多糖纳米薄膜材料的AFM的研究

多糖纳米薄膜的AFM的研究 ?:. 关于学位论文独创声明和学术诚信承诺 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明:所呈交的学位论文是本 人在导师的指导下独立完成的,对所研究的课题有新的见解。据我所知,除文中 特别加以说明、标注和致谢的地方外,论文中不包括其他人已经发表或撰写过的 研究成果,也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 在此本人郑重承诺:所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为,文责自负。 学位申请人学位论文作者签名: 逡迄年月日 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者,本人完全了 解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求,即河南大学有权向国家 图书 馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文纸质文本和电 子文本以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展 和进行学术交流等目的,可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇 编学位论文纸质文本和电子文本。 涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书 学位获得者学位论文作者签名:盈堡 日 年月 学位论文指导教师签名:羔丛垒 荔孤硇年箩月?目摘要 纳米薄膜是指尺寸在纳米量级的分子颗粒构成的薄膜或者层厚在纳米量级的 单层或多层薄膜。纳米具有独特的光学、力学、电磁学特性,因而在重工业、轻 工业、军事、石化等领域表现出了广泛的应用前景。作为纳米薄膜的一种,有机 纳米薄膜经过几十年的发展,在生物、医药、光学器件等领域又展示了其独特的 应用潜力。纳米尺度有机薄膜的研究,涉及了微观领域分子自组装的探索,分子 间弱相互作用力的研究,生物大分子复合体及超分子体系聚合或装配动力学、结 构及其与功能相互关系的研究等。这些问题的成功解决为阐明生命活动的本质规 律提供途径,成为生命科学领域中急需解决的、重大基础性课题。 多糖纳米薄膜,作为一种新兴的有机纳米薄膜,它在生物医学巨大的应用潜 力,其制备过程和应用领域都值得我们去探索。纳米材料有着与常规材料不同的 性质。其薄膜厚度、粗糙度、弹性强度、硬度和表面摩擦力等特性成为常规技术 不能实现的。由于纳米材料表面是纳米级厚度和平整度,使得其性质的表征成为 了研究热点和难点。众多高精度的技术和仪器都用来研究纳米薄膜,比如小角度 散射、射线衍射、原子力显微镜和扫描电镜等。在众多先进仪器中,原子力显 微镜由于其在测量薄膜性能上表现的独特功能,被广大科研工作者所采用。 本文,我们用不同的方法制备出壳聚糖,黄原胶及其复合多糖纳米薄膜材料并利用 对其做了表征。壳聚糖和黄原胶作为两种多糖,其应用不仅涉及到医药、食 品、 化工、化妆品、水处理,而且已经广泛的应用于生物、医学等领域。由于它们具有较 好的生物功能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业 广泛关注。比如,壳聚糖聚糖被用于、基因以及心脏病药的载体。而黄原胶则 是一种很好的食品添加剂。如今,壳聚糖与黄原胶的复合物被认为是一种良好的药 物载体弥补了壳聚糖作为药物载体的缺陷,具有广阔的应用前景。在实验中,我们 制备了壳聚糖和黄原胶的纳米薄膜,以及其复合纳米薄膜材料,并对其力学特性做了 研究。主要完成工作如下: 、利用分子自组装方法制备黄原胶和壳聚糖薄膜材料,并利用观察黄原胶和 壳聚糖薄膜的特性,研究其自组装特性。在试验中,我们得到壳聚糖和黄原胶的多孔薄膜和致密薄膜。 、通过结合旋涂法和技术制备超薄壳聚糖生物薄膜,该方法的制备出的生物 薄膜同分子自组装法制备的壳聚糖薄膜相比,不但保证了壳聚糖薄膜材料的厚度为 左右,而结合旋涂法和技术制备的壳聚糖薄膜节省了制备薄膜的时间,同时也能 实时观察薄膜的变化情况。 、在前两步内容的基础上我们制备了壳聚糖.黄原胶复合薄膜材料并对其形成机理 做了探究。实验结果表明,带有正电性的壳聚糖溶液将带有负电性的黄原胶纤维解螺旋, 并形成新型的壳聚糖.黄原胶复合材料。 、利用皮牛级别分辨率的单分子力谱对多孔材料的力学性质的研究。实验中发现黄 原胶多孔薄膜材料的力谱是由复杂的力学指纹组成,其力学特性不同于单根纤维。通过 深入分析发现,复杂力谱是由三种基本力谱随机组合而成的。 关键词:有机纳米薄膜,多糖,黄原胶,壳聚糖,复合材料,原子力显微镜,单分子力 谱,多孔薄膜材料。., ,, . , , . , ,, , ., . , , ? . ., ., , , ,, , 。 . ?, , . ,, . ,, , ,, , . , ?.., ,, , , . , . . . : ., , , . . . .. .,, . . , . ,, . . . , . ?.:,, ,,,目录 摘要】...?.. 第一章绪论?一 .多糖纳米薄膜的用途及研究进展?.. ..多糖纳米薄膜的用途? ..多糖纳米薄膜的研究进展??. .