蛋白酶体抑制剂在ARPE19细胞中抗炎、抗氧化损伤机制(可编辑)

蛋白酶体抑制剂在ARPE19细胞中抗炎、抗氧化损伤机制(可编辑) 蛋白酶体抑制剂在ARPE19细胞中抗炎、抗氧化损伤机 制 答辩委员会主席: 量萄垂垫煎哇丛太堂 答辩委员会成员 噬龇丝垫暹纠匹膨魔 .. 答辩日期:温州医学院硕士学位论文 目 录 中文摘要 英文摘要 前 言 材料与方法结 果 分析与讨论,、 结 参考文献 附 录 致 谢 综 述 参考文献 独创性声明温州医学院硕士学位论文 蛋白酶体抑制剂在.细胞中抗炎、抗氧化 损伤机制的研究 摘要 目的 年龄相关性黄斑变性. ,中慢性炎症、 氧化性刺激对细胞、视锥、视杆细胞的死亡起重要的诱导作用。有研究表 明,在小鼠新皮质神经元中,低浓度的蛋白酶体抑制剂能升高蛋白酶体活性 从而 减少了神经退行性疾病中细胞的死亡。本课题研究可逆性蛋白酶体抑制剂 ?和不可逆性蛋白酶体抑制剂 .在一细胞中的抗炎、抗氧化损伤作用, 并探讨它们的作用机制。 方法 、细胞毒性实验检测蛋白酶体抑制剂的抗氧化损伤作用 一细胞先用不同浓度的一或预处理,再用氧化性刺激物 一/处理,加检测吸光度。 、蛋白酶体活性检测实验 .细胞用不同浓度的一或分别处理,后用非变性细胞裂解 液裂解细胞,收集蛋白。在 , 下检测荧光值,用荧光值表示 蛋白酶体的活性。 、蛋白酶体抑制剂激活转录因子细胞毒性实验 一细胞先用一和不同浓度的/抑制剂 /预处理,再用/处理,加检测吸光度。 双荧光素酶报告基因实验 一细胞中共同转染质粒.一和?,后用不同浓 度.和分别处理细胞,检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性, ,的活 用两者比值来反映启动子反应元件 性。 电泳迁移率实验 一处理一细胞,用非变性细胞裂解液裂解细胞,提取核蛋白 做检测。并用和抗体来干预核蛋白和探针的结合,通过 条带来鉴定被激活的亚类。温州医学院硕士学位论文 结果 、.细胞中,一和均可以减少氧化性刺激一/ 引起的细胞毒性,起到保护细胞的作用。其中一的保护作用可以被 拮抗剂部分阻断,而的保护作用既不能被也不能被拮 抗剂所阻断。 、低浓度的蛋白酶体抑制剂一和在.细胞中的抗炎、抗氧化作 用机制不同于神经元。它们在神经元中抗炎、抗氧化是通过升高蛋白酶体的 活性, 而在一细胞中,有保护作用浓度的.和,均抑制了蛋白酶体活性。 、在一细胞中,一的抗炎、抗氧化作用部分是通过激活抗炎转录 因子,而的抗炎、抗氧化作用机制目前还不清楚。 结论 在一细胞中,.和均可以对抗氧化损伤,起到保护细 胞的作用。.的抗炎、抗氧化作用部分是通过激活抗炎转录因子, 而的抗炎、抗氧化作用机制则不同。本课题从新的角度研究中 细胞的死亡机制,该课题的完成有助于我们进一步了解,从而为的 预防和治疗提供新的靶点和理论依据。 关键词 一细胞,一,,途径温州医学院硕士学位论文【: ? ...一 . : . ? ??????一 一 . ? . ?.? . 一 : 一 . ; .? , 一 一. ? . 一. :温州医学院硕士学位论文 ?一 一 , ?. : . ,. ,。. 温州医学院硕士学位论文 刚吾 年龄相关性黄斑变性是目前西方国家岁以上人群低视力和致盲的 重要原因】。随年龄的增长,发病率逐渐上升,主要由早期视网膜色素上 皮砌细胞的退行性改变和晚期视锥、视杆细胞的死亡而引起的不可逆性中 心视力的下降或丧失。分为萎缩型和渗出型两类。萎缩型又称为“干 性”,主要为脉络膜毛细血管萎缩、玻璃膜增厚和萎缩等引起的黄斑区萎 缩变性。渗出型又称为“湿性”,主要为玻璃膜破坏、脉络膜血管侵入视网 膜下构成的新生血管、黄斑区视网膜色素上皮下或神经上皮下浆液性或出血 性盘 状脱离,最终发展成为机化瘢痕】。近年来湿性的研究、治疗取得了较大 的进展,但是干性的研究进展不大,其可能的机制包括补体、炎症介导 细胞的氧化性损伤,最终导致细胞凋亡、死亡等。有研究表明, 细胞内的炎症及氧化性刺激会抑制胞浆内蛋白酶体的活性【】,蛋 白酶体活性如果长时间被抑制将导致细胞死亡】;低浓度的蛋白酶体抑制剂能升 高蛋白酶体活性从而减少了神经退行性疾病中细胞的死亡】。因而,我们推测低 浓度蛋白酶体抑制剂在细胞中抗炎、抗氧化作用可能也是通过提高蛋白酶 体活性实现的。 泛素一蛋白酶体系统 ,是真核生物中重要 的蛋白质降解系统】,它的功能包括降解突变的、非正常折叠的、损坏的蛋白质 】,以及调控细胞周期、细胞凋亡等等。最普遍的蛋白酶体是蛋白酶体, 它包含一个核心颗粒和两个/调节颗粒【 。