紫玉盘有效部位化学成分及体外抗肿瘤作用研究

紫玉盘有效部位化学成分及体外抗肿瘤作用研究 学校代码:10600 学 号:2005224广 西 中 医 学 院 硕 士 学 位 论 文紫玉盘有效部位化学成分及体外 抗肿瘤作用研究 研 究 生: 苏 醒 导师: 卢汝梅 副教授 院系(部所): 药学院 专业: 中药学 研究方向: 中药及其制剂质量与成分研究 完成日期: 2008年 5月 18日 目 录 中文摘要?????????????????????????????????????????????????????1 英文摘要?????????????????????????????????????????????????????3 引 言?????????????????????????????????????????????????????5 正 文?????????????????????????????????????????????????????7 第一部分 紫玉盘化学成分的预试验、提取及分离????????????????? 7 1.1 原料药材、仪器及试剂??????????????????????????????????????7 1.1.1 原料药材及鉴定??????????????????????????????????????????7 1.1.2 实验仪器????????????????????????????????????????????????7 1.1.3 试剂????????????????????????????????????????????????????7 1.2 化学成分预试实验?????????????????????????????????????????8 1.2.1 水提取液????????????????????????????????????????????????8 1.2.2 乙醇提取液??????????????????????????????????????????????8 1.2.3 石油醚提取液???????????????????????????????????????????10 1.2.4 预试小结??????????????????????????????????????????????10 1.3 紫玉盘化学成分的提取分离和结构鉴定??????????????????????10 1.3.1 提取与分离????????????????????????????????????????????10 1.3.2 紫玉盘提取与分离流程图????????????????????????????????12 1.4 单体化合物的结构鉴定????????????????????????????????????13 1.4.1 化合物I的结构鉴定??????????????????????????????????????13 1.4.2 化合物II的结构鉴定?????????????????????????????????????18 1.4.3 化合物III的结构鉴定????????????????????????????????????24 1.4.4 化合物IX的结构鉴定????????????????????????????????????24 1.4.5 化合物IV的结构鉴定????????????????????????????????????25 1.4.6 化合物V的结构鉴定?????????????????????????????????????28 1.4.7 化合物VI的结构鉴定????????????????????????????????????34 1.4.8 化合物VII的结构鉴定????????????????????????????????????37 1.4.9 化合物VIII的结构鉴定???????????????????????????????????42 1.5 小结????????????????????????????????????????????????????47 第二部分 紫玉盘提取物体外抗肿瘤试验??????????????????????49 2.1 材料????????????????????????????????????????????????????49 2.1.1 紫玉盘提取物??????????????????????????????????????????49 2.1.2 肿瘤细胞株????????????????????????????????????????????49 2.1.3 试剂??????????????????????????????????????????????????49 2.1.4 实验仪器??????????????????????????????????????????????49 2.2 实验????????????????????????????????????????????????49 2.2.1 MTT法?????????????????????????????????????????????????49 2.2.1.1 MTT法实验的原理?????????????????????????????????????49 