多糖纳米薄膜的制备方法以及研究方法?一 ..多糖纳米薄膜的制备方法..多糖纳米薄膜的研究内容以及手段? .原子力显微镜在生命科学中的应用? ..原子力显微镜对生物分子形貌结构的研究中的应用. ..原子力显微镜在分子动力学特性方面的应用。 ..原子力显微镜在力学特性方面的应用. ..原子力显微镜在纳米科学研究的发展及展望. .论文的研究内容 .论文的研究意义??. 参考文献? 第二章实验材料与表征技术.. .实验设备.实验材料.原子力显微镜.. 工作原理. ..成像模式??.. ..影响成像的因素??.. ..单分子力谱和纳米压痕??.. 第三章多糖薄膜材料的制备及性质研究? .壳聚糖和黄原胶自组装薄膜材料的研究? ..壳聚糖分子白组装薄膜的研究??.. ..黄原胶分子自组装薄膜的研究??.. ..薄膜成膜机理的研究.. .结合旋涂法和技术制备壳聚糖超薄薄膜的研究?. ..制备方法概述一 ..实验条件 ..实验结果??.. 本章小结? 参考文献??.. 第四章壳聚糖一黄原胶复合材料的性质研究??.. .壳聚糖.黄原胶复合材料的制备方法概述? .壳聚糖.黄原胶复合材料的性质研究 .壳聚糖.黄原胶复合材料形成机理的研究? .本章小结??. 参考文献? 第五章黄原胶多子薄膜材料的力学性质研究??. .黄原胶多孑薄膜材料的液相研究?.. ..样品制备方法概述?.. ..实验设备 .黄原胶多空薄膜材料的单分子力谱的研究. ..实验前准备?。 ..实验结果 .本章小结??. 参考文献? 硕士期间完成和发表的论文。 致射. 第一章绪论 第一章绪论 .多糖纳米薄膜的用途及研究进展 ..多糖纳米薄膜的用途 多糖是生物大分子,在人体中扮演不同的角色,是人体组成的三大部分之一。 它可 以分为结构形式和储存贮存形式,贮存形式主要有淀粉和葡萄糖等,而结构 形式 主要指组成植物细胞主要结构的纤维素。不仅如此,多糖在在临床和生物医 学等领 域都有广泛的应用。在临床方面,多糖具有免疫调节、抗病毒、抗癌、降血糖、 乳化、培养骨细胞等特性,而在生物学方面,多糖不仅是构成植物或动物的骨架, 而起还可以作为机体润滑剂,识别外来组织细胞等特性?。近年来,多糖的研究范 围逐渐扩大,不仅在生物医学等方面,在工业、电子、化工等领域都有应用心。由 于多糖纳米薄膜在各个领域的应用范围提高,其研究也随之兴起。 多糖纳米薄膜是有机纳米薄膜,属于纳米薄膜的一部分。纳米薄膜是指由尺寸 为纳米数量级卜的镶嵌于基体所形成的薄膜材料,它兼具传统复合材 料和现代纳米材料二者的优越性。按照薄膜材料的组分可分为有机纳米薄膜和无 机纳米薄膜,有机纳米薄膜主要指的是高分子薄膜?。纳米薄膜可以改善一些机械 零部件的表面性能,以减少振动、降低噪声、减小摩擦、延长寿命。作为纳米薄 膜的一种,有机薄膜由于在化学、物理和生物传感器、微电子器件、非线性光学 和分子器件等领域中的广泛应用,已受到人们越来越多的关注。目前,科研人员 已从单一材料的纳米薄膜转向纳米复合薄膜的研究,薄膜的厚度也由数微米发展 到数纳米的超薄膜。 按照用途有机薄膜可以分为三个方向,光学薄膜,半导体器件以及生物医学方 面。光学薄膜方面,比如增透膜、增反膜等,随着应用范围的增加,对于多糖薄膜 性能要求也逐渐增加。制备较高耐热性和化学稳定性较差,较小的表面较粗糙度 的高品质有机薄膜成为显得尤为重要。而在生物医学方面,多糖在药物载体方面 的应用受到重视,由于很多多糖具有生物相容性和无毒性等特点,多糖在生物领 域的应用逐渐增多哺。由于各种药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损多糖纳米薄膜材料的研究 失,降低副作用,并且提高生物利用度,因而对它的研究越来越受到重视。为了 寻找合适的药物载体,人们对各种体系如微球、脂质体、微乳液等进行了研究。 高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构,可以进行自组装,形成各种形式的 聚集体,如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物 分子 的能力,同时又对膜有良好的渗透性,成为药物载体的重要研究领域。 ..多糖纳米薄膜的研究进展 多糖在自然界分布极广而且对生物来说非常重要。而且多糖与免疫功能的调 节、细胞与细胞的识别、细胞物质的运输、癌症的诊断与治疗等,都有着密切 的关系】。此外多糖还能控制细胞的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老。多糖在食 品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此,在多糖资源的开发、多糖结 构的分析、多糖药理作用等的研究方面,人们做了大量的工作。如今氨基多糖如壳聚 糖在动物体内的特殊功能已被深入地研究。由于壳聚糖独特的化学、物理化学、生物 特性己收受的高度重视。首先,它是一种可再生的资源可以从海洋甲壳类动物的壳真菌 中提取。此外,壳聚糖在组织工程中扮演着重要角色,比如,壳聚糖可以作为生物结构 材料临时更换皮肤和骨组织,人造血管和瓣膜,植入在化妆品,外科手术的组成部 分。有趣的是,动物色彩的多样性和壳聚糖薄膜的厚度有关系。不同的薄膜层数导致 不同的光学现象,如反射,折射和交替层薄膜干涉等。一个有说服力的例子是垂直衍射 光栅的厚度大概在几纳米厚。