蛋白质的降解在核心 颗粒中进行,需要降解的蛋白质被泛素标记后,由蛋白酶体识别并将其完全降解 为长度一定的肽段,而泛素再循环利用。这个过程是一个三酶级联反应,泛素激 活酶水解并将泛素分子腺苷酸化,此时泛素分子转移到的活性中 心上,接着腺苷酸化的泛素分子转移到泛素结合酶上,最后泛素连接酶 识别特定的靶蛋白,并催化泛素分子从转移到靶蛋白上,靶蛋白被蛋 白酶体降解,泛素分子再循环利用【。蛋白酶体抑制剂是一类能与蛋白酶 体的酶解活性位点结合,阻断其对靶蛋白降解的药物。已有的研究表明,蛋白酶 体抑制剂具有抗肿瘤作用,通过降解促生长细胞周期蛋白来诱导肿瘤细胞的凋 亡。硼替佐米已被批准在临床上用于治疗多发性骨髓瘤【引。近年 研究发现,蛋白酶体功能的抑制与神经细胞的死亡紧密相关,如神经退行性疾病 阿尔茨海默病、帕金森病中蛋白酶体活性下降。等在患 者大脑的尸检中发现,海马回、海马回周边脑回,上、中颞叶脑回,项叶下区等 部位,蛋白酶体活性下降,而这些蛋白酶体活性下降区域与晚期中神经元的温州医学院硕士学位论文 死亡区域一致】。的一个重要病理表现是黑质致密部神经元的死亡。 等在散发型中发现,黑质致密部蛋白酶体亚基中的亚基以及 调控亚基中的表达均减少,这导致了蛋白酶体活性的下斛。这些研 究表明,在、中蛋白酶体活性的下降与神经元的死亡紧密相关。研究还 表明,随着年龄的增大,大鼠视网膜中蛋白酶体活性逐步下降】。因此,我们 猜测,神经退行性疾病的发生发展可能与蛋白酶体的活性降低有关。 过氧化物酶体增殖物激活受体是一类配体激活的核转录因子的超家族成员【 。根据基因编码的不同, 可分为?、/和,三种亚型。主要分布于肝脏、心脏、肾脏、肌肉, 调节细胞脂类代谢;促进糖异生及酮体合成:参与脂蛋白装配等【 。常用的调 脂药物非诺贝特为激动剂。参与胚胎形成、移植和骨形成【。 主要在脂肪组织中表达,在脂肪细胞分化和脂类代谢调节方面起着重要作 用【。胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物,如罗格列酮和毗格列酮,可选择 性的结合并激活【。近年的研究发现,对细胞的促炎反应具有明显 的抑制作用,是调控炎症反应的关键点。如激动剂能抑制巨噬细胞中多 种促炎基因的表达,减少促炎细胞因子【、.、的产生【】:天 然配体? ?能减轻诱导的胸膜炎的 急性炎症反应【。有天然配体和合成的配体,配体与结合, 使发生磷酸化而活化,活化的与视黄醛衍生物受体 结合,形成:异二聚体,随后异二聚体结合于上 的反应原件 上,启动下游靶基因的转录。 位于目的基因调控区内,是一个由个或个核苷酸隔开的的正向重复序列,即 ?? 。有研究表明,蛋白酶抑制剂在小胶质细胞中 可以激活转录因子引。因而,我们推测在.细胞中,蛋白酶体抑 制剂的抗炎、抗氧化作用有可能也是通过激活转录因子而介导的。 研究表明,低浓度蛋白酶体抑制剂可以升高神经元中蛋白酶体的活性,从 而减少炎症及氧化性刺激对神经元的损害】。本课题研究可逆性蛋白酶体抑 制剂 一和不可逆性蛋白酶体抑制剂在.细胞中的抗炎、抗氧化损伤 作用,并探讨它们的作用机制。该课题的完成可以帮助我们进一步了解中 细胞的死亡机制,从而为的预防和治疗提供新的靶点和理论依据。 温州医学院硕士学位论文 材料和方法 .细胞培养: .材料: .细胞系来源:温州医学院侯陵教授惠赠。 .主要仪器设备与耗材: 超净工作台瑚,;自动调节培养箱,; 倒置显微镜,;.。深低温冰箱,;? 台式低速离心机上海医疗器械有限公司;型电热恒温水槽上海 森信实验仪器有限公司;动移液器 、 、 、 、 实验耗材: 培养瓶,孑、孔培养板, 、 吸管, 离心管, 冻存管等 , .主要试剂: /,、,、,、.% ,; .细胞培养方法: ..细胞培养方法及条件: 培养基:/% 培养条件:?,% ..细胞传代步骤以 培养瓶为例: 用 吸管吸除原培养瓶中培养液; 用 吸管吸取 加入培养瓶中,轻晃几次吸出,用于清洗残 留血清; 吸管吸取 用 ?温热的.%,加入培养瓶中,放入。培 养箱中约分钟,使贴皿细胞漂浮; 镜下观察,见细胞基本浮起,用 吸管吸取 含%的 /培养液中和,吸出瓶中细胞悬液至 离心管, 离。 离心后将管中上清液吸走; 吸取 培养液,其中 力至培养瓶, 至离心管; 用巴氏管适度吹打细胞悬液?次,形成单细胞悬液,吸取所需细胞量 加入培养瓶中,轻晃培养瓶使细胞均匀分布; 将培养瓶置于。培养箱中培养。 ..