强壮前沟藻（Amphidinium carterae Hulburt）毒素的溶血活性研究

强壮前沟藻（Amphidinium carterae Hulburt）毒素的溶血活性研究 强壮前沟藻(Amphidinium carterae Hulburt)毒素的溶血活性研究 第4O卷第6期 2009年11月 海洋 OCEANOLOGIAET 与湖沼 LIMNOLOGIASINICA VO1.40.NO.6 NOV.,2009 强壮前沟藻(AmphidiniumcarteraeHulburt)毒素的 溶血活性研究木 葛蔚王金叶2柴超,4? (1.青岛农业大学生命科学学院青岛266109;2.青岛农业大学动物科技学院青岛266109 3.青岛农业大学资源与环境学院青岛266109;4.中国科学院海洋研究所 海洋生态与环境重点实验室青岛266071) 提要以实验室单种培养的强壮前沟藻为对象,研究了强壮前沟藻毒素的来源,分析了藻毒素浓 度与溶血活性的相关性,研究了理化因子对藻毒素溶血活性的影响.结果表明,溶血活性随着强壮前 沟藻细胞的增殖呈上升的趋势,细胞物和细胞碎片的溶血活性显着高于去藻过滤液,强壮前沟 藻毒素主要来源于衰亡期的细胞内容物和细胞碎片,并存在浓度相关的溶血性.强壮前沟藻毒素的 溶血活性不存在光敏感性.随着pH的上升,毒素溶血活性呈降低趋势.Ca2+,Mn2.,cu抑制了强 壮前沟藻毒素溶血活性,而co2十,zn显着的增强了溶血活性,Mg对其溶血活性的 影响不显着. EDTA对强壮前沟藻毒素的溶血活性有显着的促进作用. 关键词强壮前沟藻,毒素,溶血活性 中图分类号X55 随着近海富营养化问的加剧,有毒有害藻形 成的赤潮规模逐渐增大,频率逐渐增加,给水生生态 系统和水产养殖带来极大的危害,其中甲藻产生的 有毒次生代谢产物成为国内外学者的研究热点(颜天 等,2001;周名江等,2006;彭喜春等,2006;贺华等, 2007;Smithetal,1991;Riegmanefal,1992;Capriulo etal,2002).强壮前沟藻(AmphidiniumcarteraeHu1. burt)属甲藻类前沟藻属,主要分布于热带和温带海 域,为世界性分布种.强壮前沟藻是一种能产生溶血 性毒素的有害赤潮藻种,其特有的次生代谢产物一 直备受关注.对于该藻的生长特性,环境条件对其生 长的影响及其产毒等相关研究在国外已有报道 (Nayaketal,1997;韩笑天等,2004;Echigoyaelal, 2005).在我国,该藻分布的报道仅见南海和海南三亚 海域,关于强壮前沟藻溶血毒素的研究尚未见报道. 本研究以强壮前沟藻为研究对象,初步研究了强壮 前沟藻毒素的来源,分析了藻毒素浓度与溶血活性 的相关性,研究了理化因子对藻毒素溶血活性的影 响,从而为有害赤潮防治提供科学依据. l材料与方法 1.1培养条件 强壮前沟藻藻种由中国科学院海洋研究所提供, 在室内(20士1)?,光照强度为3500--3800lx,光暗比 为12h:12h的条件下,于?2培养液中培养,观察. 通过藻细胞计数法确定藻细胞密度,绘制生长曲线, 确定生长时期. 1.2各组分的制备及溶血毒素的提取 藻液经4000r/min离心10min后,上清液作为去 藻过滤液,藻细胞沉淀用超声波破碎后,经 10000r/min离心10min,取上清液作为藻细胞内容物, 沉淀作为藻细胞碎片.各组分的浓度都相当于4.35~ 山东省自然科学基金项目,Q2007D06号;青岛农业大学高层次人才启动基金项 目,630642号.葛蔚,副教授,E-mail gwi2050@126.tom ?通讯作者:柴超,博士,副教授,E—mail:chaichao1999@126.com 收稿日期:2008—10—21,收修改稿日期:2008—12—27 6期葛蔚等:强壮前沟藻(,ff"carteraeHulburt)毒素的溶血活性研究733 10cells/ml.强壮前沟藻毒素的提取方法参照Nayak 等(1997)的方法,取各时期的去藻过滤液和和藻细胞 内容物,用氯仿萃取5次,收集氯仿,旋转蒸发后收 集浓缩物,置于真空干燥器中干燥,该浓缩物为强壮 前沟藻粗毒素. 