可以将厚度相同的光栅安排在一个交替层,在一个层厚度 减少的交错层,或者在一个随即厚度的叠加层。对于光学器件应用行业或特定材料的表 面涂层而言,能够制备较大面积,较小厚度的壳聚糖膜是至关重要的。此外,壳聚糖还 参与了许多光学现象,在活的有机体有可能使用壳聚糖薄膜的光学应用。然而由于壳聚 糖内在的粘弹性,均匀薄壳聚糖膜的制备是相当困难。壳聚糖膜的透明特性非吸收和 非散射需要薄膜的厚度为纳米级别。生物高分子壳聚糖在纳米功能材料,组织工程和 其他生物的应用中起着重要的作用。 .多糖纳米薄膜的制备方法以及研究方法 ..多糖纳米薄膜的制备方法 相比于无机纳米薄膜的制备方法来说,有机纳米薄膜的制备方法种类较少。如今,多糖纳米薄 第一章绪论 膜的制备方法大致可以归纳为三类:膜法,分子自组装法和旋涂法。 所以,发明新型的制备有机薄膜的方法是非常重要的。 膜技术 膜技术是指将制膜材料溶于有机溶剂后滴加到亚相常用去离子水和蒸馏水表 面进行扩展后压缩而成,针对制膜材料分子必须均匀铺展于亚相表面这一特性。如下图 所示,分子亲水基一端分布在水池表面,滑障将杂乱分布在水面的分子轻轻挤压并形成 致密的分子薄膜,当水池表面压达到预设值时将衬底提起,然后亲水基一侧吸附在衬底 表面,随着基底被缓慢拉起,薄膜吸附在衬底表面。 冒 膜原理不意图 图? 膜的优点很多:膜厚为纳米数量级,具有特殊的物理化学性质;可以制 可以人为选择 备单分子膜,也可以逐层累积形成多层膜,组装方式任意选择; 不同的高分子材料,累积不同的分子层,使之具有多种功酏;成膜可在常温常压下 膜技术在控制膜层厚 进行,所需能量小,基本不破坏成膜材料的高分子结构; 度及均匀性方面远比常规制膜技术优越;可有效地利用膜分子自身的组装能力, 形成对不同分子改性。然而,制备膜材料应该具有以下特点:分子中应该具备与 水有一定的亲和力的原子基团,如:?羧基;分子结构中存在一些疏水性的 基团,如:;分子的亲水和疏水性要均衡。 分子自组装法 自组装为系统之构成元素,如分子在不受人类外力之 介入下,自行聚集、组织成规则结构的现象,例如分子的结晶即是一种自组装现象。自 组装程序的发生通常会将系统从一个无序的状态转化成一个有序的状态,其可以发生在 不同的尺度。这些超分子单元间的作用力进而促使其在空间上做规则的排列如微胞排 列成体心立方之晶格,而使系统具有一种阶级性结构 。自组装普 遍存在于自然界中,如生物体的细胞即是由各种生物分子自组装而成;而运用各种分子的结构模拟分析,薄膜力学性能和机械性能的研究,分子自组装的研究。结构模拟涉及 到纳米领域的效应,比如量子效应等。而薄膜力学和机械性能的研究主要是针对薄膜在 为机械领域的应用。而分子自组装方面,通过研究分子自组装过程,来研究生物亲和力 或基团间的键合力;通过观察分子结构变化来观测器分子组装动力学,对分子自组装的 研究有着重要的作用。除此之外,现在很多研究人员将无机离子掺入有机薄膜,研究其 光学和电学特性。如今,针对以上有机纳米薄膜材料的特种特性,主要是利用小角度 散射仪器,.光谱,.拉曼光谱,.表面能,.顺磁共振光谱,.一衍射和 等来分析其各种特性。在众多仪器中,由于原子力显微镜的高分辨特性,它成为生物材 料表征手段中的佼佼者。例如,已经用来研究过黄原胶纤维状,网格状,环状结 第一章绪论 构等【】【】。更重要的是,原子力显微镜不仅是一个高分辨的表面表征工具,而且还是一 个力学测量工具。基于的单分子力谱技术已经成为探究单个分子力学指纹的重要 。自从首次被应用于解折叠肌动蛋白的研究中,众多科研人员已经利用 技术对】【 ,多糖‘,淀粉样蛋白【的力学特性做了探究,包括韧性, 粘性和弹性‘。。 .原子力显微镜在生命科学中的应用 自从年第一台光学显微镜问世以来,像细胞等肉眼无法直接观测的微观生物 可以清晰的展现在人类眼前。但随着人类对微观领域探索的深入,光学显微镜受到衍射 极限的限制已经无法满足人类的探索需求。随着电子显微镜的发明以及二十 世纪八十年 代,和发明了扫描隧道显微镜 ,以及 后来的原子力显微镜 ,的问世,使得人们对微观世界的认 识直接进入了原子级层次。在随后几十年的生命科学探索中,原子力显微镜展现了其广 泛的应用领域和独特的功能。它的出现不仅拓宽了显微镜在生命科学中的应用范围,而 且还对物质表面的微结构原子、分子级别信息,如成分、温度、硬度、表面电势和 电容绘图以及磁、电、粘着、摩擦等信息进行测量和分析,因而它们又被称为继光学显 微镜、电子显微镜后的第三代显微镜。如今,原子力显微镜已经在生命科学领域的得到 了广泛的应用【。原子力显微镜能够使得生物分子样品在接近生理环境的条件下直接进 行研究,这是其他的物理化学方法都无法办到的,通过控制扫描力的大小,不会引起样 品分子的漂移和损坏,图形的可操作性大大的提高。根据研究内容,原子力显微镜在生 命科学领域的应用主要分为三个方面:在脱氧核糖核酸分子研究中的应用,在蛋白质研 究中的应用,在多糖研究中的应用。然而,根据原子力显微镜在生物领域的研究方向, 可以分为三个方面:生物分子形貌结构,分子动力学以及生物分子力学性质的研究。 ..原子力显微镜对生物分子形貌结构的研究中的应用 由于原子力显微镜纳米级别的分辨率特征,它被广泛应用于观测纳米尺度的无机和 非常适合对表面较软生物样品 有机纳米材料表面形貌特征。并且的 工作模式下,原子力显微镜的探针针尖间歇性的与样品接 观测。在 触,其作用时间较短,减少了由于磨擦力引起的横向切向力,从而减少了对生物样品的 损伤。如今,原子力显微镜在蛋白质、多糖、等方面具有很广泛的研究。