细胞计数步骤: 细胞计数板、配套盖玻片擦拭干净备用;温州医学院硕士学位论文 吸取山单细胞悬液沿计数板一侧滴入计数板,使液体均匀平铺,无气 泡: 在显微镜下可以观察到计数板分大格如下图、、、,每一大 格分格,将每一大格分别计数原则:左算则右不算,上算则下不 算,取大格的平均数,则说明细胞悬液中细胞数量为/个。 注意:如果细胞计数板格中任意格细胞计数少于个/格,则需全部数 出个方格中所有 数。 ..冷冻保存步骤: 配置细胞冻存液:/%培养液%二甲基亚 砜,?预冷; 细胞消化后吸至 离心管中, ,弃上清; 离心 根据细胞计数,离心管中加入适量已预冷的细胞冻存液,一般 冻存 液保存×个细胞; 用巴氏管轻轻吹打?次,装入已经标记的 /管; 冻存管 迅速用纱布将冻存管包卷,放入已标记的 冻存离心管中 内 完成; 放入.?深低温冰箱天以上,取出并立即转至液氮中长期贮存。 ..细胞复苏步骤: 从本中找到需要复苏的细胞的编号; 从液氮罐相应位置取出冻存管; 立即丢入?水浴。?为临界温度,细胞在此温度易死亡,因 此从液氮罐中取出细胞后应立即放入?水浴中,使其在室温中停留 时间尽可能短; 准备培养瓶,并做好标记包括:细胞株名称、日期、传代数等; 融解后立即取出水浴中的冻存管冻存液中对细胞具有毒性,可 杀死细胞; 用 吸管立即吸出并加至已装有培养液的离心管中, ; 离心 弃上清,加培养液打散细胞,吸出加入至已装培养液的培养瓶中,轻轻温州医 学院硕士学位论文 摇晃使细胞均匀分布,立即放入培养箱中培养; 次日,换液。 .细胞毒性实验: .主要仪器: /酶标仪 .主要试剂: . 、 /,、,、,、 、?、 、、、,、 、 . 具体步骤: 接种细胞:用.%消化一细胞,用含%的/培 养液配成单细胞悬液,以每孔,个细胞接种于::板中,每孔体积 ,每组个复孔; 培养细胞:将孔板移入培养箱中,?、%条件下培养; 时后,吸除培养液,每孔加清洗残留血清,加不同浓度的试剂 处理细胞无血清培养液: ? ; 钔呈色:按::的比例配显色液,每孔加入显色液,。培 养箱中放置小时; 吸光度测定:选择波长,在酶标仪上测定各孔吸光度,记录结 果。 .蛋白酶体活性实验 .主要仪器: ?超声波细胞粉碎仪宁波新华生物科技股份有限公司;酶标仪 / .主要试剂: 非变性细胞裂解液 成分名称 含量?. 温州医学院硕士学位论文 %. . 灭菌水 荧光反应液 成分名称 含量 . ? 山 .? . 灭菌水 .蛋白酶体活性实验具体方法: ..细胞蛋白质提取: 将细胞接种于孔板中,待细胞密度为~%时提取细胞蛋白质; 吸除原培养液并用清洗细胞次; 管置冰上预 板的每个孔中均匀山上述细胞裂解液,取. 冷备用; 用细胞刮刮出细胞,并吸至管中,用超声波细胞粉碎仪将收集液中 的细胞基因组破碎:超声时间为,间隔时间为,功率为,超 声次左右,至溶液清澈无粘稠; 、离心分钟,吸取上清至新管中,进行蛋白质浓度测 定。 ..蛋白质浓度测定法: 用/蛋白品和溶液配制成个不同浓度梯度的蛋白标准 液; 蛋白标准液分别加入孔板中,以为空白对照,每孔为.; 样品组各设两个复孔,每个蛋白质样品用稀释倍,每孔总体积为 出出斗样品; 中的液与液以:的比例混合,轻轻混匀; 混合液, 恒温箱中孵育分钟; 各孔中分别加入 酶标仪上,以的吸收波长测量各孑吸光度,并根据标准曲线 计算出蛋白质浓度。 ..蛋白酶体活性测定 根据蛋白质样品浓度计算出不同药物组所需的蛋白量,与裂解液配制成 待测液。分另入板中,每,每组个复孔。去离子水做 温州医学院硕士学位论文 空白对照; 力?荧光底物溶液,每孔: 锡箔纸包裹孔板,。恒温箱中孵育小时; 每孔加入的?去离子水终止反应; , 在 处测定荧光强度,据数值比较蛋白酶体活性。 . 方法: .主要仪器: .超声波细胞粉碎仪宁波新华生物科技股份有限公司;酶标仪 / ;小型冷冻台式高速离心 机;型生化培养箱上海跃进医疗器械厂; .型水平摇床北京市六一仪器厂,沃德生物医学仪器公司;电泳 槽.,;电转槽?,:曝光板 , .主要试剂: 蛋白裂解液: 成分名称 含量山 .“ . . ’ . %: 成分名称 含量 总体积 加去离子水定容至 %: 成分名称 含量 . 总体积 加去离子水. ?.、. .碧云天 碧云天 ×? %分离胶:温州医学院硕士学位论文 成分名称 含量 .% . .. % % 山总体积 %浓缩胶: 成分名称 含量 . . % . . ? . % “ % “ 山 总体积? ,; ; 电极缓冲液: 成分名称 含量 甘氨酸 . 总体积 加去离子水定容至 电转液: 含量 成分名称 甘氨酸 . ? 总体积 加水甲醇 %封闭液: 温州医学院硕士学位论文 成分名称 含量. . 