将藻细胞内容物中提取的毒素用含有 l37mmol/LNaC1,2.7mmol/LKCI,8.1mmol/L Na,HPO4和1.5mmol/LKH2PO4的磷酸缓冲液(PBS, pH=7.2)稀释到原浓度的1/4和1/16,以获得不同的 浓度梯度. 1.3溶血活性测定 兔血经抗凝血处理,经2000r/min离心10min将 血浆分H{,用PBS缓冲液(pH=7.2)重复洗涤3次,沉 淀PBS缓冲液配成5%的红细胞悬液,4~C保存备用, 保存时间不超过3天,以避免血红细胞自溶. 溶血活性测定参照马兰萍等(2000)的方法并略 作改进,取0.5ml浓缩液与lml5%兔血红细胞悬液 等体积混匀,37?培养1.5h,温育期间反应混合液轻 轻摇动.温育完成后,取出反应液0.5ml加入4mlPBS 缓冲液,2000ffmin离心5min将红细胞分离,取上层 清液在紫外可见分光光度计上540nm波长处测其吸 光值;同样取出反应液0.5ml加入4ml1%的Triton X一100使其完全溶血,同样条件下离心后在540nm测 吸光值,百分溶血度等于(A/B)×100. 1.4理化条件对藻毒素溶血活性的影响测定 按照1.2的方法从衰亡期的藻细胞内容物中提取 溶血毒素,按照如下方法测定理化条件对藻毒素溶 血活性的影响. 1.4.1光照将0.5ml毒素与lml5%的兔血红细 胞悬液混合,分别在有光和无光的条件下37?培养 1.5h后,离心,测定吸光值,计算百分溶血度. 1.4.2pH将0.5ml毒素分别与lmlpH=5,6, 7.2,8的5%兔血红细胞悬液混合,37培养1.5h后, 离心,测定吸光值,计算百分溶血度. 1.4.3二价金属离子将0.5ml毒素与lml5%的 兔血红细胞悬液混合,分别加入Ca,Mgz+,Mn, co2+,zn,cu等的氯化物至终浓度为0.05,0.5, 5mmol/L,37~C培养1.5h后,离心,测定吸光值,计算 百分溶血度. 1.4.4EDTA将O.5ml毒素与lml5%的兔血红细 胞悬液混合,分别加入EDTA至终浓度为10,20, 40mmol/L,37?培养1.5h后,离心,测定吸光值,计 算百分溶血度. 1.5数据分析方法 实验重复3次.数据分析采用方差分析(ANOVA, LSD)对各实验与对照组均值之间的差异性进行显着 性检验.结果表示为平均值4-偏差. 2结果 2.1强壮前沟藻毒素的来源 表1结果表明,每万个细胞的溶血百分数随着藻 细胞的增殖呈上升的趋势,对数期百分溶血度略低, 稳定期的百分溶血度升高,衰亡期百分溶血度达到 最高值,显着高于对数期和稳定期(P<O.01).对不同 组分的溶血活性比较发现,去藻过滤液的百分溶血 度最低,碎片的百分溶血度最高.在对数期和稳定期, 去藻过滤液的百分溶血度只有1.29%和1.97%,衰亡 期去藻过滤液的百分溶血度有所增加,但也只有 7.81%,去藻过滤液的百分溶血度与对照的差异不显 着(P>0.1o相比而言,内容物和碎片呈现明显的溶血 活性,其百分溶血度显着高于去藻过滤液和对照 (P<0.001).在衰亡期,内容物和碎片的百分溶血度均 超过70%.因此,强壮前沟藻毒素主要来源于衰亡期 的细胞内容物和细胞碎片. 2.2藻毒素溶血活性的浓度相关性 从强壮前沟藻细胞内容物中提取毒素的溶血活 性研究(表2)发现,百分溶血度与毒素的浓度之间相 关系数为0.792(P<0.05),因此毒素存在浓度相关的 溶血性,随着稀释梯度的增加,百分溶血度呈明显的 降低趋势.当稀释梯度达到1/16时,其百分溶血度低 表1强壮前沟藻不同生长时期各组分的溶血活性 Tab.1ThehemolyticactivityofthetoxininthecomponentsofAcarteraeinvariousphases 734海洋与湖沼40卷 表2强壮前沟藻毒素不同浓度梯度下的溶血活性 Tab.2ThehemolyticactivityofthetoxininA.carteraein variousdilutiongradients 于2%,与对照组没有明显差异. 