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华北农学报·2010，25(4):107-110猪流感病毒河南株的分离鉴定和生物学特性赵朴1，2，郑玉姝1，2，贾贝贝1，2，刘丽艳1，刘兴友1，2，李海燕3(1．河南科技学院动物科学学院，河南新乡453003;2．动物疫病和残留物防控河南省高校技术研究中心，河南新乡453003;3．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001)摘要:从河南省有呼吸道症状的5个不同猪场采集棉拭子和肺组织样品。样品处理后，通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚。获得3株病毒，经血凝和血凝抑制试验鉴定，为H3N2亚型流感病毒，并对其部分生物学特性进行了－9.56－8.56－8.44研究。结果明，其半数鸡胚感染量(EID50)分别是0/0.2mL，10/0.2mL和10/0.2mL，对小白鼠的半－1.56－1.45－1.50数致死量(LD50)分别是10/0.1mL，10/0.1mL和10/0.1mL;它们的血凝素对热不稳定，能凝集1%马、牛、驴、猪、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小白鼠及人O型血的红细胞。这为了解河南猪群中流行的流感病毒奠定了基础。关键词:猪流感病毒;分离;鉴定;生物学特性中图分类号:S432.4+1文献标识码:A文章编号:1000－7091(2010)04－0107－04Isolation，IdentificationandBiologicalCharacterizationofSwineInfluenzaVirusesinHenanZHAOPu1，2，ZHENGYu-shu1，2，JIABei-bei1，2，LIULi-yan1，LIUXing-you1，2，LIHai-yan3(1．DepartmentofAnimalScienceandTechnology，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China;2．ResearchCenterforAnimalDiseasesControlandResiduesSupervision，Xinxiang453003，China;3．StateKeylaboratoryofVeterinaryBiotechnology，AnimalInfluenzaLaboratoryofMinistryofAgriculture，HarbinVeterinaryResearchInstituteofChineseAcademyofAgricultureSciences，Harbin150001，China)Abstract:Sampleswerecollectedbycottonswabsandlungtissuesfrompigswithrespiratorysystemproblemson5farmsinHenanprovince．Sampleswereinoculatedinto10-day-oldSPF-embryonatedeggsviatheallantoicroute，af-terbeingprocessed．ThreeisolateswereobtainedandidentifiedasinfluenzaAvirussubtypeH3N2byHAandHI．－9.56－8.56Somebiologicalpropertiesofthemwerestudied．50%egginfectivedoses(EID50)were10/0.2mL，10/0.2－8.44－1.56－1.45mLand10/0.2mL.50%lethaldoses(LD50)tosmallwhitemiceofthestrainwere10/0.1mL，10/0.1mLand10－1.50/0.1mL，respectively．Hemagglutininsofthestrainswereunstabletoheat．Redbloodcellsofhorse，cattle，pig，donkey，pig，sheep，cock，rabbit，guineapig，smallwhitemouse，bigwhitemouseandhumanO-typecouldbeagglutinatedbytheisolate．ItwilllayafoundationforunderstandinginfluenzavirusescirculatinginswineherdsinHenanprovince．