脱脂奶粉 总体积 洗膜液:含.%.的溶液; 显影液、定影液碧云天:按产品说明方法配制; .氢氧化钠:用于清除结合在膜上的抗体; 蛋白浓度测定试剂盒碧云天。 .细胞蛋白质提取及浓度测定: ..细胞蛋白质提取:同蛋白酶体活性实验中蛋白质浓度测定注:所用细 胞裂解液不同 ..蛋白质浓度测定:同蛋白酶体活性实验中蛋白质浓度测定 . 具体方法: 制备电泳凝胶: ?两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧,注水检漏。配%分离胶,加入 混匀,立即灌胶。灌胶时,用枪吸取凝胶沿玻板缓慢灌入,加至适 当高度。然后在胶上加一层去离子水封闭,液封后的凝胶比较平整; ?将分离胶放入。培养箱中约,胶凝固后,倒去上层水并用纸巾 将残留的水吸干; ?配%的浓缩胶,加入混匀,立即灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶 后将梳子插入; ; ?放入?培养箱凝固约 ?将凝固好的凝胶放入电泳槽中,小玻璃板面朝内,大玻璃板面朝外,加 入电泳液,液面漫过内侧的小玻璃板,下方漫过玻璃板下方。两手分别 捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔出。若只有一块电泳胶,则电泳槽 另一边垫一块厚玻璃挡板。 上样: ?向加样孔中加入蛋白质样品般~“即可,样品一般为 ,在电泳槽中进行电泳; ?上样前,将蛋白样品置于沸水中煮沸 ,使蛋白变性; ?用加样枪吸取样品尽量不要吸进气泡,将加样枪头插至加样孔中缓 慢加入样品。 电泳:电泳总时间一般为~ ,浓缩胶电压为 ,电泳至分离胶后温州医学院硕 士学位论文 可将电压调为 。溴酚蓝至玻璃板底部即可终止电泳。 转膜: ?电泳结束后将凝胶割至适当大小,放入转膜缓冲液中平衡 ; ?膜处理:预先裁好比凝胶稍大的滤纸和膜,放入转膜液中平衡 ?转膜:按以下顺序装配转膜装置:负极电转盒?海绵?层滤纸? 凝胶一膜一层滤纸一海绵一电转盒正极,将转膜装置放 入电转槽中注意正负极对准,将电转槽置于冰水混合物中, 电转。 转膜完毕后,取出膜在丽春红中染膜,可以看到蛋白条带出现,根据蛋 白的位置将目的和内参条带剪下,用漂洗,除去丽春红, 后进行免疫反应。 免疫反应: ; ?封闭液封闭%的脱脂奶粉,摇床中平稳摇动,室温约 ?取出膜,加入用%脱脂奶粉进行稀释的一抗,液体必须覆盖整张 左右; 膜,?放置 ?将膜取出,用洗膜,次: : ?加入用%脱脂奶粉进行稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗,室温 ?将膜取出,用洗膜,×次。 发光、显影和定影: ?暗室中,将显影液、定影液分别倒入塑料盘中,将发光液中的、液 在管中等体积混合; ?将膜蛋白面朝上放入.光片夹中,加入适量混合液,均匀覆盖 整片膜,待荧光条带可见时覆上塑料薄膜; ?在红灯下取出.光片,用剪刀裁成适当大小比膜稍大,将光片放 在膜上,不能移动,关上.光片夹,并开始计时。根据信号的强弱适当 调整曝光时间,一般为秒到分钟,选择不同曝光时间多次压片, 以达到最佳的效果; ?压片完成后,取出一光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后, 即刻终止显影: ?显影结束后,马上把一光片经水中轻漂后放入定影液中,定影时间一般 为~,以胶片透明为止; ?用自来水冲去残留的定影液,室温晾干。 用.氢氧化钠清洗膜,洗脱结合的抗体,重新进行封闭后再进 温州医学院硕士学位论文 行其他抗体的免疫反应。 .双荧光素酶报告基因实验 .主要仪器: / 超净工作台玎 ;酶标仪 .主要试剂: ., 一 ;?;: :? .质粒扩增及提取步骤如下: .储存的感受态菌种一支放到冰上融化,刚融未融时,加入 山一质粒,冰浴分钟; 水浴.分钟,室温分钟,加上无选择性的培养基, 水浴分钟; 取布于氨苄抗性的固体平皿上,过夜; 从氨苄抗性的固体平皿挑取单克隆菌落,置入己装有左右含氨 苄青霉素的培养液的细菌培养管中,于。摇床中以/ 的速度震荡培养过夜.小时; 取.菌液放入管中,离,凸,弃上清; 加入斗缓冲液,颠倒混匀使细菌完全悬浮;加入缓冲液, 颠倒.次混匀;加入?缓冲液,颠倒?次混匀,离心 ; 上清转移至带有滤膜柱子的中,离,?,弃下液; 加入缓冲液,离,?.,弃下液: 力.缓冲液,离一?,弃下液,再离?; 将柱子转移至新的. 