2.3理化条件对藻毒素溶血活性的影响 2.3.1光照对溶血活性的影响在有光条件下, 百分溶血度为88.83%+1.45%,在无光的条件下,百 分溶血度为88.97%4-4.41%,二者没有显着性差异 (尸=0.777),因此,强壮前沟藻毒素的溶血活性不存 在光敏感性. 2.3.2pH对溶血活性的影响不同pH对溶血活 性的实验表明(表3),随着pH的上升,百分溶血度呈 降低趋势.在pH=5和6时,百分溶血度最高,超过 96%,pH=5和6时的百分溶血度没有显着性差异 = 0.624);当pH=7.2和8时,百分溶血度降低显 着(P<0.05),低于89%. 2.3.3金属离子对溶血活性的影响由表4可以 看出,金属离子对溶血活性的影响很大,Ca2t,Mn2T, cu抑制了溶血活性,与对照组呈显着性差异,其中 Ca和Mn对溶血活性的抑制程度较低,添加 5mmol/L是百分溶血度分别降低了5.8%和8.O%,但 cuz+抑制溶血活性的程度较大,5mmol/L的Cu使百 分溶血度降低了60.4%.Co2+,Zn则相反,能显着 的增强溶血活性,5mmol/L的co和zn使百分溶血 度分别上升了7.0%和10.8%.与ca相似,Mg也在 一 定程度上抑制了溶血活性,但差异不显着. 2.3.4EDTA对溶血活性的影响表5表明,金属 鳌合剂EDTA对强壮前沟藻毒素的溶血活性有显着 的促进作用,随着EDTA浓度的升高,溶血活性显着 增加. 3讨论 毒素的生物合成机制非常复杂,有害赤潮藻毒 素的生物合成与藻细胞的生长环境及其生命周期存 在密切的关系(Lehtimkietal,1994).研究表明,亚历 山大藻在对数生长期时开始分泌溶血素,但溶血活 性很小,在生长稳定期和衰亡期溶血活性达到最大 值(Emuraaetal,2004;刘洁生等,2006).小定鞭藻和 球形棕囊藻在对数生长期没有溶血素产生,但在进 表3不同pH条件下强壮前沟藻毒素的溶血活性 Tab.3ThehemolyticactivityofthetoxininA.carteraeinvariouspH 表示P<O.05 表4金属离子不同浓度下强壮前沟藻毒素的溶血活性 Tab.4ThehemolyticactivityofthetoxininA.carteraeinthepresenceofmetalionsindifferent concentrations 表示P<O.05,+}表示P<O.O1 表5EDTA不同浓度下强壮前沟藻毒素的溶血活性 Tab.5ThehemolyticactivityofthetoxininA.carteraeinthepresenceofEDTAindifferentcon centrations 表示P<0.05,"表示P<0.01 6期葛蔚等:强壮前沟藻,f"carteraeHulbun)毒素的溶血活性研究735 入稳定期时,分泌大量溶血素,并在衰亡期达到最高 值(何家菀等,1996).从实验中可以看出,与亚历山大 藻相似,强壮前沟藻毒素的溶血活性在对数期活性 较低,但在衰亡期达到高值.研究者认为植物在营养 充足的条件下不会分泌有毒代谢物,只有在自身生 存环境受到压迫时,为保证自身生存繁殖所需要的 营养而激发的一种抑制其它竞争生物生长繁殖的功 能,因而当细胞进入生长平稳期或衰亡期时,营养物 质缺乏是导致细胞毒素生产能力增强的主要原因 (Boyeretal,1987;Boezaretal,1988). 不同来源的溶血毒素存在溶血程度的差异,表 明毒素的溶血机理不同(Yasumotoetal,1993).据文 献报道,微小卡罗藻在细胞破裂后向水中释放大量 溶血毒素,且细胞内容物的溶血活性显着高于去藻 过滤液(Deedsetal,2002;周成旭等,2007a).而微小 亚历山大藻和赤潮异弯藻细胞外溶血度大于胞内溶 血度,且胞外溶血度与种群密度存在相关性(Emuraa etal,2004;周成旭等,2007b).本研究结果表明,与 微小卡罗藻相似,强壮前沟藻溶血毒素主要来源于 细胞内容物和细胞碎片,说明该溶血物质主要是在 细胞破裂时溶出,而不是在细胞生长代谢分泌到水 中.