Keywords:Swineinfluenzavirus;Isolation;Identification;Biologicalproperties猪流感(Swineinfluenza，SI)是由猪流感病毒面同时存在人流感病毒受体SA-α-2，6Gal和禽流感(Swineinfluenzavirus，SIV)引起的猪的一种急性、病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)受体SA-α-2，3Gal，热性和高度接触性呼吸道传染病。它不仅引起病猪这样猪既可感染人流感病毒又可感染AIV，从而成高热、食欲减退、咳嗽、呼吸困难及出栏时间延迟等，为人-禽流感病毒重组的理想“混合器”［2］，众多重而且极易引其他病毒和细菌的混合感染［1］，使疫情组流感毒株的分离［3］和最近发生H1N1流感疫情为变得更加严重。更重要的是，猪呼吸道上皮细胞表这一假说提供了充分的证据［4］。因此，控制和监测收稿日期:2010－07－26基金项目:河南科技学院青年基金项目(7044)作者简介:赵朴(1975－)，男，河南南阳人，讲师，硕士，主要从事动物病毒学与免疫学方面的教学和科研工作。108华北农学报25卷猪群中的流感病毒不仅具有重要的经济意义，而且mL/胚，置35℃孵化4d，弃去24h内的死胚，观察具有重要的公共卫生意义。本研究对河南猪群中流记录鸡胚死亡情况。然后分别收集尿囊液，测定血感病毒进行分离与鉴定，并对其生物学特性进行研凝价，取接种稀释倍数最高且有血凝价的尿囊液继究，旨在为河南猪群中流感病毒的监测、分子生物学续做下一轮的纯化，连续纯化3轮。特征及其防制提供理论依据。1．2．2．2病毒的增殖将1．2．2．1中纯化的病毒液做10－4稀释，接种5枚10日龄SPF鸡胚，尿囊腔接种1材料和方法0.2mL/胚，置35℃孵化4d，弃去24h内的死胚，观1．1材料察记录鸡胚死亡情况。然后无菌收集尿囊液，测定其1．1．1阳性血清和抗原流感病毒H1、H3、H5和对1%鸡红细胞的血凝价，血凝价大于8log2的尿囊H9标准抗原和标准阳性血清、新城疫(ND)标准阳液，经无菌检验后分装小管，－70℃保存备用。性血清及N1、N2标准阳性血清，购自中国农业科学1．2．2．3血凝抑制(HI)试验按常规微量法［5］进院哈尔滨兽医研究所。行血凝抑制试验，以100%抑制凝集的血清最大稀1．1．2SPF鸡胚及试验动物SPF鸡胚购自山东释度为该血清的血凝抑制滴度，即血清效价。血凝昊泰试验动物繁育有限公司;昆明小白鼠购自河南抑制价大于或等于3log2为阳性。若待检病毒被已省实验动物中心。知流感单因子血清抑制血凝，该病毒即为相应亚型1．1．3病料的采集从河南省有呼吸道症状的5SIV。个不同猪场采集23份鼻棉拭子，立即放入用生理盐1．2．2．4神经氨酸酶抑制(NI)试验SIV血凝抑水配制的含20%～50%甘油的保存液(每毫升含制试验阳性而NDV血凝抑制试验阴性的样品与流2000U青霉素、200μg链霉素、500μg庆大霉素、感病毒N1、N2标准阳性血清进行NI试验，其操作1000U卡那霉素、100U强力霉素)，及2份病死猪程序与判定标准均按文献［6］的方法稍加改良进的肺样，放入冰瓶，快速送到实验室，进行病毒分离。行:先将病毒稀释液与胎球蛋白混合，37℃温育过1．2方法夜。每管加入50μL病毒稀释液，然后加入50μL1．2．1SIV的分离正常血清、N1、N2血清及PBS，混匀;室温作用301．2．1．1鼻拭子及肺样的处理装有鼻拭子的玻min，在每个试管中加入0.1mL胎球蛋白，混匀，用璃瓶先用涡旋混合器振荡，然后用无菌镊子将棉拭封口膜密封试管，37℃水浴过夜。每管加入0.1mL子头部在瓶壁反复挤压后取出，室温1000g离心过碘酸钠，混匀，室温作用20min，每管加入1mL亚10min，取上清;将肺样分别剪碎，充分研磨后用配砷酸盐，溶液显棕黄色，剧烈振荡试管至棕黄色消成1∶10的混悬液，冻融3次后1000g离心15min，失;在每管中加入2.5mL硫代巴比妥酸盐，剧烈震取上清;分别在上述上清液中加入双抗(青霉索、链荡，沸水浴15min，取出试管后放置10min，判定结霉素各1000U/mL)，4℃作用2h，然后分别对上清果。液进行无菌检验，合格后分为2份，一份鸡胚接种，1．2．3SIV部分生物学特性另一份－20℃保存。1．2．3．1鸡胚半数感染量(EID50)测定用无菌生1．2．1．2鸡胚接种将1．2．1．1中处理的上清液理盐水将感染第5代SIV的新鲜尿囊液做10×倍－7－11通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每份接种4枚，比稀释，取10～10稀释度的病毒液，分别接种0.2mL/胚，置35℃下孵化4d。