TUNEL染色

相关疾病： l 脱水 产品名称： 罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒 英文名称： Tunel 产品货号： 11684817910 产品规格： 50T 试剂级别： 试剂级 产品产地： USA 产品商标： Roche In situ cell death detection kit-POD法 一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、 器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。 三、 实验步骤操作图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）或者加细胞通透液8min；5. PBS漂洗2次；6. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。11. PBS漂洗3次；12. 在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15. 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸（见备注4），干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛（见备注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的Triton X-100（见备注5）中处理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后续操作如同石蜡包埋切片的6—15 四、 注意事项1. 进行PBS 清洗时，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 用甲基绿（Methyl Green）染液（3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色后，请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净（100%乙醇）、脱水（二甲苯）透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时，甲基绿比较容易脱色，注意快速进行脱水操作。7. 荧光素标记的dUTP液含甲次*酸盐和二氯钴等致癌物，可通过吸入、口服等途径进入机体，注意防护。8. 试剂保存；未打开的试剂盒贮存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解冻，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内稳定，避免再次冻存；TUNEL反应液临用前配好后，放至冰上直至使用。9. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DN**断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。 可以选择使用Biotium公司的Tunel试剂盒，是荧光法的 效果非常的好，价格也有优势，如果有需要可以联系《上海开放生物》-Biotium中国总代理，另外还有生物素标记的dUTP试剂（包括不同连接臂长度的产品），可以为您的实验提供更多的选择性，希望可以帮到您！ A、B二液混合，30μl/每片 37℃ 1h PBS洗 3×3min Streptavidin-HRP 1:200 37℃ 30min PBS洗 3×3min 0.04% DAB+0.03%H2O2显色10min，水洗 苏木素衬染1min， 水洗蓝化 吹干后常规树脂封片 观察：凋亡指数（apoptosis inde×，AI）在普通光镜下连续观察10个高倍视野计数阳性细胞数，换祘为平均每平方毫米的凋亡细胞数，即为AI。 其他 IRAM: 我在做Tunel检测细胞凋亡，用的是Roche公司的试剂盒，步骤如下：细胞固定（4%多聚甲醛室温40分钟后70%乙醇-20度1小时）--3%H2O2in甲醇室温10分钟--0.1%TritonX-100in0.1%枸橼酸钠4度冰箱冰上通透3分半钟--加入TUNEl反应混合物，37度湿盒90分钟--加入POD，37度湿盒40分钟--加入DAB100微升，室温10分钟--苏木素2分钟。其间每步均用PBS洗涤3次，共5分钟。 我做了两次，但效果均步理想，好象没有看到有细胞核被染成黄色的凋亡细胞（我的细胞应该是有凋亡的），因为试剂有限未做阳性对照，阴性对照结果与实验组无明显差距，实在不知道是怎么回事。是我的试剂没有配对还是染色出了问题？ Nevin: 因为我也在用tunel检测细胞的淍亡，看了你的步骤后，提几点意见： 1、“3%H2O2in甲醇室温10分钟”的方法好像有点问题，我认为H2O2的浓度偏高，有两种选择：A，0.3%H2O2in甲醇；或B，3%H2O2。请注意浓度的变化。因为H2O2会减弱TdT的活性，可致假阴性。 2、加入TUNEl反应液，要新鲜配制，后放置冰浴中备用。这也是tunel成功的关键。 3、可以用蛋白酶K消化试试。 totoo: 我的实验是做兔角膜的切片的TUNEL的检测，用的是promega的荧光的试剂盒用FITC标记dUTP反应。蛋白酶k消化的浓度20ug/ml .10ug/ml.5ug/ml.37度30分钟。我的正常的角膜应该有阳性的结果，但是没有阳性？ midas: 对角膜进行的什么处理？可以先用您盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，如果可以染出来则可以证明您的盒子应该是没有什么问题的。 