管中,加入缓冲液,静置, 离心; 下液即是质粒溶液,鉴定并测质粒浓度。 按试剂盒说明书进行大提。 .质粒转染具体方法: 将对数生长期的一细胞接种于孔培养板,根据 转染试剂说明书,配制转染液:用无血清、无双抗的? 液稀释适量、?、?即液和温州医学院硕士学位论文 即液; 液与液室温放置 后,将两者混合均匀,室温再置 后, 加至孔培养板中含完全培养基 转染细胞。各样本设个 复孔; 转染完成后,放置于。、%培养箱孵育培养 后进行荧光 检测。 .荧光检测 ..用 试剂盒进行双荧光素酶报告 基因检测。配置试剂盒中以下试剂备用: 将 虢用稀释至×备用。 粉剂用 溶解混匀备用。】 稀释至备用。 用 ..实验步骤: 除去原有细胞培养基; 用清洗细胞次,弃清洗液; 将 ×加入到孔板的培养孔中: 水平摇床上轻晃培养板分钟,将裂解液转移到管中; 先在白色不透明孔检测板的孔中加入样本的裂解液; 设置仪器参数:选择化学发光、顶读 、波长为 、秒延迟和.秒读数; 取 到检测孔中,混合后检测萤火虫荧光素酶的活性,记数 值; 向检测孔中加入 ?,混合后检测海肾荧光素酶 的活性,记数值;同一样本测个复孔,其余的样本同样检测记数 值。 /,同一样本得到个样本取平均数,与其余样本比较,采 用.统计分析,取.。 .电泳迁移率实验 .主要仪器: / ;一型水平 酶标仪 摇床北京市六一仪器厂,沃德生物医学仪器公司;小型冷冻台式高 速离心机 ;电泳槽?,;电转槽?, ;曝光板 ,:..型生化培养箱上 温州医学院硕士学位论文 海跃进医疗器械厂 .主要试剂 :,. , , , 、 ,. ,.; . :,. ,. , , . 订,. × .: , : ,. ,.,. . .; × , 】: :: ?, , ,% 核蛋白的提取: 细胞种植在 的培养皿中,待细胞覆盖培养皿.%时,加预冷 的收集细胞,。,,离心; 弃上清,用预冷的洗涤细胞沉淀两次,然后在,,离心 ; 弃,用倍体积的重悬细胞,冰上孵育分钟,于?, ; ,离心 重新悬浮核蛋白, 弃,用再洗次后,用 混匀; 冰上孵育分钟,加. 冰上孵育分钟,,,,离心; 取上清液核蛋白,置新的管中,蛋白质定量后,立即冻存于一。 . 具体步骤: %非变性胶的配制: .:,% %甘油 温州医学院硕士学位论文 加入前先混匀,加入后立即混匀,并马上加入到制胶 的模具中。避免产生气泡,并加上梳齿同 。所有器具 均用双蒸水洗净,防止变性剂干扰: 预电泳:在正式电泳之前,首先让%的非变性胶在.缓冲液中 以 的稳压预电泳小时: 结合反应: 阴性对照 样品反应 ×%“/%. 竞争探针 / 室温反,立 生物素标记探针 冲 仃补足至微升 按上述反应体系加好样后,置于室温反应~置于。反应 。 上样和电泳:加入加样缓冲液×,以 电泳直至溴酚蓝至 /处。 转膜:步骤似 ,将带正电荷的尼龙膜用.预处理, 将电转槽置于冰水混合物中,,电转小时。 紫外交联:电转移完成后取出尼龙膜置干净滤纸上,让膜上的缓冲液大 致被吸干不能过于。将膜置紫外交联仪中在紫外波长处紫外交 联。 按照试剂盒说明书步骤进行检测生物素标记的探针。 抗体凝胶迁移实验的体系:加入抗体,冰上孵育分钟后,再加入 核蛋白,室温孵育分钟,电泳。 .还原型谷胱甘肽实验 .主要仪器: /酶标仪 .主要试剂:温州医学院硕士学位论文 : . 实验具体步骤: 标准曲线】 /皿 ./. 按上述表格绘带标准曲线. 细胞铺在的培养皿中,待细胞覆盖培养%时,用% 悬浮细胞,离心。 , 取,清液,加“ , ,温和漩涡混合, 漩涡混合,士避光孵育分钟,在 处测吸光度。 .数据分析方法:统计学处理采用.统计学软件,采用单因素方差分析 和独立样本一检验,检验显著水平.为差异具有显著性。温州医学院硕士学位 论文 结果 、.细胞中低浓度蛋白酶体抑制剂.、对抗氧化损伤 细胞毒性实验结果显示,在一细胞中,可逆性蛋白酶抑制剂. 和不可逆性蛋白酶抑制剂均可以减少一/引起的细胞毒性,起到 保护细胞的作用图。实验用不同浓度的.,,,,无 血清预处理一细胞小时,其中,, .能明显对抗 引起的细胞毒性, 作用最明显,几乎完全阻断 脚和 氧化性刺激;同样, 能明显对抗.和引起的细胞毒 , 性,作用最显著。上述浓度的一和分别单独处理一细胞, 与对照组相比,无显著性差异图未附,说明上述浓度的.和本身 无细胞毒性。温州医学院硕士学位论文 ? 一摹蠢蒜搴毋卜毳? 一 潦 谢协 ? 掌 蓄鞠 笺 卜? 置‘《搦》 幽 谢、 图:.细胞中蛋白酶体抑制剂一和对抗和引起的氧化损伤 细胞先用不同浓度的.,,,,/,,,,无 血清预处理小时,再用/处理小时,加检测吸光度。