2.2.1.2 MTT法测定???????????????????????????????????????????50 2.2.1.3药物对肿瘤细胞生长的抑制率的计算方法?????????????????50 2.3 统计学方法计算??????????????????????????????????????????50 2.4 实验结果????????????????????????????????????????????????50 2.4.1紫玉盘提取物的体外抗肿瘤作用研究????????????????????????50 2.4.1.1 紫玉盘总提取物的抑制作用??????????????????????????51 2.4.1.2 紫玉盘石油醚提取物的抑制作用????????????????????????52 2.4.1.3 紫玉盘氯仿提取物的抑制作用???????????????????????????53 2.4.1.4 紫玉盘乙酸乙酯提取物的抑制作用??????????????????????54 2.4.1.5 紫玉盘正丁醇提取物的抑制作用????????????????????????55 2.4.1.6 紫玉盘95%乙醇提取物的抑制作用???????????????????????56 2.5 小结???????????????????????????????????????????????????57 第三部分 结果与讨论????????????????????????????????????58 参考文献??????????????????????????????????????????????????60综 述??????????????????????????????????????????????????62 致谢??????????????????????????????????????????????????76 攻读学位期间发的学术论文???????????????????????77 作者声明??????????????????????????????????????????????????78 个人简历??????????????????????????????????????????????????79中 文 摘 要 目 的: 以广西特色药材紫玉盘Uvaria microcarpa Champ.ex Benth 为研究对象,通过体外抗肿瘤实验研究,筛选出其抗肿瘤作用的有效部 位,并对有效部位的化学成分进行系统研究,旨在揭示紫玉盘抗肿瘤作 用的药效物质基础,为广西产紫玉盘的开发利用提供科学依据。 方 法: 紫玉盘的茎用乙醇渗漉法提取得到乙醇总提取物,用系统 溶剂分离法分得其极性不同的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、 正丁醇部位和95%乙醇部位;采用MTT法测定紫玉盘乙醇总提取物及各 部位对宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、人肝癌细胞株7404 的活性,初步筛选出体外抗肿瘤的活性部位;采用硅胶色谱法、葡聚糖 凝胶色谱、重结晶法等现代分离方法和技术对活性部位的化学成分进行 1 分离和纯化,对分得的单体化合物利用理化检验、UV、IR、 H-NMR、 13 C-NMR等方法进行结构鉴定。 结 果: 紫玉盘乙醇总提取物及各部位在体外对宫颈癌细胞株 Hela、 人胃癌细胞株 SGC7901、人肝癌细胞株 7404生长具有明显抑制作用,尤 其氯仿部位的肿瘤抑制作用最强。分别对石油醚部位和氯仿-乙酸乙酯部 位进行分离,从中共分离得到 12个单体化合物,鉴定了 9个化合物的结 构,分别是:β-谷甾醇棕榈酸酯β-sitosterol palmitate I、绿玉树萜 烯醇euphorginol II、β-谷甾醇β-sitosterol III、苯甲酸benzoic acid IV、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷stigmasterol-3-O-β -D-glucopyranoside V、蒲公英赛醇(taraxerol VI)、大黄素emodin VII、马兜铃内酰胺 A?aristololactamA? VIII、β-胡萝卜苷β-daucosterol IX。 结论: 本课题研究表明紫玉盘乙醇总提取物及各部位有明显的体 外抗肿瘤作用;确定了紫玉盘的抗肿瘤作用的药用价值。并从其石油醚 部位和氯仿-乙酸乙酯部位中共分离了 12个化合物,鉴定了其中 9个化 合物的结构,其中β-谷甾醇棕榈酸酯I、绿玉树萜烯醇II、豆甾醇-3-O- β-D-葡萄糖苷V、大黄素VII为首次从该植物分离得到,这为揭示紫玉 1 盘抗肿瘤作用的药效物质基础提供了一定的科学依据。 