细胞内酸性磷酸酶的显示细胞内酸性磷酸酶的显示
1、掌握细胞中酸性磷酸酶的显示方法。
2、观察酸性磷酸酶在细胞中的存在部位。
细胞中存在着能分解磷酸酯的酶,它们可分为一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯
酶等三类,其中最主要的是一磷酸酯酶。这类酶按最适pH值又可分为两类,一类在pH9.5左右的条件下发挥作用,称为碱性磷酸酶;另一类在pH5.0左右的条件下发挥作用,称为酸性磷酸酶。当酸性磷酸酶与含有磷酸酶的作用底物(如甘油磷酸钠)一起保
温时,能水解磷酸酯使其释放出磷酸基,磷酸基进而与底物中存在的铅盐结合形成无色
的磷酸铅(PbHPO)沉淀物,当用黄...
细胞内酸性磷酸酶的显示
1、掌握细胞中酸性磷酸酶的显示方法。
2、观察酸性磷酸酶在细胞中的存在部位。
细胞中存在着能分解磷酸酯的酶,它们可分为一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯
酶等三类,其中最主要的是一磷酸酯酶。这类酶按最适pH值又可分为两类,一类在pH9.5左右的条件下发挥作用,称为碱性磷酸酶;另一类在pH5.0左右的条件下发挥作用,称为酸性磷酸酶。当酸性磷酸酶与含有磷酸酶的作用底物(如甘油磷酸钠)一起保
温时,能水解磷酸酯使其释放出磷酸基,磷酸基进而与底物中存在的铅盐结合形成无色
的磷酸铅(PbHPO)沉淀物,当用黄色的硫化铵作用该沉淀时可形成黄棕色或棕黑色4
的硫化铅沉淀;从而使细胞中酸性磷酸酶显示出来。本实验项目以小鼠腹腔巨噬细胞为
材料显示该酶的存在。
1显微镜、恒温水浴锅、注射器、盖玻片、载玻片、剪刀、镊子、酒精灯
等。
2小白鼠。
36%淀粉肉汤、0.85%生理盐水、酸性磷酸酶工作液、福尔马林、钙固定
液、2%硫化铵溶液、甘油明胶封固剂。
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(1)6%淀粉肉汤:称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g加入到100ml蒸馏水中溶解,再加入可溶性淀粉6g,温浴溶解,煮沸15分钟灭菌,置4:C冰箱中保存,使用时水浴融化。
(2)0.85%生理盐水:称取8.5gNaCl溶于1000ml蒸馏水中。
(3)酸性磷酸酶工作液:
? 0.05mol/L醋酸缓冲液:先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中均匀混制成0.2mol/L的醋酸液(A液),再称取醋酸钠(NaAc?3H
O)2.72g溶2于100ml蒸馏水中配成0.2mol/L的醋酸钠溶液(B液)。取A液30ml加B液70ml混匀即成0.05mol/L醋酸缓冲液,置4:C保存。
? 3%β-甘油磷酸钠溶液:称取β-甘油磷酸钠3g溶于100ml蒸馏水中,4:C保存。
? 工作液:临用时,称取硝酸铅25mg,溶于22.5ml的0.05mol/L醋酸缓冲溶液中,待全部溶解后,再缓慢地滴加入3%的β-甘油磷酸钠液2.5ml,同时快速搅动,防止产生絮状物。
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(4)福尔马林?钙固定液:先称取无水CaCl10g溶于100ml蒸馏水中配成10%2
氯化钙溶液,取该液10ml加入到80ml蒸馏水混匀,即成福尔马林?钙固定液。
(5)2%硫化铵:量取2ml硫化铵加入到98ml蒸馏水中,现配现用。
(6)甘油明胶封固剂:称取明胶7g加入42ml蒸馏水中,水浴加温溶解,再加入
50ml甘油并搅匀,另加少许麝香草酚作防腐剂,置4:C贮存,使用水浴加温融化。
1、取20g左右小白鼠一只,每日往其腹腔注射6%淀粉肉汤1ml,连续三天。
2、在第三次注射后3~4小时,再向腹腔注射生理盐水1ml。
3、过3~5分钟后取腹腔液0.1~0.3ml(注意抽取部位要尽量与注射部位相一致,否
则难以抽出)或用颈椎脱臼法处死小白鼠后,打开腹腔,用注射器(不装针头)直接吸
取腹腔液。
4、往预冷的盖玻片上滴一滴腹腔液,立即用牙签涂后放入小培养皿4:C冰箱中30分钟,使细胞自行铺展开。
5、冷风吹干玻片,如室温低于20:C,可任其自然干燥。
6、往盖玻片上滴加酸性磷酸酶工作液两滴(或将玻片插入盛有酸性磷酸工作液的
小染色缸中),37:C温育30分钟。
7、取出盖玻片用蒸馏水冲洗,然后立于吸水纸上吸去多余水分。
8、放入盛有10%福尔马林?钙固定液的小染色缸内处理5分钟,进行后固定。
9、取出玻片,在蒸馏水中漂洗,再吸去多余水分。
10、放入2%硫化铵溶液中处理3~5分钟。
11、蒸馏水漂洗。
12、取一载玻片,往其中滴一滴明胶甘油封固剂,将带水的盖玻片有细胞的一面朝
下,慢慢盖向载玻片上的明胶甘油,使盖玻片封固在载玻片上(注意避免气泡的产生)。
13、观察:将制备好的标本置于光镜下,在高倍镜下可见许多呈阳性反应的巨噬细
胞,其细胞质中出现许多大小不等的棕色或棕黑色颗粒和斑块,这便是酸性磷酸酶存在
的部位(溶酶体),有些细胞内酸性磷酸酶极为丰富,故整个细胞质都呈现出黑色沉淀。
1、简述酸性磷酸酶显示原理。
2、绘制3~4个巨噬细胞图,分别
示酸性磷酸酶存在部位。
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