原子力多糖纳米薄膜材料的研究 显微镜首次应用于视紫红蛋白】的研究,发现视紫红蛋白在膜上成二维的六角形排列, 每个六角形为一个晶胞,晶胞间距为. ,相当于视紫红三聚体。此外,原子力显微 镜被用于研究胶原蛋白、免疫蛋白、肌动蛋白、蛋白聚合酶和巨球蛋白等等【‘】。观测 了蛋白分子形状的改变,蛋白质的微观内部构造瑚】以及蛋白质的表面特性 ‘等。 此外,自从等人首次用获得分子的图像以来,在的研究 方面的研究取得了很大进展,已经成为了研究分子的重要工具。同样,也使 得在近生理条件下观测各种分子的三维结构的图像成为可能,并且已经成功地获 得了的原子力显微镜的高分辨的图像,虽然,原子力显微镜还不能解决分 子的核苷酸的序列,但是通过原子力显微镜已经研究出了高级与蛋白质的复合物 【】,并且可以研究单个分子的长度、宽度和高度。等人【】在大气的环境 下获得了脱氧核糖核酸的可重复的图像。除此之外,还可以在液体环境下对 样品表面表征,得到较清楚的形貌结构。等人【】在液体环境下植物多糖角叉聚糖 和果胶的成像,发现了角叉聚糖和胶的交织相连的网状结构,发现 分子非常清晰的螺旋结构。 然而,在分析形貌观测方面,也具有其局限性。比如,对于核苷酸的研究, 无法探测核苷酸序列,不能分析样品的组成和结构。而形貌观测的范围和精确度 是制约形貌分析的要素,而且两者不能同时满足。 ..原子力显微镜在分子动力学特性方面的应用 由于生命科学领域中大部分生物分子需要相应的体液环境,离开液体环境就无法生 存,这一局限性使得大部分微观表征手段望成莫及。然而对于生命体而言, 其各种生命 特征随着时间和环境的不同不断地发生变化。这一特点又让众多技术手段无法触及。 在液相下有着原子级别的高分辨率。因此在生物医学领域有着极大的应用潜 力。由于可以再近人体环境下也可以实现纳米级别的分辨率,在很大程度上可以得到比电子显微镜更好的结果。对于而言,液相结合? 由此,液相 成为原子力显微镜在生命科学研究领域得以领先的另一大优势。 使得动力学特性的研究成为可能。再加上其液相成像技术模拟人体环境使得其在 生物领域起到重要作用。除此之外,原位的出现,使得研究人员观察生物分子动 力学特性成为可能。由于能在液体和近生理条件下获得高分辨的形貌图,因此在 蛋白的成像方面得到了广泛的应用,观察蛋白分子构象的变化,探索蛋白质的动力学过 第一章绪论 实时观察 程【 ,实时观测蛋白质的自组装过程【。。等人【用. 到了分子由组装成环状和棒状聚合体的动态过程,并观测了聚合体的运动 和结构的变化过程。然而,液相也存在其局限性。比如在液相下,生物样品都具 有较高的灵活性,很多分子都无法牢固的吸附在基地表面,所以,液相的操作对 基底的修饰显得极为重要。 ..原子力显微镜在力学特性方面的应用 对生物分子间特异性相互作用的研究是结构生物和分子生物领域的一个难题。这种 特异性相互作用力是由分子间很多微弱的非化学键相互作用组成的。如今,很多单分子 ,力夹 技术已经被用来研究这种特异性相互作用,比如光学镊子技术 ,磁性珠技术 ,玻璃纤维微针尖技术 ,生物膜力学探测技术,激光共焦点扫描显微镜 和近场光学 【。】等。 这些方法可以得到不同时间和空间分辨率的力学信号。而在众多单分子技术中,基于原 子力显微镜的单分子力谱技术在探究分子间,分子内相互作用力方面快速,易操作等优 点成为该领域的佼佼者。从力谱曲线中,我们可以得到大量的信息。比如单个氢 键相互作用的测量,不同分子间的共价键,以及,给体和受体之间相互作用的测 量等。等人利用修饰过的原子力显微镜的探针针尖把固定在金表面的单个双 螺旋结构的分子拉伸,通过多次的拉伸,统计处了分子的力曲线。在蛋白 质二级结构的单分子研究中,发现其单分子力谱为具有相同『白距和崩溃力大小的锯齿状 曲线。从该锯齿状力谱的间距和大小可以作为区分蛋白质种类的力学指纹【】。同样,在 多糖如黄原胶的单分子力谱实验中发现,超级分子的组成单元?单糖的形变成为多 糖纤维弹性的源泉【】。们。因此,对研究黄原胶网格结构的力学性质具有重要意 义。除此之外,利用基于原子力的单分子力谱技术可以探究分子的力学特性,如弹性, 粘性等。最重要的是单分子技术还是一个动态分析工具,在单分子操纵过程中,力谱不 仅体现分子的力学性质,还能反映出分子的内部结构,比如蛋白质折叠结构, 螺旋结构等。通过对淀粉样纤维.】和,肌动蛋白 ., ,的拉伸,发现了周期性的力学指纹。这一特点证实了规律的蛋白质折叠 结构和较高的弹性特点。在黄原胶的单分子研究中发现,糖环的形变是多糖纤维具有弹 性特征的根源。】发现螺旋结构的回转半径和其韧性促成了聚合物的力学特性。 多糖纳米薄膜材料的研究 ..原子力显微镜在纳米科学研究的发展及展望 自从第一台发明并观测了分子形貌之后,人们便期待它能够为测序并获 得原子分辨率。虽然以上的这些梦想尚未成为现实,然而由此却发展了一系列的扫描探 针显微镜。其中,作为的一员, 的发明使得在最初的物理学、材 料科学与工程领域的应用拓宽到生命科学领域。并且随着原子力显微镜的发展,其应用 范围已经取得了前所未有的成就。比如在细胞,细菌,蛋白质,,多糖等领域。然 而原子力显微镜自身也有缺陷,;女扫描范围较小,扫面速度较低,受样品粗糙度限制 较大等。原子力显微镜较高的分辨率和较小的扫描范围使其受到研究人员的青睐,然而 正是其优点却成为的限制条件。由于扫描范围较小,所以只能得到的样品 表面的局部信息。同样较高的分辨率需是以较慢的扫描速度为前提。