弃去24h内死胚，4枚10日龄SPF鸡胚，每胚尿囊腔各0.2mL，35℃将24～96h内死亡和存活鸡胚置4℃冰箱过夜或孵化4d，观察记录鸡胚感染情况，计算各稀释度感［7］－20℃下存放1h，然后分别无菌收集尿囊液，测定染鸡胚的百分率，按Reed-Muench方法计算其对1%鸡红细胞的凝集活性，有血凝活性者做进EID50。一步鉴定;无血凝活性者盲传3代，仍无血凝活性者1．2．3．2小鼠半数致死量(LD50)测定按1．2．3．视为阴性。1方法稀释病毒，取10－1～10－5稀释度的病毒液鼻1．2．2亚型鉴定腔接种昆明小白鼠，每一稀释度接种5只，0.11．2．2．1毒株的纯化对初步鉴定为阳性的样品mL/只，每天观察小鼠并记录死亡情况，直至感染后通过有限稀释法纯化病毒，具体操作如下:将含病毒第14天(24h内死亡的不予统计)，按Reed-Muench－4－9［7］的尿囊液进行10×倍比稀释，10～10每个稀释方法计算LD50。度接种4枚10日龄SPF鸡胚，尿囊腔接种0.11．2．3．3血凝素稳定性测定将新收获的无菌尿4期赵朴等:猪流感病毒河南株的分离鉴定和生物学特性109囊液分装于11个带盖的塑料管中，0.5mL/管，置2．1．3神经氨酸酶抑制试验结果分离株与N1、N256℃水浴0，5，10，15，30，60，90，120，150，180，210标准阳性血清进行神经氨酸酶抑制试验试验，其中min及过夜，处理后迅速放到4℃水浴5～10min，分加N2阳性血清的样品呈浅黄色，而加N1阳性血别测定其血凝价。清、正常血清及PBS的均成呈浅红色，表明分离毒1．2．3．4红细胞凝集谱测定用新收获的感染株为N2抑制阳性，N1抑制阴性，由此可知分离毒SIV的无菌尿囊液对新鲜制备的1%马、牛、驴、猪、株为N2亚型。绵羊、鸡、兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠及人O型血的红2．2部分生物学特性细胞做血凝试验，测定对红细胞的凝集谱。血凝价2．2．1EID50测定结果将感染第5代SIV新鲜尿大于或等于4log2的视为凝集，记为“+”，小于囊液按10×倍比稀释后接种10日龄SPF鸡胚，记4log2的视为不凝集［8］，记为“－”。录鸡胚感染情况，分离株SWHN1，SWHN2和SWHN3的EID分别是10－9.56/0.2mL，10－8.56/0.22结果与分析50mL和10－8.44/0.2mL。2．1毒株的分离与鉴定2．2．2LD50测定结果将感染第5代SIV新鲜尿2．1．1血凝试验结果有5份样品的第1代尿囊囊液按10×倍比稀释后以鼻腔内接种昆明小鼠，记液对1%公鸡红细胞有凝集活性，它们采自2个不录小鼠的存活和死亡情况，分离株SWHN1，SWHN2－1.56－1.45同猪场，另外1猪场的1份棉拭子在盲传后出现了和SWHN3的LD50分别是10/0.1mL，10/血凝活性，而用ND阳性血清对这些具有血凝活性0.1mL和10－1.50/0.1mL。的尿囊液做血凝抑制试验，结果均为阴性。2．2．3血凝价测定结果待检病毒株置于56℃水2．1．2血凝抑制试验结果分离株的血凝性均可浴不同时间，测定其血凝价，结果见表1，根据判定被H3标准阳性血清抑制，而不能被H1、H2、H5、H9标准［8］分离毒株的血凝素属于热不稳定型。标准血清抑制，说明该分离毒株为H3亚型SIV。表1待检病毒株56℃下的血凝价Tab．1Thetiterofstraintobetestedunder56℃毒株名称56℃水浴时间/minWaterbathtimeunder56℃热稳定类型Strainname051015306090120150180210过夜ThermalstabilitypeSWHN11085654442332热不稳定型SWHN21199887654220热不稳定型SWHN3976654454320热不稳定型2．2．4红细胞凝集谱红细胞凝集谱的测定结果驴、猪、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小白鼠及人O型血的红见表2。由表2可知，分离的病毒均可凝集马、牛、细胞，表明这些红细胞上有流感病毒受体。表2红细胞凝集谱测定结果Tab．2Resultofagglutinationspectrum1%红细胞来源毒株名称Strain豚鼠小白鼠大白鼠人O型血马牛驴猪兔鸡绵羊GuineaSmallBigwhtieHumannameHorseCattleDonkeyPigRabbitCockSheeppigwhitemousemouseO-typeSWHN1+++++++++++SWHN2+++++++++++SWHN3+++++++++++注:+．