选,抗癌作用机理的探讨研究以及指导临床合理用药。 一、肿瘤细胞生物学特性 1、 形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 2、 生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌 38 细胞在低血清中(2,,5,)仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落(克隆)的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 3、永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡(Apoptosis)。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此,也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛;经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat,1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性(包括浸润性)是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。 4、浸润性 浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。 5、异质性 所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织;处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞(Stem Cells)、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖;把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。 6、细胞遗传 39 大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。 7、其它 肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于:?依赖性:肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性;?肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力;?并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少;?离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。 二、肿瘤细胞培养技术 2.1、细胞传代培养 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 2.1.1、传代前准备 (1).把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子从冰箱中取出使之温度升至室温。 (2).正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 (3).点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 (4).从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 2.1.2、胰蛋白酶消化 (1).加入消化液:倒出旧培养液，用PBS清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37?。 (2). 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间 40 不再连接成片，表明此时细胞消化适度。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。 (3).加入培养液终止消化。 2.1.3、吹打分散细胞 (1).吹打制悬:用移液器将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 (2).吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入50ml离心管中。 (3).平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心5分钟。 (4).弃上清液，加入新培养液:弃去上清液，加入定量培养液，用移液器轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 2.1.4、分装稀释细胞 将细胞悬液吸出按1:3,5分装至新培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖，做好标记。 2.1.5、继续培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。传2 代细胞约2小时后开始贴附在瓶壁上。 2.1.6、注意事项 (1).严格的无菌操作 (2).适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化 三、MTT法测细胞相对活力以及检测抗肿瘤药物的抑制细胞增殖活性 1983年，Mosmann等根据细胞能量代谢水平与DNA合成水平相平行的原理，建立了四甲基偶氮唑盐(MTT) 比色法。由于黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶和心肌黄酶)还原成蓝紫色的甲臢(Formazan)，死细胞则无这种能力，从而可用比色法推测细胞的存活和增殖程度。该方法操作简单、快速、敏感，明显优于过去常用的染料排斥法，和掺入同位素释放法测定结果一致。 3.1 具体操作方法 (1).制备浓度为30000-100000个细胞,mL的细胞悬液，加入96孔板中，每孔 41 100uL，置37?，5,C0培养箱中孵育24小时。 2 (2).将不同浓度的受试物加到培养的肿瘤细胞的96孔板中，继续培养24h。 (3).弃去培养液，每孔加入0.05,MTT应用液100ul，培养4小时。 (4).弃去培养液，每孔加入100uL DMSO，振荡5 min使甲暂颗粒溶解，测定细胞在490或570nm处的吸收度。 (5).数据处理 以未加药孔细胞的吸收度作为对照组吸收度，按下式计算: 抑制率,,(对照组吸收度-试验组吸收度),对照组吸收度×100% 用Billis法计算各受试物对各种肿瘤细胞生长的半数抑制浓度(IC)。 503.2注意事项 (1).MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 (2).加入培养板中的细胞数量与细胞的增殖速度和加药后培养时间有关，细胞增殖快、培养时间长，所加的细胞浓度小，反之亦然。 (3).向96孔板中加细胞时，每加几个孔要吹打细胞悬液，否则由于细胞的重力，后加的细胞数越来越多。 (4).MTT和DMSO具有较强的毒性，试验时应当注意防护。 (5).测定吸光度时490与570nm波长皆可，但常用570nm，在此波长下测得的吸光度值约比490nm波长时大一倍。 3.3、举例说明 以配合物[Pd(phen)(trp)]?5HO及[Pd(NO-phen)(trp)]?5HO对肺腺癌细胞的222 抑制活性测定，举例说明如下: 配合物使用前以20 %DMSO 生理盐水溶液配成所需浓度, 滤菌备用。将肺腺癌细胞 AGZY283a 经接代培养至所需数量后, 用0. 3 %胰蛋白酶消化 ,Hanks洗涤数次, 以10 %小牛血清1640 培养基将细胞配制成一定溶液 ,接种于96 孔培养板中, 每孔 200μL ,于37 ?, 5 %CO 环境中培养 24 h ,待细胞贴壁后 ,加2 入上述钯配合物继续培养 48 h , 于培养结束前 4 h ,每孔加入 20 mL 噻唑蓝 (5 mg/Ml) -磷酸缓冲溶液.培养结束后弃培养基 ,每孔加入 200μL 的 DMSO 溶解甲臢, Spectra ?型酶标仪于570 nm处测吸光度 ,计算抑瘤率。 抑瘤率 % = (对照组吸光度 - 给药组吸光度 ) /对照组吸光度 ×100 %. 根据抑瘤率 ,由线 42 性回归方法可计算半数杀伤浓度 IC 值.结果于表3.5中。 表3.5 配合物对AGZY-83a 细胞的抑瘤率及半数杀伤浓度IC 50 -1-1配合物 剂量/(μg?mL) 抑瘤率(%) IC/(μg?mL) 50 6.6 3.0 13.2 2.2 26.5 4.5 158.5 [Pd(phen)(trp)]?5HO 2 53.0 17.0 106.0 32.0 6.9 2.6 13.8 4.2 27.5 13.0 293.0 [Pd(NO-phen)(trp)]?5HO 22 55.0 16.4 110.0 19.3 43