一般情况下, 一幅图像需要几分钟得到,这对于观测化学反应过程来讲是个致命的限制条件。 所以对于现有的无法实时观测化学反应的变化过程。虽然目前一些公司,如布鲁克公司 具有快速扫描模式,其速度可达到每秒一幅图。可似乎 对于反映速度较快的化学反应还是无能为力。所以大范围,快速扫描时原子力显微镜的 站趋势。 此外,原子力显微镜除了上述改进之外还有一些可待提高的地方,比如,图像分辨 率。虽然,原子力显微镜具有纳米尺度的分辨率,可是真正要观测单个原子图像还是有 一定的难度。首先样品的粗糙度影响着图像的分辨率,对于表面起伏较大的样品 图像经常有拖拽现象;其次不同软硬程度的样品适合用不同的成像模式和不同弹性的探 针,较硬的无机样品表面适合接触模式,而对于较软的有机样品则适合在模式 下成像,选择弹性与样品接近的悬臂有利于得到质量较高的图像;然后,原子力 显微镜的针尖曲率半径直接制约着成像分辨率,如今,新的碳纳米管针尖碳纳米管的曲 率半径为..,如果将碳纳米管作为原子力显微镜针尖,这大大改变成像分辨率; 再加上复杂的扫描环境,如空气洁净度和液相稳定性等影响着成像质量,空气中如果有 较大的尘埃,或者液相环境不稳定会使得样品图像噪音较大。 由于原子力显微镜其高分辨率特性以及其他独有的功能特性,使得它在生命科学领 域已经显示出了很大的优势。虽然在探索过程中,原子力显微镜对生命科学 的贡献显而 易见,可是其不足之处任然制约着人类对自然探索的脚步。生命科学领域还存在着很多 领域没有被解释,但是原子力显微镜种种特点将会更加体现它的优势,它的不足之处也第一章绪论 将会随着科学发展逐渐消失,成为人类探索科学道路上的一项重要工具。它所具有的独 特的功能无疑将会在生物大分子领域内有很大的发展前途。 .论文的研究内容 黄原胶和壳聚糖已经被广泛的应用于医学,化工,生物学等领域,这两种多糖由于 其生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广 泛关注,在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工 程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。比如,黄原胶由于其易降解及束胶特性被当 做粘稠剂广泛应用于食品添加剂中,也因为其抗菌性被用做牙膏添加剂。而壳聚糖应用 于化妆品、絮凝剂等;食品保健方面主要应用于抗菌剂、抗氧化剂和保健食品添加剂等。 不仅如此,壳聚糖还被广泛的应用于医学领域。壳聚糖可以促进凝血和伤口 愈合、药 物的缓释基质、人造组织和器官和免疫调节活性等;而壳聚糖借助其在溶液中带正电性 则成为了主要的药物载体,包括、基因、心脏病药物等。然而作为药物载体,壳 聚糖有自己的局限性。由于壳聚糖侧链较短,在体内容易被酶降解,受值得影响也 很大。对于黄原胶而言,它不仅具有生物相容性而且还具有抗酶解特性和在和温度 变化范围较大的情况下保持较稳定的特性。这两种的糖的复合成为弥补壳聚糖作为药物 载体的缺陷。 鉴于黄原胶和壳聚糖其广泛的应用前景和其各自存在的缺点,我们将制备其复合材 料,背对其性质进一步研究,从而制备出性质互补的新型生物纳米材料。故而,在该项 研究中,我们主要开展的研究内容如下: .首先利用分子自组装原理制备黄原胶和壳聚糖薄膜材料,如多孔和均匀的薄膜 材料。并利用高分辨率来研究其薄膜厚度,覆盖率以及成膜特性等; .其次,我们发明了一种结合旋涂法和技术制备超薄壳聚糖薄膜材料方法, 结果表明,在保证其薄膜覆盖率的前提下,我们利用该方法可以很大程度上 节省薄膜制 备时间。 .在本实验中,我用观测了壳聚糖.黄原胶复合物形貌结构并研究了其 形成机理。我们发现当壳聚糖和黄原胶浓度比为:时,壳聚糖将黄原胶纤维解链成细 小纤维,然后壳聚糖和黄原胶纤维共组装形成了一种新型的网格状。该结果有力的证明 为正电离子可以解开负电性的纤维。实验还表明,不同的浓度对复合物的形成过程有着 多糖纳米薄膜材料的研究 很大的影响。 .在本实验中,我们分别利用 和探究了黄原胶网格的形貌结 构和力学性质。结果表明,黄原胶在气相也液相下都可以形成较稳定的网格结构。我们 技术分别对组成网格结构三类结构做了研究,发现了众多复杂的力学响应。通过 分析发现,这些复杂的力学响应是由三种基本的力谱组成。该结果对理解网格结构的性 质,以及其自组装性质有很大的意义。 .论文的研究意义 纳米薄膜的发展只有几十年的历史,然而有机纳米薄膜的发展则正处于起步 阶段。 其潜在的广阔的发展空间和潜在的应用价值成为我们对有机纳米薄膜研究的巨大动力。 作为有机薄膜的一种,对多糖薄膜的研究显得极少。本文中,我们利用对黄原胶 和壳聚糖纳米薄膜的研究。除了在工业和光学领域的应用,我们对壳聚糖和黄原胶的研 究主要集中在生物医学领域的探索,特别是药物载体的制备和研究。药物载体的发展直 接影响着能否有效的把药物传送到目的地并其达到治疗病症的目的。临床表明,很多药 物,如:多肽、抗体、疫苗、以及基因药物等,由于其本身的抗催化性或难以参与新陈 代谢而无法有效地传递到目标位置。而药物分子量大小和带电量是制约药物顺利释放的 两个关键因素。因此,研发新型的药物载体对克服此类问题方面有着极大的作用。 由黄原胶和壳聚糖组成的复合物由于其无毒性、生物相容性、相对较高的抗催化性 和稳定性已经成为优秀的药物载体的候选材料‘石。具有无毒性和生物可降解性的 聚电解质成为有效地药物载体。