关键词:紫玉盘;化学成分;抗肿瘤作用;有效部位;绿玉树萜烯醇 2 Studies on chemical constituents and anti-tumor effect in vitro from Uvaria microcarpa Champ. ex Benth ABSTRACT Objective: Study on the extracts from Uvaria microcarpa Champ.ex Benth of GuangXi’s herbal medicine. To find the effective anti-tumor extracts in vitro. To separate and analyze chemical constituents of the effective Anti-tumor extracts from the plant, for the sake of finding out the basic relationship between construction and effect of anti-cancer composition. The paper also shows the scientific foundation in searching for new drug for anti-cancer and makes good use of GuangXi’s herbal resource sufficientlyMethods:The all alcoholic extracts obtained from the stems of Uvaria microcarpa Champ.ex Benth was divided into five portions with systematic solution: petroleum ether extract,chloroform extract, ethyl acetate extract, n-Butyl alcohel extract and 95% alcoholic extract. Anti-tumor experiment in vitro was done by MTT assay to different extracts on human uterine carcinoma Hela,human gastric adenocarcinoma SGC7901, Human hepatoma 7404. Effective parts were seperated and purified by chromatographic methods. Pury compounds were identified by determining melting point, UV, 1 13 IR, H-NMR, C-NMR, etalResults:The all alcoholic extract and five portions had the obvious effect on inhibiting the growth of tumor cells in vitro. The extracts of petroleum ether and chloroform-ethyl acetate were separatedTwelve compounds were separated and nine compounds were identified from those three extractsNine compounds were β-sitosterol palmitate,euphorginol, β-sitosterol, benzoic acid, stigmasterol-3-O-β-D- glucopy ranoside, emodin, taraxerol,3 ristololactamA?, β-daucosterolConclusion: The research showed the all alcoholic extract and five portions from Uvaria microcarpa Champ.ex Benth had anti-tumor extracts in vitro. Specially, chloroform extract is the best of effection on inhibiting the growth of tumor cells in vitro in all extracts. It proved the officinal value of Uvaria microcarpa Champ.ex Benth.β-sitosterol palmitate, euphorginol, emodin and tigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside were the first time obtained from Uvaria microcarpa Champ. ex Benth. All the results of experiment can provided evidence to show the basic relationship between construction and effect of anti-cancer composition Key words: Uvaria microcarpa Champ.ex Benth; chemical constituents; anti-tumor effect; effective extract; euphorginol 4 引 言 肿瘤是危害全人类健康的重大疾病,目前尚无特效的根治药物和方 法,抗肿瘤化学药物存在筛选率低、研发费用昂贵、毒副作用大等问题。 