组吸 光度设为%,其它处理组以此类比。.表示各组与组比较,有显著性差异 温州医学院硕士学位论文 、一细胞中低浓度蛋白酶体抑制剂一、降低蛋白酶体活性 我们通过检测蛋白酶体的活性,判断具有抗氧化损伤作用浓度的蛋白酶体抑 制剂是否也是通过提升蛋白酶体活性发挥其抗炎、抗氧化作用。蛋白酶体的 活性 分为胰蛋白酶样活性? 、糜蛋白酶样活性. 、谷氨酰肽水解酶样活性 ,其中糜蛋白酶样活性特异性最强的,本实验用糜蛋白酶 一 样活性作为蛋白酶体活性指标。在反应体系中,蛋白酶体切割反应底物 , ..,释放,在 下检测荧光值,用荧光 值表示蛋白酶体的活性。实验结果显示,在.细胞中,不同浓度的一 和均不同程度降低蛋白酶体活性,并且它们对蛋白酶体活性的抑制作用随着 浓度的增加而增强,呈浓度依赖性图。温州医学院硕士学位论文 ? 的 ? 帕 一冰一兰量 稻仑艮一 瓣 瓣 ? 驰 琴一露奎答《霉 辱霪乱?执?獬 图:.细胞中蛋白酶体抑制剂.和降低蛋白酶体活性 不同浓度的一,,,,, /,,,,, 无血清分别处理一细胞小时,用非变性细胞裂解液裂解细胞,收集蛋白,在, 下测定荧光值,用荧光值表示蛋白酶体活性。组荧光值设为 %,其它处理组以此类比。?.表示各组与组比较,有显著性差异温州医学院硕 士学位论文 、一细胞中蛋白酶体抑制剂.激活转录因子 细胞毒性实验 分别使用、抑制剂、处理.细胞, 研究这些抑制剂是否可以逆转.和的抗氧化损伤作用。实验结果显示, . 在一细胞中,~州抑制剂显著逆转 对细胞的保护作用图;而抑制剂效果则不显著图 ,。在处理的细胞中,无论是还是,均不能显著逆 转对细胞的保护作用图。这说明 .对细胞的保护作 用可能是通过激活转录因子介导的,而 可能不是。为了排除 有可能因为细胞毒性而使 一的抗氧化作用发生 ~肚 、~ 逆转,我们分别使用“ 单独处理. 细胞,并未发现细胞毒性图。同样,为了排除了~ 有可能 因为升高蛋白酶体活性也起抗氧化作用,而使其逆转作用不明显,我们分别 使用 、州单独处理一细胞,检测蛋白酶体活性, 也并未发现蛋白酶体活性升高图。 温州医学院硕士学位论文 暂 暂 。 狮 ;懈 狮 蕈骑 ? 一毒一雾.”.芏 秘 ? 柚 “蚪,’ 约 旧蝴啡?嘲翌 一 ? ? ? 一 ? 韩,献.昏黧 一 ‘蝴 一 ‘ ‘崩. 蝣 曲 砷 砷 ? ? 舶 挑 ? ? 一暮?.【霉《?墓 一吝《霉鼍 ? 柏 弛 耸 档机伯 孵船四 聱槲盼强? ? 一 ?埘婚,?十 一 一 一一 一 ? ?洲帆 ? 螭燃 图:细胞中抑制剂逆转.对细胞的保护作用, 抑制剂无明显作用 细胞先用 .和不同浓度的,/,共同预处理 小时,再用./处理时,加检测吸光度。组吸光度设为%,其 它处理组以此类比。.表示各组与组比较,有显著性差异;料.表示., .,共同处理组与.,.处理组比较,有显著性差异 温州医学院硕士学位论文 婚 ? 越 糟 钾 ? 册 罅 ? ? 一一分‘?芏 一’‘一鞫毒《毋.暑 帖 坼 口 伸 ?倒卧 。 神 揪渊’ ~ ’删协 一 ’州 一 ?一? 一? ’瑚 一 “ ? 船 辨 簿 ? ? ? 甜 ? 髓 霉菩,? 一搴『》套基?卜互 婚 船 图:?细胞中,舢抑制剂均无明显逆转对细胞的保护作用 细胞先用曲噍和不同浓度的,/,共同预处理小时, 再用/处理小时,加检测吸光度。组吸光度设为%,其它 处理组以此类比。.表示各组与组比较,有显著性差异:‘.表示, 一,共同处理组与,处理组比较,有显著性差异 温州医学院硕士学位论文 ? 苎 岔 ? ? 舌 卜 芝 、佑 、~ 蔓: 单独处理.一细胞未发现细胞毒性分别用~ 、~脚单独处理细胞小时,加 检测吸光度。组吸光度设为%,其它处理组以此类比.表示各组与 组比较,有显著性差异 温州医学院硕士学位论文 ? ,、 零 、/ 釜 三 芸 磊 母 翌 一 一 一 一 一 吐 一 ? 一 旺 一 图:.细胞中“、 单独处理未发现蛋白酶体活性升高 按上图标示无血清分别处理.细胞小时,用非变性细胞裂解液裂解细胞, ,/下测定荧光值,用荧光值表示蛋白酶体活性。 收集蛋白,在 组荧光值设为%,其它处理组以此类比。.表示各组与组比较,有显著性 差异温州医学院硕士学位论文 双荧光素酶报告基因实验 用双荧光素酶报告基因的方法分析检测一和是否可以增加 的转录活性。在.细胞中共同转染质粒一和?, 小时后,用不同浓度的.和分别处理细胞小时,酶标仪上 检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性,用两者比值来反映启动子的 活性。