根据静电相互作用力的原理,将两个相反电 性的聚电解 质混合形成聚电解质复合材料,可以将药物有效地传递到靶向位置而不被酶催化。以往 的实验中发现,黄原胶和壳聚糖的浓度比影响药物的释放速率,提高脱乙酰去能够加快 药物从壳聚糖和黄原胶复合材料的囊腔中释放速度【。因此,研究黄原胶和壳聚糖复合 材料的形成过程和复合物的性质对提高药物利用率有着极大的作用。该项研究,不仅拓 展了对于黄原胶和壳聚糖的特性有了更深刻的理解,而且拓展了多糖薄膜的研究内容和 研究方法;再加上黄原胶.壳聚糖复合材料的成功制备,不仅为研究正负电性多糖材料 复合提供了途径而且还为药物载体材料的制备增加了方法。所以,该项研究将成为我们 继续探索多糖复合材料的基石。 第~章绪论 参考文献 【】韩风云.张华山.王伟平.董殿波美味牛肝菌产胞外多糖分批发酵的动力学模型研究.安徽农业科学, . 【】李静.连宾.胡鹏刚.细菌多糖及其在食品工业中的应用.食品科学, . . 】沈海军.穆先才.纳米薄膜的分类、特性、制备方法与应片.纳米材料与技 术, 【】杨定宇.蒋孟衡.杨军.有机薄膜发光器件的研究进展.半导体技术,. 【】梁宁.杨磊.李静.多糖研究进展.吉林农业,】. 【】李松.吴青华.陈畅.多糖抗肿瘤活性的最新研究进展.中国生化约物杂 志,. 【】唐星华.沈明才.壳聚糖及其衍生物应用研究进展.日用化学,:业,. 】欧阳健明膜原理及应用.暨南大学出版社. 【】邓穗平.蔡继业.磷脂自组装膜的原子力显微镜研究进展.生物医学:程学 杂志. 【】....,.. ..,,,,? 【】.;,.;.;,.;,. ,,. 【 ,, 】,.;,.; 【 】.,......., ,: . 【 】.;,.;,.;,..;,.. ,, . 【 ,, 】,..;..;,.. 【,..;,..;,;,.;,..;,..;, ..;,.. ,,.. ,, 】.;,.;,.;,... 【 】,..;.;,.;,..;,.;,.. ,, . 【 ,, 】,.;,.;,. 【】,..;,..;,. ,,. . ,, 】,.; . 【】,.;,.;,.;,.;,.;,.;,.;,.; ,. ,,. ,, 【】,..;,..;.;,..;,.;,.;,. . , 【】.;,;,.;,.;,. ,. . 【】..‘ ,..;,.. ,, 【】 .., ,,. 【】曾沽铭.曾耀英.蔡继业.原子力显微镜在生命科学中的应用.中国病理生 理杂志,多糖纳米薄膜材料的研究 , ,, 【 , ., . , . 【】 , , , ,, : , , 【】 , ,, .. , 【】 , ..,, , , 【】 .,, . , 【】 , ,, 【】...,..,....,,, 【】...,.....,,, 【】....,.,..,.,, 【】..,...,.,..,.... ,, 】..,.,.,.,, 【】...,...,, , 【】 , , ,, 【】..,..,..,..,,,,.,,. 【】 .. 【】.,... ,.,....,, 【.,.,.,.?,.. ., , , 【】..,...懈..,: 【】.,.?,.?,....., : 【】.,,..,....,....... ,,: . , , 【 ? ,,,~ 仃 .. 【】 , , , .?,, ,~ .凡 , 【】 , . ,,,~ . . , , , 【 】? ,,,~ . 【 . ,,~ , ..【,,, 、 第一章绪论 . ?. 【】,, , .【 ,. ,,,. 【 只 ,, ,~ . 【】.,..,..。,,, . , , 【..;,.. 【】,.;.;,.;,.. , , . 【】.;.;?,.;,.;.;?芒,.;佗芒, . . 【】’ ..’’ ’ , , .【】 . , .... .【,.,., ., , ., 【,..,., . ,.,. . , ., 【, ., .,. . .. ?【, ,. ., ?. 第二章实验材料与表征技术 第二章实验材料与表征技术 本实验主要研究多糖薄膜的制备,形貌表征和力学测量,主要研究手段是原 子力显 微镜。本章主要对原子力显微镜的工作原理,成像模式,气.固/液固界面扫描 以及单分 子力谱做深入介绍。 .实验设备 原子力显微镜:俄罗斯公司,型号 。所配用针尖为美国 。 公司制造,弹性系数 /,针尖曲率半径 。针尖为公司制造,弹性系数 /, 美国公司,型号 。 针尖曲率半径 超纯水机:雷磁上海精密科学仪器公司 电子天平:系列上海恒平科学仪器有限公司 干燥箱:型电热鼓风干燥箱,北京市光明医疗仪器厂 .实验材料 , % 壳聚糖购自,分子量 黄原胶购自 .公司,分子式 异丙醇购自百灵威 ,分子式,纯度.% .原子力显微镜 .. 工作原理 原子力显微镜 ,是等人在的基础上于 年发明的。原子力显微镜是一种高分辨的近场扫描探针显微镜,它是一种高速拍摄 三维图像的显微镜,通常包括探针、电子控制系统、计算器处理系统及光电检测系统四 个子系统如图所示。作为高分辨扫描探针显微镜的一种,主要利用原子之间的相互作用力范德华力 来实现样品的形貌特征的测量。 丐多糖纳米薄膜材料的研究 具体来说,将一个一端有一微小的针尖的悬臂固定,该悬臂对微弱力极敏感,当针尖与 样品表面轻轻接触时,针尖尖端原子与样品表面原子问存在极微弱的相互作用力。扫描 过程中,通过在扫描时保持这种相互作用力的值不变,带有针尖的微悬臂将对应于针尖 与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动。