totoo: 我已经用盒子做一张已有明确凋亡细胞的阳性对照，阳性对照出结果，而我做的角膜片子而不出结果 pljgirl：请教各位大侠：有谁做过细胞凋亡的Tunel染色的吗？我用的是博士得得MK1020试剂盒1080元20个反应，可是他们得石蜡阳性片我染的很好，就是细胞片不怎么着色？ 我做Tunel时，加TDT标记液是37度2小时，之前加蛋白酶K消化30秒，没加Trtrion，因为试剂盒没要求，博士得的试剂盒说细胞涂片连蛋白酶K消化都不用，这些操作步骤合理吗？ newfish：我用的是中山的 蛋白酶K不是石蜡片采用么？细胞不用吧！做这个实验有几个关键的地方 ，不能干片 固定我们一般用4％多聚甲醛30分钟。染色时不要只是看试剂盒怎么说，还要一张一张染，在镜下观察看到染上了再终止。另外你可以用苏木素复染！！ DONGHAIJU：我现在正在做细胞凋亡的TUNEL检测，用的是Boehringer mannheim 公司的试剂盒，结果还不错，3600元50次反应，你的实验步骤是如何进行的？可否写下来讨论一下原因？刚开始我的实验也是没有结果，后来改变的实验步骤，结果就出来了，效果也不错。 我的实验步骤大概如下： 1、石蜡切片脱蜡至水， 2、0.3%H2O2的甲醇液室温作用5分钟，0.01mol/lPBS清洗两次，每次5分钟 3、20ug/ml蛋白酶K处理，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗， 4、加入TUNEL反应混合液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育1小时，PBS清洗， 5、3%BSA室温作用20min,PBS清洗 6、POD转换液50ul,盖上蜡膜，湿盒内37℃孵育30min，PBS清洗 7、DAB显色5~10min，自来水冲洗， 8、苏木素复染，盐酸酒精分化20s，自来水冲洗20min， 9、梯度脱水50%，70%，80%，90%，100%（1），100%（2），2min/次 二甲苯透明两次，10min/次，中性树胶封固，镜下观察。 大灵通： 我想做细胞爬片，然后加不同浓度促进凋亡的药物，然后做 TUNEL检测凋亡情况。问题有二： 1、随药物浓度升高，凋亡比例越来越高（我做流式得到的结论），可是很多调亡细胞都漂了，那会不会影响TUNEL结果？不知道我说明白没有？就是说虽然调亡细胞增多，可是漂的越来越多，玻片从培养液里拿出来细胞都留在培养液里了！可是文献上也都是这么做的呀。他们的细胞难道凋亡了也都留在片子上的么？ 2、在用4%多聚甲醛固定细胞时，4%多聚甲醛是4度的还是常温的？我用的是博士德的试剂盒，没说要4度，文献上有的写用，有的没提，我到底用不用呢？ zhaoqingshan：其实，确实是这样的，凋亡的细胞在开始走向凋亡的通路的时候，也许在分岔口就已经脱离贴壁了。有两点建议： 1、据说国产的TUNEL试剂盒质量不太好，我以前用的是Roche的； 2、4%多聚甲醛用常温固定15-20分钟即可； 3、显然，凋亡的细胞大多数已经脱离玻璃片了，所以应该把漂浮起来的细胞收集，然后甩片粘在玻璃片上，才能充分说明问题。 4、Tunel最后还得采用图像分析的计算结果，比较主观，只能算是半定量。你也可以用Tunel试剂上流式啊！ 大灵通：TUNEL最后是要做记数的，如果随药物浓度升高细胞凋亡增多，但却都漂了。举个例子，比如在A浓度时细胞实际凋亡40%，B浓度时细胞实际凋亡80%，但是因为很多凋亡细胞漂起来了的，很可能最后发现B浓度的片子反而凋亡数少，因为细胞都跑了。甚至B浓度时片子上都没有什么细胞了呀！如果要收集漂的细胞，那以什么比例往片子上涂？因为这涉及最后凋亡的比例呀。而且文献上对于细胞爬片没有这么做的，都是捞出片子就做固定，甚至还有用PBS洗5分钟再固定的，难道他们就没有我的问题？ zhaoqingshan：不做爬片不行吗？做流式啊！虽然，我也接触图像处理和分析不少时间，个人认为还是比较主观的。做几个爬片当样子，出几张漂亮点的图就行了。 wangzhang：能否摸索一下固定的时机呀，也就是说，细胞凋亡是有一个过程的，可不可以，分不同的时段固定，比较一下，在什么时候固定的细胞脱落的又少，还能看出不同呢。一定要用TUNEL看爬片吗？我曾将药物处理过的细胞离心后，悬于Hochest33258,如果药物的凋亡作用明显的话，也能很好的看出来。 大灵通：流式我已经做完啦，是用PI染色的。共5个药物浓度组：0，5，10，20，40，都是作用24小时。我发现随药物浓度升高，凋亡比例不断增加。 除了流式，TUNEL也是我实验的一部分。我就是想用细胞爬片做TUNEL,也是5个药物浓度组：0，5，10，20，40，也是作用24小时，观察凋亡比例。在做流式的时候我就发现：随浓度升高，漂的细胞不断增加，凋亡比例也不断增加。因为做流式是不怕细胞漂的（最后收集瓶内所有细胞上流式细胞仪），可TUNEL就不一样啦！ 你看我这样行不，药物作用到时间后，轻轻从孔里取出玻片（我用的是12孔板内放小玻片的方法），尽量不晃动，使漂的细胞也被带上来一部分，然后立即固定。 每个浓度都这样操作，虽然不太正规，但象青衫说的那样，会出几个好片子，凋亡比例我心里有数哇！要不还有啥办法呀？ zhaoqingshan：那样是不行的，因为不洗掉血清的话，固定的时候会很难看的，而且血清中的蛋白会黏附在细胞上被固定了。 zhizuchangle：也即将做TUNEL了，我可能也会遇到类似大灵通的问题，我打算用96孔板做TUNEL,这样可以节省试剂，象大灵通所说的，冲洗时会把凋亡的细胞一起洗掉，确实很让人头疼，这个问题应该如何解决啊， victoh：（TO 大灵通1、）实际上TUNEL更大的意义在于检测体内凋亡，若做体外定量研究贴壁生长的细胞时，应该将悬浮的细胞收集起来，不过这样统计起来较为麻烦，当然可以分别计数贴壁/悬浮的细胞数量，培养细胞做TUNEL主要用于定性的研究。 继续阅读