研究表明,除细胞内容物外,一些产毒海洋微藻 的细胞表面也存在一层多糖或蛋白结构物质,有可 能是毒性物质的来源(颜天等,2003).Echigoya等 (2005)研究也表明,强壮前沟藻细胞中提取的多羟基 多烯类化合物具有抗真菌和溶血活性,因此,强壮前 沟藻毒素主要来源于细胞内和细胞表面.此外,强壮 前沟藻毒素均有与浓度相关的溶血特征,随着毒素 浓度的降低溶血活性降低,这与大多数的研究结论 一 致(周成旭等,2007a,b). 理化条件是影响毒素溶血活性的重要因素.研究 者发现,环状异甲藻产生毒素的溶血活性与光照相 关,在无光条件下没有溶血活性,而在有光条件下溶 血活性可接近100%(Satoetal,2002).本实验结果表 明,强壮前沟藻毒素的溶血活性不存在光敏感性特 征,在有光和无光条件下毒素的溶血活性没有显着 的差异. H浓度也是影响溶血毒素溶血活性的一个重要 因素,不同来源和结构的溶血毒素在不同的pH下其 活性是不同的(Malovrhetal,1999;Tsaieta,,1997). 球形棕囊藻毒素的溶血活性在pH为7时最强(彭喜 春,2005");小定鞭藻在pH<5时表现出溶血活性(何 家菀等,l996);而鱼腥藻的溶血活性随pH升高而降 低,在pH为5时最高(宋秀凯等,2006),这与本研究 的结果一致.这表明藻毒素的亲水端结构存在较大的 差异. ,即促进和 金属离子对溶血素的作用有2个方面 抑制.关于二价金属离子对溶血活性影响的结论存在 较大的差异.研究者发现无脊椎动体内的蛋白类溶血 毒素溶血作用的发挥需要Ca的参与(Canicatti, 1990),宋秀凯等(2006)研究发现Ca,Mg显着增加 多变鱼腥藻的溶血活性,而添加Ca2+,Mgz+等却抑制 了集胞藻的溶血活性(赵媛媛等,2007),其原因可能 是这些溶血毒素是不同的蛋白质,其活性表达有的 需要Ca2+,有的不需要Ca2+.此外,无脊椎动物体内 的溶血素一般为热不稳定性,溶血作用需要ca的参 与,但棘皮动物例外,其体液中的溶血因子为热稳定 性,并不需要ca的参与(Canicatti,1988).溶血毒素 的结构与性质导致ca在溶血活性中的作用有所不 同.文献表明,强壮前沟藻溶血毒素是多羟基多烯类 化合物,非蛋白质类物质,因此可能与上述藻毒素的 溶血机理存在较大差异.在本研究中,Ca2十,Mg2十抑 制了强壮前沟藻毒素的溶血活性.同时,Mn和Cu 也抑制了强壮前沟藻毒素的溶血活性,这与鱼腥藻 和集胞藻溶血毒素的结论一致f宋秀凯等,2006;赵媛 媛等,2007).某些金属离子对溶血作用的抑制有可能 是通过封锁红细胞膜上孔洞,使得胞外水分子不能 进入胞内,胞内渗透压的升高,从而阻止了红细胞膜 的渗透破坏.但是,co2十和zn却显着增加了强壮前 沟藻毒素的溶血活性,在集胞藻的溶血活性实验中 也发现zn有助于溶血活性的增强(赵媛媛等,2007). 因此,不同二价阳离子对强壮前沟藻毒素溶血活性 表达的影响存在较大的差异.而金属鳌合剂EDTA对 强壮前沟藻毒素的溶血活性有显着的促进作用.研究 者发现,在球形棕囊藻毒素的溶血实验中,EDTA可 以也消除Hg2+对溶血活性的抑制作用.其可能原因是 EDTA与溶血素粗提液中残留的金属离子可以结合, 从而解除了某些离子的抑制作用(彭喜春,2005"). 4结论 强壮前沟藻细胞内容物和细胞碎片呈现明显的 溶血活性,其百分溶血度显着高于去藻过滤液.在衰 1)彭喜春,2005.球形棕囊藻溶血毒素及其生物合成机制的研究.华南理工大学博士 学位论文 736海洋与湖沼40卷 亡期,细胞内容物和细胞碎片的溶血活性高于其它 时期.因此,强壮前沟藻毒素主要来源于衰亡期的细 胞内容物和细胞碎片.百分溶血度与毒素的浓度之间 相关系数为0.792,强壮前沟藻毒素存在浓度相关的 溶血性. 强壮前沟藻毒素的溶血活性不存在光敏感性, 有光和无光条件下溶血活性不存在显着性差异.随着 pH的上升,溶血活性呈降低趋势.在pH=5和6时,百 分溶血度最高.Ca2+,Mn2+,Cu抑制了强壮前沟藻 毒素的溶血活性;Co,Zn则相反,能显着的增强溶 血活性;Mg也在一定程度上抑制了溶血活性,但与 对照的差异不显着.金属鳌合剂EDTA对强壮前沟藻 毒素的溶血活性有显着的促进作用,随着EDTA浓度 的升高,溶血活性显着增加. 