表示凝集该种动物1%红细胞;－．表示不凝集该种动物1%红细胞。Note:+．Agglutination1%RBCoftheanimal;－．Notagglutination1%RBCoftheanimal．中，冰瓶保存。若不能在2d内对样品进行病毒分3结论与讨论离，则应放在－70℃下保存。样品在保存过程中，应3．1病毒分离避免反复冷冻和融化。再者，若第1代尿囊液，没有病毒分离是目前诊断猪流感的常用方法。该法血凝活性，则应盲传后，再测定血凝活性，若盲传三敏感、特异，被公认为是流感诊断的“黄金标准”，但代仍没血凝活性，方可视为阴性样品，否则可能引起该法不能检测到已失活的病毒，因此，在样品的采假阴性结果，本试验中就1份棉拭子样品在盲传后集、运输、保存、处理过程中保持病毒的感染活性是出现了血凝活性，并最终鉴定为H3N2亚型SIV。病毒分离的关键。将棉拭子或病料放在运输缓冲液110华北农学报25卷3．2生物学特性鼠、大白鼠和人O型血的红细胞，表明这些红细胞流感病毒的生物学特性表现广泛，其中病毒的上有流感病毒受体。致病性是流感病毒最重要的生物学特性之一。目前对致病性的判定还没推荐的标准，但由于SIV具有参考文献:感染人和禽的潜力，而且人流感病毒和AIV也可以［1］赵朴，郑玉姝，李海燕．猪流感———一个不容忽视的感染猪。基于猪在SIV种间传播链中的中间宿主和人兽共患病［J］．中国兽医杂志，2008，44(9):54－56．多重宿主作用，及我国流感生态学的复杂性，了解流［2］ItoT，CouceiroJ，KelmS，etal．MolecularbasisforthegenerationinpigsofinfluenzaAviruswithpandemicpo-行于猪群中流感病毒的致病性，很有现实意义。tential［J］．JVirol，1998，72(9):7367－7373．EID50和LD50是反映病毒生物学特性最常考虑的两［3］KarasinAI，CarmanS，OlsenCW．Identificationofhu-个指标，与其致病力有一定的相关性。本研究对流manH1N2andhuman-swinereassortantH1N2andH1N1感病毒分离株的EID50、LD50进行了测定，由试验结influenzaAvirusesamongpigsinOntario，Canada(2003果可知病毒稀释后接种小白鼠，可感染并致死小白to2005)［J］．JClinMicrobiol，2006，44(3):1123－鼠，并且接种后第14天在小白鼠血清中检测到抗1126．H3亚型流感病毒抗体，说明分离的流感毒株对小白［4］NaffakhN，vanderWerfS．April2009:Anoutbreakof鼠具有致病性，并且通过免疫预防具有可行性。swine-origininfluenzaA(H1N1)viruswithevidencefor3．3血凝素的热稳定性human-to-humantransmission［J］．MicrobesInfect，血凝素是流感病毒粒子最重要的表面糖蛋白，2009，11(8/9):725－728．［5］OlsenCW，SCarey，LHinshaw，etal．Virologicandse-在流感病毒感染中发挥重要作用:结合流感病毒的rologicsurveillanceforhuman，swineandavianinfluenza受体，是感染的先决条件;介导病毒囊膜与细胞膜融virusinfectionsamongpigsinthenorth-centralUnited合，促使病毒进入敏感细胞，同时能诱导机体产生中States［J］．ArchVirol，2000，145(7):1399－1419．和抗体。因此，血凝素热稳定性强的病毒株在自然［6］BrownIH，ChakravertyP，HarrisPA，etal．Diseaseout-环境中存活的能力相对较强，有更多的机会在同一breaksinpigsinGreatBritainduetoaninfluenzaAvirus［8］宿主或不同宿主间进行传播。根据判定标准，本ofH1N2subtype［J］．VetRec，1995，136(13):328－329试验分离流感毒株的血凝素均为热不稳定型。［7］郭元吉，程小雯．流行性感冒病毒及其实验技术［M］．3．4红细胞凝集谱北京:中国三峡出版社，1997:109－119．红细胞凝集活性是SIV的重要生物学特性之［8］李海燕．SIV分离株生物学特性及分子流行病学与演一，能反映病毒对红细胞的结合活性。本试验分离化研究［D］．广州:华南农业大学，2002．的SIV能凝集马、牛、驴、猪、兔、鸡、绵羊、豚鼠、小白