从中草药中筛选活性成分或先导化合物用于抗肿瘤新药的开发,是当今 世界公认的筛选率高、风险低、成本低、周期短的抗肿瘤新药开发途径, 世界各国均很重视从直接天然产物或以天然产物为先导化合物通过结构 修饰得到的活性成分中开发抗肿瘤药物,并已成功开发出紫杉醇、喜树 碱等有良好抗癌活性的药物,这表明中草药抗肿瘤药物的研发具有巨大 的潜力和良好的前景。 广西特色药材紫玉盘Uvaria microcarpa Champ.ex Benth是番荔枝 科紫玉盘属植物,该属植物多数具有明显的抗肿瘤活性,国内外文献报 道从该属的十多种植物中分得的抗肿瘤有效成分主要包括番荔枝内酯类 和多氧取代环已烯类化合物,番荔枝内酯类对多种肿瘤细胞有强烈的抑 制作用,没有致突变作用,且对多药耐药性肿瘤细胞有显著的杀伤作用, 是目前报道中体内外抗癌活性最强的化合物之一。大多数番荔枝内酯类 化合物对肿瘤细胞普遍具有强大的细胞毒作用,同时还具有对不同肿瘤 细胞株的毒性选择性,并不是“广泛细胞的毒剂”且无多药耐药性,是 很有潜力的抗肿瘤活性成分,具有良好的开发应用前景。但目前对广西 产紫玉盘的化学成分和药理作用的研究报道甚少,为了弄清紫玉盘抗肿 瘤作用的药效物质基础寻找抗肿瘤的活性成分,很有必要对其的有效成 分和药理作用进行系统深入的研究。 紫玉盘分布于我国广西、广东、台湾,药用全株,具有祛风除湿、 行气健胃、止痛、化痰止咳之功效,广西民间用其根来治疗风湿痛、跌 [1,2] 打损伤和腰腿痛等症,其叶用于止痛消肿 。近十多年来的研究表明, 与紫玉盘同属的多种植物有显著的抗肿瘤作用,但关于紫玉盘的研究报 道很少,文献仅报道从其种子中分得几个番荔枝内酯类和生物碱类成分 [3,4] ,对作为药材的主要药用部位的茎和根的化学成分和药理作用研究很5 少 报道,目前开发成功的制剂仅有“复方感冒颗粒剂”,用于治疗流行性 和病毒性感冒有良好的疗效,尚没有开发作为抗肿瘤的药物使用。 [5] 据文献报道从紫玉盘属植物光叶紫玉盘U.boniana 、大花紫玉盘 [6-8] [9] U.grandiflora 、大叶紫玉盘U.macrophylla 等中分得的主要成分 有:番荔枝内酯类,如紫玉盘素、大花紫玉盘素、大花紫玉盘脂素等; 多氧取代环已烯类,如大花紫玉盘酮A~D,光叶紫玉盘醇A~G等;此 外还有黄酮、生物碱、萜类等成分。 番荔枝内酯类是一类有35~37个碳原子的长链脂肪酸的衍生物,均 含有一个末端α,β-不饱和γ-内酯环和0~3个四氢呋喃环,该类成分 大多数对肿瘤细胞有强大的细胞毒作用,特别是对结肠癌、白血病、鼻 咽癌、乳腺癌细胞有显著的抑制作用,是目前报道的体内外抗癌活性最 强的化合物之一。其作用机理独特,系作用于细胞线粒体,干扰能量代 谢,对能量代谢旺盛的瘤株有一定的选择性,且不是广泛细胞的毒剂, 研究表明该类化合物的Ames试验阴性,说明它没有致突变作用,对多药 耐药性肿瘤细胞有显著的杀伤作用,是一类很有潜力的抗肿瘤活性成分, [10,11] 在国际上得到广泛的重视,成为继紫杉醇之后的又一研究热点 。 多氧取代环已烯类是紫玉盘属的特有成分,对多药耐药性肿瘤细胞 有显著的杀伤作用,其杀伤力度与对敏感肿瘤细胞相同,构效关系研究 表明其烯酮型衍生物和半合成衍生物对乳腺癌、鳞状细胞癌有强烈的抑 [12,13] 制作用 。番荔枝内酯类和多氧取代环已烯类是很有研究开发价值的抗 肿瘤活性成分,但目前还没有开发成为抗肿瘤的新药上市。寻找更多活 性更强、毒性更低的类似成分,通过深入的研究,开发成抗肿瘤新药, 是当前研究的重点方向。 紫玉盘在广西南宁、崇左、百色等地资源丰富,我们研究发现紫玉 盘的乙醇提取物有抗肿瘤作用,因此很有必要对紫玉盘抗肿瘤有效成分进 行系统深入的研究,以便揭示紫玉盘抗肿瘤作用的药效物质基础和寻找新 型抗肿瘤活性化合物,为广西特色药用植物的开发利用提供理论依据。6 正 文 第一部分 紫玉盘化学成分的预试验、提取及分离 1.1 原料药材、仪器及试剂 1.1.1 原料药材及鉴定 紫玉盘采于广西南宁地区,经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为番 荔枝科紫玉盘属植物紫玉盘 Uvaria microcarpa Champ.ex Benth。标本存 于广西中医学院中药化学教研室。 1.1.2 实验仪器 显微熔点测定仪 XT4-100A(控温型),北京科仪电光仪器厂 UV Agilent8453紫外-可见分光光度仪(波长范围:200~800nm, 分辨率:0.1nm),美国安捷伦公司 IR NEXUS470 型(FT-IR)傅立叶红外分光光度计,(分辨率:优 于 0.2cm-1;波数范围:7500~370),美国尼高力仪器公司 MS Finnigan Trace DSQ 四极杆质谱仪 1 13 NMR 瑞士 Bruker Dre-500MHz(仪器频率: H500.00, C125.7, 1 13 探头:Dual);瑞士 Bruker AV-400MHz(仪器频率: H400.13, C100.62, 探头:QNP) 旋转蒸发仪RE-52AA旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂 电子分析天平 METTLER-AE100电子分析天平,瑞士 METTLER 公司 真空泵 SHB-? 