蛋白酶K的配制

蛋白酶k 蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,用于生物样品中蛋白质的一般降解。从林伯氏白色念球菌(t ritirac hium al bum lim ber)中纯化得到。该酶有两个ca2+结合位点,它们离酶的活性中心有一定距离,与催化机理并无直接关系。然而,如果从该酶中除去ca2+,由于出现远程的结构变化,催化活性将丧失80%左右,但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以,蛋白酶k消化过程中通常加入edta(以抑制依赖于mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白,如角蛋白一类,则可能需要使用含有1mm ol/l c a2+而不含edta的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EGTA(ph8.0)至终浓度为2m mol/l,以鳌合c a2+。 蛋白酶K,是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RN A酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定,还具有降解天然蛋白质的能力,因而它应用很广泛,包括制备脉冲电泳的染色体DNA,蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/m l。在较广的pH范围内(pH4-12.5)均有活性。 推荐反应缓冲液:50m M Tris-HC l (pH7.5),10m M C aCl2 。 值得注意的是,蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核的消失,从而影响杂交结果.ED TA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问,并能达到理想的染色效果. 保存:保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融,有效保证12月 孵育温度为55至65℃,理想孵育温度为58℃,孵育时间为15分钟至48小时;理想孵育时间为2小时