参考文献 马兰萍,刘在群,周波等,2000.绿茶多酚对自l由基诱导的 红细胞氧化性溶血的抑制作用.科学通报,45(12):1271一 l275 刘洁生,彭喜春,杨维东,2006.营养胁迫下球形棕囊藻 (PhaeocystisglobosaScherffe1)的生长行为及溶血活性. 生态,3:780—785 何家菀,陈明惠,何振荣,1996.小定鞭藻毒素的分离与鉴定. 水生生物,20(1):4l一48 宋秀凯,王蔚,刘云章等,2006.理化因子对多变鱼腥藻溶 血素活性的影响.安全与环境,6(6):38—40 周成旭,傅永静,严小军,2007a.新型赤潮种类微小卡罗藻的 溶血毒性检测.海洋通报,26(3):l12一l16 周成旭,傅永静,严小军,2007b.4种典型有害赤潮原因种的 溶血特性研究.生态毒理,2(1):78—82 周名江,于仁成,2006.有害赤潮的形成机制,危害效应与防 治对策.自然杂志,29(2):72—77 赵媛媛,王蔚,刘云章等,2007.理化因子对集胞藻 PCC6803溶血素溶血活性的影响.环境科学研究,20(4): l39—143 贺华,王学魁,孙之南等,2007.渤海裸甲藻和链状亚历山 大藻的麻痹性贝毒毒素分析.海洋通报,26(5):67—73 彭喜春,刘洁生,杨维东,2006.赤潮藻毒素生物合成研究进 展.热带亚热带植物,l4(1):8l一86 韩笑天,颜天,邹景忠等,2004.强壮前沟藻mphidinium carteraeHulburt)形态特征及其生长特性研究.海洋与湖 沼,23(5):279,283 颜天,周名江,2001.加强赤潮毒性评价和灾害评估势在必 行.海洋科学,25(4):55—57 颜天,周名江,傅萌等,2003.赤潮异弯藻毒性及毒性来 源的初步研究.海洋与湖沼,34(1):50—55 BoezarBA,BeitlerMK,ListonJetal,1988.Paralyticshellfish toxininProtogonyaulaxtamarensisandProtogonyaulax catenellainaxenicculture.PlantPhysiology,1285—1290 BoyerGL,SullivanJJ,AndersenRJeta1. 1987.Effectsof nutritionlimitationontoxinproductionandcompositionin marinedinoflagellateProtogonyaulaxlamarensis.Marine Biology,96:l23—128 CanicattiC,1988.ThelyticsystemofHolothuricpolii(Echino— dermata):areview.BollettinoDiZoologia,55(3):139—144 CanicattiC,1990.Hemolysins:poreformingproteinsininverte— brates.Experientia,46(3):239—244 CapriuloGM,SmithGTroyRelal,2002.Theplanktonicfood webstructureofatemperatezoneestuary,anditsalteration duetoeutrophication.Hydrobiologia.475—476:263—333 DeedsJR,TerlizziDE,AdolfJEetal,2002.Toxicactivity fromculturesofKarlodiniummicrum(Gyrodiniumgalat— heanum)(Dinophyecae)'__.'..——adinoflagellateassociated withfishmortalitiesinanestuarineaquaculturefacility. 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KeywordsAmphidiniumcarteraeHulburt,Toxin,Hemolyticactivity