循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司 层析柱 各种不同规格口径的普通玻璃柱 1.1.3 试剂 柱层析硅胶(100~200目):青岛海洋化工厂生产 柱层析硅胶(300~400目):青岛海洋化工厂生产 薄层层析硅胶(硅胶 G):青岛海洋化工厂生产7 Sephadex LH-20 (pharmacia 进口分装,北京化学试剂公司) 其提取用乙醇为食用级酒精;浓硫酸、冰醋酸、石油醚(60-90?)、 氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、丙酮、甲醇和 95%的乙醇(以上试 剂均为分析纯)。 1.2 化学成分预试验 为初步弄清紫玉盘中所含成分类型以便有针对性地提取分离路 线,先用系统预试法对紫玉盘进行化学成分预试验。 1.2.1 水提取液 取药材紫玉盘的粗粉 10g加水 100ml,冷浸 24小时,滤取 10ml滤液 做氨基酸、多肽、蛋白质检查。剩余药渣在 60?水浴上加热 30分钟,过 滤,滤液作糖、多糖、皂苷、苷类、鞣质、有机酸检查,结果见表 1。 表 1紫玉盘水提取液预试结果 检查项目 试剂或反应名称 正反应指标 现 象 结 论 氨基酸、多 茚三酮试剂 呈蓝、紫色 淡黄色 - 肽、蛋白质 双缩脲反应 呈紫、红色 淡黄色 - 蛋白质沉淀反应 出现沉淀 无沉淀 - 糖、多糖 酚醛缩合反应 界面处形成紫红色环 紫红色环 + 苷类 菲林反应 有红色沉淀生成 棕红色沉淀 + 皂苷 泡沫试验 振摇后产生大量泡沫 10min以上泡 + 放置不消失 沫不消失 鞣质 1%三氯化铁试剂 呈绿、蓝或紫暗色 墨绿色 + 明胶试剂 出现白色沉淀或混浊 白色沉淀 + PH7 PH5~6 有机酸 PH试剂 + 溴甲酚绿试验 在蓝色背景上显黄色 蓝色背景上 + 斑点 显黄色斑点 1.2.2 乙醇提取液 取药材紫玉盘的粗粉 10g加 95%乙醇 100ml,加热回流 1小时,过 滤,滤液分成两部分,一份做黄酮、蒽醌、酚、香豆素、内酯、萜类、 8 强心苷、甾体化合物的检查。另一份将乙醇液浓缩成膏状(至无醇味), 加 5%盐酸使溶解,过滤,酸性滤液做生物碱检查,结果见表 2。 表 2 紫玉盘乙醇提取液预试结果 检查项目 试剂或反应名称 正反应指标 现 象 结论 黄酮类 1%三氯化铝试剂 黄色或天蓝色荧光 黄色荧光 + 盐酸-镁粉反应 呈红色至紫色 紫红色 + 氨熏试验 黄色斑点,黄蓝色荧光 黄色斑点,黄蓝色 + 荧光 蒽醌类 2%氢氧化钠乙醇 变红色 棕绿色不褪 - 液 1%乙酸镁乙醇液 橙红色或紫色 棕绿色不变 - 酚类、 1%三氯化铁 呈绿、蓝或棕色 暗蓝色 + 鞣质 氯化钠明胶试验 混浊 出现混浊 + 内酯、香 异羟肟酸铁反应 紫色或橙红色 紫红色 + 豆素类 偶合反应 红色 红色 + 荧光试验 蓝色荧光 蓝色荧光 + 强心苷 3,5-二硝基苯甲 紫红色 出现混浊,颜色加 - 酸试剂 深 亚硝酰基铁氰化 显红色并逐渐消失 紫色,颜色不褪 - 钠试剂 碱性苦味酸试剂 橙红或红色 橙黄色 - 甾体、萜 醋酐?浓硫酸反 红色?紫?蓝?绿?最后 棕绿色不变 - 类 应 褪色 氯仿-浓硫酸反应 氯仿层显红色,硫酸层有 分层面有棕色环 - 绿色荧光 生物碱 碘化汞钾试剂 有白色或淡黄色沉淀 淡黄色沉淀 + 碘化铋钾试剂 淡黄色或棕黄色沉淀 棕黄色沉淀 + 硅钨酸试剂 有白色或淡黄色沉淀 白色沉淀 +9 1.2.3 石油醚提取液 取药材紫玉盘的粗粉 1g,加石油醚60~90? 10ml,放置 2~3小 时,过滤,取部分滤液做挥发油和油脂检查,结果见表 3。 表 3紫玉盘石油醚提取液预试结果 检查项目 试剂或反应名称 正反应指标 现 象 结 论 挥发油和油脂 滤纸试验 滤纸上有油斑 有油斑久置 有挥发油后可挥散 1.2.4 化学成分预试小结 由以上化学成分预试验结果可知,紫玉盘中可能 含有糖苷类、黄酮、 内酯、生物碱、有机酸、皂苷、挥发油等成分。 1.3 紫玉盘的提取和分离 1.3.1 提取与分离 将紫玉盘茎阴干,称取 10Kg,用 10倍量 95%乙醇浸泡 48小时后渗 漉提取,收集提取液;药渣用 60%乙醇浸泡 48小时后渗漉提取,收集提 取液,减压回收乙醇,合并干燥后得乙醇总提取物(U. microcarpa all alcohol extracts,简称 UAAE,下同)约 450g(得膏率 4.5%)。用硅胶拌 匀后,依次用石油醚(60~90?)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇 回流提取,回收溶剂,得石油醚部位U. microcarpa Petroleum ether extracts,简称 UPE,下同100g;氯仿部位U. microcarpa chloroform extracts,简称 UCE,下同60g;乙酸乙酯部位U. microcarpa ethyl acetate extracts,简称 UEE,下同35g;正丁醇部位U. microcarpa n-Butanol extracts,简称 UBE,下同180g和 95%乙醇部位U. microcarpa 95%alcohol extracts,简称 95%UAE,下同45g。 