活性代表了的转录活性。实验结果显示,能增加 的转录活性,并且其作用随着作用浓度的增加而增强,呈浓度依赖性;而则 无明显作用图。 菖 盘 考 兰 邑 务一?一锝?矾嚣???一再一朦 . 图:.增的转录活性,则无明显作用 .细胞中共同转染质粒和,、时后,用不同浓 检测萤火虫荧光素酶和海。肾荧光素酶 度的一和分别处理细胞时,酶标仪 的活性,用两者比值来反映启动子的活性。组荧光值设为,其它处理组以此 类比。.表示各组与仃组比较,有显著性差异。温州医学院硕士学位论文 电泳迁移率实验 用电泳迁移率实验检测核蛋白和生物素标记的探针的结合能力,从而 一 检测一 在一 细胞中是否激活抗炎转录因子。 分别 处理.细胞、、小时,用非变性细胞裂解液裂解细胞,提取核蛋白做 检测。实验结果显示,与无.处理的对照组相比, 一增 加了与的结合能力,并且随着作用时间的增加,条带渐渐增强, 小时最明显图。为了验证 一在.细胞中是通过激活 来对抗氧化损伤,我们用和抗体来干预核蛋白和探针的结 条带来鉴定被激活的亚类。实验结果显示,加入 合,通过 条带图。但是与不加抗 和抗体后,并不能检测到明显的 体组相比,条带明显减弱了,说明弹汰中部分与和抗体结合 了。 一 : :专 三: 《 :;:一??。” . . . 一瀚 渗 黎 ??纛警鬻黧 。?? 撩 囊赣 黪 ? ?专 图:.增加转录因子的激活 .分别处理.细胞、、、小时,用非变性细胞裂解液裂 解细胞,提取核蛋白做检测。探针为生物素标记的顷式元件,竞争探针为倍 无生物素标记的页式元件,作为阴性对照。 处理一细胞小 条带。图中箭头标明了和 时,提取核蛋白,检测和抗体的 自由探针条带的迁移位置。 温州医学院硕士学位论文 分析和讨论 .属于合成的肽醛类抑制剂,可逆性抑制蛋白酶体的活性,阻碍靶蛋 白的降解。结合后它能快速脱离受体,并迅速被细胞氧化为无活性的酸,最后 被 转运到细胞外。是链霉菌属的天然代谢物,是一种选择性的蛋白酶体抑制 剂,及其活性中间体的一内酯可选择性和不可逆性结合于蛋白酶体的亚单 位,从而抑制蛋白酶体的活性。 已有的研究表明,在一细胞中,蛋白酶体抑制剂.,,均能对 抗.多巴胺和过氧化氢引起的细胞毒性【 .在小鼠新皮质神经元中,低浓度的 蛋 白酶体抑制剂,,均能对抗甲萘醌、过氧化氢和百草 枯引起的氧化损伤【。我们的实验结果显示,在.细胞中,不论是可逆性 蛋白酶抑制剂一还是不可逆性蛋白酶抑制剂均可以减少氧化性刺激 一,引起的细胞毒性,起到保护细胞的作用图。这与上述文献 报道一致。 .和州抗氧化作用最明显,几乎可以完全阻断氧化 性刺激;但是,随着浓度的升高,它们的抗氧化作用逐渐减弱。有文献报道,在 体外培养的小鼠新皮质神经元中,较低浓度的蛋白酶体抑制剂可以升高蛋白酶体 活性,从而对抗炎症、氧化性刺激对神经元的损伤【】。同样,在人皮肤成纤维母 细胞中,也有相似的报道】。因此,我们推测在细胞中,蛋白酶体抑制剂的 抗氧化损伤作用有可能也是通过升高蛋白酶体活性来实现的。蛋白酶体活性实验 发现,一和抑制蛋白酶体活性作用明显,并且它们对蛋白酶体活性的抑 制作用随着作用浓度的增加而增强,呈浓度依赖性图。这与上述文献报道 不一致,但较低浓度的蛋白酶体抑制剂能对抗氧化损伤这个观点是与文献报道一 致的。因此,我们推测蛋白酶体抑制剂在不同细胞中抗氧化损伤的作用机制有可 能不同。我们用方法检测蛋白酶体中?与亚基表达量附录图, 检测低浓度蛋白酶体抑制剂是否是通过提高?和/或亚基表达量来发挥其抗氧化 作用的。实验结果显示,伍与亚基表达量均无明显变化,说明我们的推测不可 行, 可能是其他的机制。 有文献报道,具有抗炎、抗氧化的功能引,在小胶质细胞中,低浓 度蛋白酶体抑制剂.可以激活转录因子。因而,我们推测在一 细胞中低浓度蛋白酶体抑制剂的抗炎、抗氧化作用也可能是通过激活转录因子 而介导的。我们使用的抑制剂、的抑制剂 在一细胞中进行细胞毒性试验,发现~ 能显著逆转 .对细胞的保护作用图,;而的作用效果则不显著 图,。因此,我们推测 一对细胞的保护作用可能是通过激温州医学院硕士学位论文 活转录因子介导的,而不是通过激活丫。有文献报道,的天 然配体?也不是通过激活,减少过氧 化氢对细胞的氧化损伤】。另外,我们使用~“ 、~吣 单独处理一细胞并未发现细胞毒性图,这排除了~吣噍 有可能是因细胞毒性而使 .的抗氧化作用发生逆转。同 样,也未发现蛋白酶体活性升高图,排除了~脚是因为升高 蛋白酶体活性也起抗氧化作用,而使其逆转作用不明显。