在此过程中, 可通过光电探测器对悬臂的弯曲变化实时监控,从而将该信号反馈给控制器,从而调节 针尖与样品之间的距离,最终,来获得样品表面形貌的信息。 蒌.爪。夕凳 粪::/桊 器 \ / 怂姜 ?幽丛 罗\? :三 针尖原二 :川, 黪黪黪鳓 ?澎妫潦黪黪彩黪孽 ?.“?麒’ 图?原子力显微镜原理示意图 原子力显微镜的作用范围以针尖与样品的距离为界限,其距离为..范围内。 如下图作用势所示,针尖可以工作吸引力和排斥力区域范围内,但是不同的作用 力范围其成像效果以及作用对象不同。当针尖和样品之间的距离较远时,其悬臂处于自 由振动状态,当针尖和样品的距离处在吸引力区域范围内时,悬臂的振动受到外力的约 束。当针尖和样品的作用力处于排斥力区域时,其相互作用力较大,该区域适合无机材 料的表征,可以得到较高分辨率的图像。而对于较软的有机材料或生物样品较大的作用 力可能会导致样品受损。所以对于生物样品的表征,我们经常采用间歇性接触模式,该 模式下既可以保证较高的分辨率,又可以保证生物样品的完整性。 第二章实验材料‘ 表征技术 自’下,幺职 排斥/×.域 ’‘‘。。。’’。。?’。‘。。’‘。? 趴离? /, /非接触模了? 吸?×域 / 广 振动 没槲勺.作用 图针尖和样品的作用势区域 ..成像模式 接触模式 接触模式下,针尖的与样品轻微接触,起相互作用力大小大概为.? 范围。由于接触模式下样品与针尖间的距离很小,所以悬臂的弹性模量相对 较小 大概为../。接触模式下可以分为恒高模式和恒力模式,在恒高模式下,扫描 头的高度保持固定。对于较硬的样品表面而言,其悬臂差值信号的变化体现 了样品形貌 的变化情况,从而以图像的形式表现出来,即使在扫描过程中没有得到较清 晰的形貌信 息。恒高模式下针尖对样品施加的作用力以及悬臂的变化量都非常小,所以经常用于对 极为平整的原子表面成像,具有原子分辨率。同样地,当扫面速度很高时,恒高模式可 用来观测实时变化的样品表面。对于恒力模式而言,悬臂的偏折的差值信号作为反馈电 路的输入信号,在经过信号放大系统后直接用来控制压电陶瓷方向的变化。所以反馈 信号的变化直接反映了样品表面形貌的变化。所以,对于恒力模式,在扫描过程中保持 悬臂的偏折不变相当于给样品表面施加了一个恒定的力。而反馈电路的输出信号正好放 映了样品的形貌特征。相对于恒高模式来讲,恒力模式更容易为研究人员接受,因为恒 决定了扫 力模式可以用于表征粗糙度较大的样品。在扫描过程中,反馈信号的响应 面速度。尽管如此,由于压电陶瓷的反馈电路本身会产生噪音,所以恒力模式的分辨率 还是低于恒高模式。 轻巧模式 对于而言,间歇性接触模式主要是指模式。在模式下,扫描头给悬臂 多糖纳米薄膜材料的研究 施加一个共振频率或接近改值的驱动信号,其振动轨迹类似于正弦信号。针尖在样品表 面振动过程中,其动轨迹受到包括长程吸引力和短程排斥力作用势的影响如图所示。 对于恒高和恒力模式而言,其电路的反馈系统是相同的。光电探测器探测到的悬臂差值 信号为反馈回路的输入信号,而输出信号则是悬臂的变化值。在扫描过程中,针尖和样 品间的复杂作用力影响了悬臂的振幅,相位,以及频率。因此,通过改变作用力的大小 可以同时改变振幅,相位和共振频率。相位和振幅图像主要反映了样品的物理性质,所 以在改变相互作用力大小的时候,其变化不会像形貌那样变化明显。比如说,一个样品 的形貌图的好坏程度比起振幅和相位图来说更容易区分。针尖与样品间的作用力直接由 压电陶瓷的方向决定,因此在扫描过程中侧向力对扫描过程的影响是很小的。这也成 为用来扫描较软的样品成为可能。模式下,反馈系统是用来将悬臂的振幅保 持在设定值,而在扫描过程中,实际振幅和预先设定值是不可能完全一致的,该差值是 反馈系统的输入信号,称为“差频信号”。悬臂振幅的变化值也会想样品形貌 图一样由一 条一条扫面线组成,最终成为体现该样品结构的图。模式既可以在间歇接触 区域工作吸引力也可以在非接触模式区域工作排斥力。在间歇性接触模式下,针 尖振动的最低端正好能够轻微地接触样品表面,也正是因为接触的时候样品对针尖由相 互作用力的影响,其振幅也会因此而改变。 .影响成像的因素 影响成像质量的因素很多,主要可以分为以下几点: 环境因素。包括温度,湿度,空气中杂质的含量及大小等。不同的是温度和湿度直 接影响着样品表面的水膜厚度,而在扫描过程中,由于毛细现象水膜对针尖影响很 大。 针尖的选择。不同模式,不同的样品都对应着选择不同的针尖。液相和接触模式下 一般用较软的针尖,而气相模式下,一般用较硬的针尖。对于硬度比较大的 样品来说,选择弹性系数较高的针尖比较合适,而对于脚软的样品来说,使用弹性 系数较低的针尖能够减小对样品的损伤。 样品的粗糙度。样品的粗糙度直接影响到成像的质量。由于扫描范围较小,纵 向分辨率较小,所以对于颗粒较大的样品来说容易对针尖造成损伤,如果扫描速度 过快可能会造成压电陶瓷没来得及变化从而使得针尖与样品相撞。 样品的湿度。对于气相来说,干燥的样品表面对成像质量起到举足轻重的作用。 第二章实验材料与表征技术 、 皇 皇 . 幻一一专 艺凸 图.单分子力谱原理图,分别是进针曲线和退针曲线。如图中所示,?.?为进针过程,? 针尖接近样品,?针尖接触样品表面,?针尖压进样品,?悬臂弯曲到 达设定值:?.?为退针过程,该过程中,分子吸附在样品针尖上,然后慢慢被拉起远离基底,最 终无法承受拉力从针尖或者基底断开。 力学特性的测量是在针尖接近.