取石油醚部位 45g用硅胶柱色谱分离100-200目,650g,石油醚- 乙酸乙酯100:0?0:100梯度洗脱。在石油醚-乙酸乙酯100:1的洗脱部 分得到一个粗粉末,该样品上小柱进行加压硅胶柱色谱分离200-300目, 30g用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,然后经石油醚-乙酸乙酯反复重结晶 10得到白色粉末结晶 I25mg。在石油醚-乙酸乙酯25:1的洗脱部分得到 一个粗粉末,经石油醚-乙酸乙酯-丙酮反复重结晶纯化得到无色针状结 晶 II100mg。在石油醚-乙酸乙酯20:1的洗脱部分得到一个粗粉末, 经石油醚-乙酸乙酯反复重结晶纯化得到无色针状结晶 III200mg。 取氯仿部位-乙酸乙酯部位的混合浸膏 45g 用硅胶色谱柱分离 100-200目,600g,氯仿-甲醇100:0?0:100梯度洗脱。在氯仿的洗脱 部分得到三个粗粉末 A、B、C,A粉末通过上小柱进行加压硅胶色谱柱 分离(薄层层析硅胶 G,25g)得到无色针状结晶 IV20mg,B粉末也 上小柱进行加压硅胶色谱柱分离(薄层层析硅胶 G,40g),再通过上 Sephadex LH-20柱,得到白色无定形粉末结晶 V15mg。C粉末经过石 油醚-氯仿-乙酸乙酯反复重结晶纯化得到白色细针状结晶 VI140mg。 在氯仿-甲醇100:1的洗脱部分得到一个橘黄色的粗粉末,该样品通过上 小柱进行加压硅胶色谱柱分离(薄层层析硅胶 G,35g),石油醚-乙酸乙 酯的梯度洗脱,得到橙红色粉末结晶 VII75mg。在氯仿-甲醇100:1? 50:1的洗脱部分得到一个黄色粗粉,该样品通过上小柱进行加压硅胶色 谱柱分离(薄层层析硅胶 G,45g)石油醚-乙酸乙酯的梯度洗脱得到的 黄色粉末再通过丙酮-甲醇反复重结晶纯化得到黄色粉末状结晶 VIII180mg。在氯仿-甲醇8:1的洗脱部分得到一个白色的粗粉末,经 过氯仿-丙酮-甲醇反复重结晶纯化得到白色粉末状结晶 IX15mg。 11 1.3.2 紫玉盘化学成分提取与分离流程图: 紫玉盘茎药材粗粉(10Kg) 95%,60%EtOH 依次渗漉提取 乙醇提取液 回收溶剂 乙醇浸膏 硅胶拌样,用石油醚、乙酸乙酯、氯仿 正丁醇、95%乙醇依次回 流提取,回收溶剂石油醚部位氯仿部位 乙酸乙酯部位正丁醇部位95%乙醇部位 100g 60g 35g 180g 45g 45g上硅胶柱 合并氯仿部位和乙酸乙酯部位 石油醚-乙酸乙酯 取 45g上硅胶柱 梯度洗脱 氯仿-甲醇梯度洗脱白色粉末 无色针状 无色针状结晶 I 结 晶 II 结晶 III 无色针状白无定形粉 白色细针 橙红色粉 黄色粉末 白色粉末 色结晶 IV 末结晶 V 状结晶 VI 末结晶 VII状结晶 VIII 状结晶 IX 121.4 单体化合物的结构鉴定 1 13 对分得的 9个单体化合物利用理化检验、 UV、 IR、H-NMR、 C-NMR 等方法进行结构鉴定。 1.4.1 化合物 I的结构鉴定 1.4.1.1 综合解析 Liebermann-Burchard 反应呈阳性,TLC:石油醚-乙酸乙酯2:1, R0.65;石油醚-丙酮5:1,R0.55;氯仿-甲醇50:1,R0.68。 f f f -1 IR谱图见图 2KBr压片,cm :2917,2850为饱和 C-H伸缩振 动;1465、1381为-CH -或-CH弯曲振动;ν 1740和ν 1177提示 2 3 CO C-O 有酯类结构。 + + EI-MSm/z: 396[M-CH CH COOH]为基峰, 255[CH CH COO], 3 2 14 3 2 14 13 结合 C-NMR谱数据可知化合物 I分子量为 652,分子式为 C H O, 45 80 2不饱和度为 6(见图 3)。 1 H-NMR 谱见图 4、图 5 CDCl,500MHz,δppm: 5.37 3 1H,d,J4.1Hz为 6-H(烯氢),4.611H,m为 3-H,0.673H,s为棕榈 酸的 18-CH,1.023H,s为 19-CH,0.79-0.94m,15H为 5个-CH, 3 3 3 1.25[brs,CH ]。 2 n 13 C-NMR谱CDCl,400MHz及 DEPT谱见图 6、图 7,数据归属 3 见表 4,显示有与β-谷甾醇一致的一组碳信号和一系列脂肪酰基碳信号, [14,15] 且其数据与文献报道 完全一致。故确定该化合物为β-谷甾醇棕榈酸 29 酯(β-sitosterol palmitate)(结构式见图 1)。 