这些结果更肯定了我们 .可能是通过激活转录因子,对细胞起保护作 的推测,即 用。我们通过双荧光素酶报告基因实验和电泳迁移率实验进行进一步 验证。双荧光素酶报告基因实验结果显示,一能增加的转录活性, 并且其作用随着作用浓度的增加而增强,呈浓度依赖性图。结果显 示, .能增加与的结合能力,随着作用时间的增加, 条带增强图。但加入和抗体后,并不能检测到明显 条带的 的 条带图。这与在脂肪细胞中观察不到明显 报道一致】。可能是由于抗体的局限性,并未出现明显条带。但是与不加抗体 组相比,条带明显减弱了,说明中部分与和抗体结 合了。与我们推测不一致的是,加入抗体组较加入抗体组相比, 条带减弱程度更大,具体原因不明。基于以上这些实验结果,我们得出在 一细胞中可逆性蛋白酶体抑制剂一可能通过途径对抗氧化 损伤。 然而,对于不可逆性蛋白酶体抑制剂,情况有所不同。细胞毒性实验结 果表明,在处理的一细胞中,无论是还是,均不能显 著逆转 对细胞的保护作用图。同样,双荧光素酶报告基因实验结果 可能不是通过 显示,也不能增的转录活性。这说明 途径对抗氧化损伤。有文献报道,在.细胞中,?对抗氧化损伤作 用是通过提升细胞内含量实现的【。我们的还原型谷胱甘肽实验结果也显 示,州单独处理一细胞能显著提高细胞内的含量附录图。 同样,在和一/共同处理组的实验结果也显示,细胞内的含量也 较./处理组明显提高。这与文献报道一致。说明在.细胞中, 抗氧化损伤有可能是通过提高细胞内抗氧化酶的活力,从而产生更多的抗氧 . 化性物质来保护细胞。有研究指出,细胞内的含量与可能与. 和途径有关,抑制肿和途径,细胞内的含量降低瞄。 我们后续实验将探讨抗氧化作用的机制。 一和的作用机制不同,可能的原因是一为可逆性蛋白酶体抑 温州医学院硕士学位论文 制剂,而为不可逆性蛋白酶体抑制剂,它们与受体作用的方式不同,. 能快速脱离受体,则与受体牢固结合。还有可能是因为它们结构上的差异, 造成作用机制不同。一属于合成的肽醛类抑制剂,而是链霉菌属的天然 代谢物,选择性和不可逆性结合于蛋白酶体的亚单位。 本课题研究蛋白酶体抑制剂在一细胞中的抗炎、抗氧化作用,从新 的角度研究中细胞的死亡机制,该课题的完成有助于我们进一步了 解,从而为的预防和治疗提供新的靶点和理论依据。温州医学院硕士学位论 文 本课题在一细胞中研究可逆性蛋白酶抑制剂一和不可逆性蛋白 酶抑制剂的抗炎、抗氧化作用,并从以下几个方面研究它们的作用机制:升 高蛋白酶体活性;增加蛋白酶体亚基的表达;激活转录因子;升高还原型 谷胱浓度。实验结果显示,在一细胞中,可逆性蛋白酶抑制剂.和 不可逆性蛋白酶抑制剂均可以减少氧化性刺激一/引起的细胞毒 性,起到保护细胞的作用。不同浓度的.和均不同程度降低蛋白酶体活 性,并且它们对蛋白酶体活性的抑制作用随着作用浓度的增加而增强,呈浓 度依 赖性。一的抗氧化作用可能是通过激活转录因子而介导的。而抗 氧化损伤机制目前还不清楚,有可能是通过提高细胞内抗氧化酶的活力,从 而产 生更多的抗氧化性物质来保护细胞。本课题的完成可以帮助我们进一步了解 中细胞的死亡机制,从而为的预防和治疗提供新的靶点和理论依 据。温州医学院硕士学位论文 参考文献 【】.,..,.., . : , . ,:? 【....,.., ... ,:. 【】 .,.. , . : ? . .,: 【】..,..., . ? . ,:【.... ,:? 【...,.., , ., . ,:? ..,..,...,:? . ,, 【..,. : . ,: 【... . ,:?【.,.. .?. ,:?【】.,..,. ... ,:? . 【..,. ,., . ,: . 【.. : ,: .. . 【..,.. ,:。 【?... ... 温州医学院硕士学位论文 . ,: . ...,.,’ . ,: ..,.. ...?. ,:? . ...,., : . ,: .. 【.,., . : . 【.,..,,. ,: . 【 ,. ,.., . ,: . 【..,..,.. . ,: . ,., 【., , 。 ?,: .,.. .. 。 ,:? . . ,.,., ??. ,:. . : . 一. ,: ..,., , :. ,: . 【. ,., ,? . ,: 【..,..,.., . . ,:? 温州医学院硕士学位论文 【. ,..., .. ,: . 【..,..,。, 一 . ,. . 【.. , :一. ,...,.. .一?, , :?... . ,.. 一。 ,, 一 . ,