接触一离开的过程中图.,包括纳米压痕 和单分子力谱两种技术。如图所示,针尖首先向样品方向 靠近,随着距离的减小针尖受到的吸引力增加,悬臂逐渐弯向样品;随着针尖靠近样品 受到排斥力增强,悬臂慢慢恢复平衡状态。当继续接近样品表面排斥力占主 要部分,悬 臂向相反的方向弯曲,当悬臂弯蓝到达预定值时,针尖远离样品和进针相反的动作。然 而就在进针和退针过程中悬臂的形变可以体现出样品的力学特性。 纳米压痕主要来自于进针环节,针尖向靠近样品,然后针尖接触样品到样品 变形如图?中标记和。这个过程中悬臂的弯曲程度反应了样品的弹性强度, 不同的材料对悬臂的反馈不同,质地较硬的材料比质地软的样品在同样进针距离中形变 大。退针过程恰好和进针过程相反,当针尖离开样品时由于针尖和分子间的非特异性相 互作用使得分子吸附在针尖上,从而在退针过程中被拉起,然而分子被拉起的过程也是 多糖纳米薄膜材料的研究 分子被解折叠的过程。在该过程中,外力克服分子间的相互作用力,或者分子与基地间 作用力,悬臂的形变变化反映了分子从基地被拉起和被解折叠过程,并以力学指纹 的形式下来图。 力谱分析方法 如今,主要有三种模型用于对于单分子力谱的分析,包括:. 模型、 模型以及模型。前两者主要用于分析单分子力谱, 模型主要用于分析纳米压痕的力谱。在我们试验中,主要利用模型来分析我 们的数据,其如所示: ,:生三 上 一 其中,伸直长度指被针尖拉起的分子的长度,而韧性指多聚物的自由度,是 指这是定义聚合物链长度方向的衰减相关函数。第三章多糖薄膜材料的制备及性质研究 第三章多糖薄膜材料的制备及性质研究 .壳聚糖和黄原胶自组装薄膜材料的研究 作为生物聚合物三大类之一的多糖在人体中扮演着重要角色,其纳米薄膜在生物医 学领域的应用逐渐得到重视【卜。纳米薄膜是指其组成单元为纳米尺寸或者薄膜厚度在 纳米尺寸的薄膜。按薄膜的构成与致密程度,可分为颗粒膜和致密膜。颗粒膜是纳米颗 粒粘在一起形成的膜,颗粒问有极小的缝隙,而致密膜则是连续膜】。在该实验中,我 们制备了壳聚糖颗粒薄膜和致密膜,以及黄原胶多孔薄膜和致密薄膜。本章,我们主要 研究了壳聚糖颗粒薄膜和致密薄膜,黄原胶的致密薄膜成膜特性,以及薄膜的性质。 ..壳聚糖分子自组装薄膜的研究 带有氨基的多糖由于其成膜特性受到研究人员的重视。。壳聚糖是甲壳素. 脱 乙酰基的产物。一般而言,甲壳素的一乙酰基脱去%以上的称之为壳聚糖。 其化学式为一...氨基..脱氧..葡萄糖,结构式如下图。脱乙酰基程度. 决定了大分子链上胺基含量的多少,而.的值直接影响着壳聚糖的性质】。 而壳聚糖被认为是一种良好的药物载体,具有广阔的应用前景【】。按薄膜的 构成 与致密程度,可分为颗粒膜和致密膜。颗粒膜是纳米颗粒粘在一起形成的膜, 颗粒 间可以有极小的缝隙,而致密膜则是连续膜。 图:壳聚糖分子结构式 壳聚糖薄膜材料的制备方法概述 ,脱乙酰度为%。 壳聚糖粉末购于,,分子量为 多糖纳米薄膜材料的研究 试验中制备多孔薄膜材料的步骤:首先,称取壳聚糖粉末加至,%的乙酸 中,室温磁力搅拌小时配成‖壳聚糖原溶液,将原溶液保存于?冰箱中保存。 然后,从冰箱中取出原溶液,经过三次稀释过程,将 的原溶液稀释至./的稀 溶液,在室温下静置后使用。 对于样品的制备而言,首先选择样品基底。由于云母表面的亲水性并且容易 ,.为基底;然后,将选择适宜大小的云母片, 解离,在我们试验中选择云母 用双面胶将其解离,得到干净的云母表面;最后,吸取培养好的壳聚糖稀溶液, 用移液器滴加到解离的云母表面。待水溶液自然挥发.分钟或者用氮气吹干,得到 颗粒壳聚糖薄膜。致密壳聚糖薄膜的制备方法与颗粒薄膜的方法类似,唯一不同是致密 壳聚糖薄膜需要.壳聚糖稀溶液在室温下培养三周时间来达到组装成膜的目的。 壳聚糖薄膜厚度及覆盖率的表征 妻,卜。。坩 阜??,???????广??’????,?????? 图?壳聚糖颗粒薄膜的.,放大区域..岬,:为其横截面高度图。 图所示,该图为壳聚糖颗粒薄膜,从图中可以看出壳聚糖颗粒薄膜形成了一 层均匀的薄膜,左下角为其放大效果,可以看出组成薄膜的单元为微小的壳聚糖颗粒, 这些颗粒均匀的排列。从右下图的缺陷横截面可以看出,该颗粒薄膜的厚度在纳米。 我们通过直接滴加的方法得到了均匀的壳聚糖颗粒薄膜,其覆盖率在.%。该颗粒 薄膜是在./壳聚糖溶液配制好后个小时的形貌结构。并且,该溶液在培 养的数天之内其形貌结构没有明显变化。当样品培养时间达到十天左右时, 起形貌结构第三章多糖薄膜材料的制备及性质研究 有所改变。颗粒间的缝隙不在那么明显,取而代之的是片状的薄膜。如图所示, 该图为壳聚糖在室温下培养两周时的图像。 从图可以看出,我们得到了致密的壳聚糖薄膜,该薄膜和颗粒状薄膜相 比缺陷明显增加,而无法分辨其颗粒状的组成单元。图横截面图可以看到薄膜的 起伏没有颗粒薄膜明显。同样,相比上图而言其覆盖率明显减小。这说明颗粒间的相互 作用力使得颗粒间的间隙减小,从而形成致密壳聚糖薄膜,从横截面图.可以看出, 壳聚糖致密薄膜的厚度也为,可以证明,壳聚糖单层薄膜的厚度为。经过大量 的数据统计我们得到了经过两个周室温培养的壳聚糖致密薄膜的覆盖率为%.%。 图?壳聚糖致密薄膜的?图像,:为其横截面高度图。:为左图的高度分 布图。 ..黄原胶分子自组装薄膜的研究 黄原胶 ,又称黄胶、汉生胶,是一种自然多糖,也是一种重要的生 物高聚物。它是以碳水化合物为主要原料、由黄单胞菌属 微生物经好氧发酵生物工程技术产生的一种高粘度水溶性的胞外多糖【 。黄原胶易 溶于水,