28 21 22 27 24 18 25 20 2312 17 11 26 19 1316 1 9 2 14 1510 8 O 7 3 5 CH C O CH 2 14 3 4 6 图 1 化合物 I的化学结构式131.4.1.2 光谱图 90 80 70 60 50 40 30 20 10-0 4000350030002500200015001000500Wavenumbers cm-1 图 2 化合物 I的 IR图 图 3 化合物 I的EI-MS图14 %T 2917.05 2850.11 1740.44 1464.98 1380.98 1196.44 1177.38 721.741 图 4 化合物 I的 H-NMR图1 图 5 化合物 I的 H-NMR图(局部放大)1513 图 6 化合物 I的 C-NMR和 DEPT图(δ0-180) 13 图 7 化合物 I的 C-NMR和 DEPT图(局部放大)16表 4 化合物 I的碳谱 数据 实验值δ 文献值δ 实验值δ 文献值δ 位置 位置 (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) C-1 37.0 37.0 C-19 19.3 19.3 C-2 27.8 27.8 C-20 36.1 36.1 C-3 73.6 73.7 C-21 18.7 18.8 C-4 38.1 38.2 C-22 33.8 33.9 C-5 139.7 139.7 C-23 26.0 26.1 C-6 122.6 122.6 C-24 45.8 45.8 C-7 31.9 31.9 C-25 29.1 29.1 C-8 31.8 31.9 C-26 19.8 19.8 C-9 50.0 50.0 C-27 19.0 19.0 C-10 36.6 36.6 C-28 23.0 23.1 C-11 21.0 21.0 C-29 12.3 12.0 C-12 39.6 39.7 1’ 173.4 174.3 C-13 42.3 42.3 2’ 34.7 34.7 C-14 56.6 56.7 3’ 25.1 25.1 C-15 24.2 24.3 4’-13’ 29.1-29.7 29.3-29.7 C-16 28.2 28.2 14’ 31.9 31.9 C-17 56.0 56.0 15’ 22.7 22.7 C-18 11.8 11.8 16’ 14.1 14.1 13 13 注:实验测定条件为 C-NMR(400MHz, CDCl),文献测定条件为 C-NMR(75MHz, 3 CDCl)。 3 171.4.2 化合物 II的结构鉴定 1.4.2.1 综合解析 化合物 II:无色针状结晶,溶于氯仿,乙酸乙酯等有机溶剂,硅胶 薄层色谱用石油醚-乙酸乙酯5:1 展开,R 0.45;薄层在紫外光下无荧 f 光,将其浸入 5%硫酸-乙醇溶液中之后在 110?加热 5分钟后,薄层上样 品点呈紫色单斑。 - + 13 从 LC-MS测得单峰,[M+1]为 427和为 425[M-1],结合 CNMR -1 数据可知分子量 M为 426; IR光谱图见图 9KBr压片, cm :ν 3477 O-H 提示化合物为醇类,2998,2934处的 C-H键的伸缩振动;1623为 CC 的信号;1382,1377(偕二甲基)。 1 H-NMR(见图 10、图 11)(300MHz,CDCl)δppm:谱中显示 3 高场区有三萜类特征的山形吸收峰,0.80,0.82,0.90,0.94,0.95,0.98,1.09 处分别为 7个单峰甲基信号,其中 0.90处的峰有 6个氢,是两个化学位 移相同的甲基,所以该化合物中应该含有 8个甲基都与季碳相连,氢谱 数据归属见表 5。 13 C-NMR(见图 12、图 13)(400MHz,CDCl)δppm:谱中显 3 示该化合物共有 30个碳,158.1,116.8处有双键碳信号,79.1有 1个 -CHOH,碳谱数据归属见表 6,由此可知化合物分子式为 C H O,不饱 30 50 和度为 6。除 1个双键外应有 5个环,因此化合物 II应为五环三萜类化 [16] 合物。其氢谱和碳谱数据与文献报道 绿玉树萜烯醇(euphorginol)基 本一致。故确定该化合物为绿玉树萜烯醇(euphorginol)(结构式见图 8)。 18 29 30 19 20 21 2712 1711 18 25 13 261 2816 14 9 2 10 8 153 6 4 7 5H HO 2423 图 8 化合物 II的化学结构式 1.4.2.2 光谱图 10095 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 4000350030002500200015001000500Wavenumbers cm-1 图 9 化合物 II的 IR图 19 %T 3477.41 3043.48 2997.80 2933.76 2852.94 1623.28 1473.33 1417.72 1384.77 1376.66 1037.65 999.89 817. 39 686. 961 图 10 化合物 II的 H-NMR图1 图 11 化合物 II的 H-NMR图(局部放大)2013 图 12 化合物 II的 C-NMR图 13 图 13 化合物 II的 C-NMR图(局部放大)21表 5化合物 II的氢谱数据 位置 实验值δ(ppm) 文献值δ(ppm) H-6 3.201H,m 3.711H,m H-7a 2.061H,dd H-7b 1.921H,dd H-15 5.531H,dd 5.451H,dd H-23 0.823H,s 0.873H,s H-24 0.903H,s 0.903H,s H-25 0.983H,s 0.973H,s H-26 1.093H,s 1.123H,s H-27 0.903H,s 0.923H,s H-28 0.803H,s 0.843H,s H-29 0.953H,s 0.953H,s H-30 0.943H,s 0.923H,s 1 1 注:实验测定条件为 H-NMR(300MHz, CDCl),文献测定条件为 H-NMR(300MHz, 3 CDCl)。 3 22表 6 化合物 II的碳谱数据 实验值δ 文献值δ 实验值δ 文献值δ 位置 位置 (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) C-1 37.7 37.1 C-16 37.7 36.6 C-2 27.2 26.3 C-17 38.8 38.8 C-3 18.8 21.7 C-18 49.3 49.2 C-4 38.0 38.0 C-19 41.4 41.2 C-5 55.6 56.7 C-20 28.8 28.8 C-6 79.0 79.0 C-21 35.2 33.6 C-7 36.7 36.2 C-22 33.1 27.0 C-8 39.0 38.8 C-23 28.0 27.9 C-9 48.8 48.6 C-24 15.4 18.1 C-10 35.8 37.0 C-25 15.4 18.7 C-11 17.5 17.4 C-26 29.9 30.1 C-12 33.7 33.0 C-27 25.9 25.8 C-13 37.6 37.1 C-28 29.8 29.9 C-14 158.1 158.1 C-29 33.4 33.3 C-15 116.9 116.8 C-30 21.3 21.2 13 13 注:实验测定条件为 C-NMR(400MHz, CDCl),文献测定条件为 C-NMR(75.43 3 MHz, CDCl)。 3 231.4.3 化合物 III的结构鉴定 化合物 III:无色针状结晶(石油醚),易溶于氯仿、苯,可溶于热乙 醇,难溶于水、甲醇、冷乙醇。 10%浓硫酸显紫红色, Liebermann-Burchard 反应阳性紫?红?污绿)。与β-谷甾醇对照品共薄层,在三种不同 的展开系统中比较 R值完全一致。石油醚-乙酸乙酯5:1,R 0.37;石 f f 油醚-丙酮8:1,R 0.45;氯仿-乙酸乙酯10:1,R 0.48;且显色也相 f f 同,故确认该化合物为β-谷甾醇β-sitosterol(结构式见图 14)。 1.4.4 化合物 IX的结构分析 化合物 IX:白色粉末固体(甲醇),Liebermann-Burchard反应阳性 (紫?红?污绿),Molish反应呈阳性,经酸水解后用 PC检出含有葡萄 糖,说明该化合物为甾体苷类化合物,与β-胡萝卜苷对照品共薄层色谱 鉴定, R值及显色行为一致,故鉴定化合物为β-胡萝卜苷β-daucosterol f (结构式见图 14)。29 282122 27 2418 25 20 23 1217 11 26 1913 16 1 92 1415 10 87 3 5 RO 4 6 RH(β-谷甾醇)RGlu(β-胡萝卜苷) 图 14 化合物 III及化合物 IX的结构式 241.4.5 化合物 IV的结构鉴定 1.4.5.1 综合解析 化合物 IV:无色针状结晶(甲醇),易溶于正己烷、氯仿、丙酮、乙 -1 醇、甲醇等溶剂。IR光谱图(见图 16)KBr压片,cm :3071, 3012 处的为苯环 C-H键的伸缩振动,结合 1602、1582和 1450确定有苯环存 在;ν 1691,ν 1292及 3000左右宽的缔合羟基峰的存在,证明有 CO C-O -COOH。 1 H-NMR(500MHz,CDCl)谱图(见图 17)δppm:8.13(2H, 3 t, J8.25Hz)表明分子中具有对称性,应归属于 H-2和 H-6。7.63(1H, t, J7.5Hz)为 H-4,7.49(2H,t,J7.8Hz),在分子中具有对称性,应归 属于 H-3和 H-5,由于其处在官能团的间位,受到官能团的影响比邻位 1 的氢要小,因此出现较高场处, H-NMR数据归属见表 7。 13 从 C-NMR(500MHz,CDCl)谱图(见图 18)δppm:172.3 3 的峰-COOH中的碳。133.8,130.2,129.3,128.5的峰为苯环上的碳原子。 130.2,128.5 的叔碳信号明显强于比 129.3,133.8 的叔碳信号,提示 130.2,128.5应各代表两个叔碳,分别为 2,6-C和 3,5-C,这是由于羧基 对苯环产生的吸电子共轭效应对邻位的影响要比间位的要大,使 2,6-C 的化学位移向低场移动。129.3,133.8的峰,分别归属于 1-C和 4-C,这 是由于羧基对苯环产生的吸电子共轭效应使 4-C 的化学位移向低场移 13 动, C-NMR数据归属见表 8。13 1 [17] 以上 C-NMR和 H-NMR数据与文献 中苯甲酸基本相同;与苯甲 酸标准对照品共薄层,在三种不同的展开系统中比较色谱行为完全一致。 石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸5:1:0.1,R 0.28;石油醚-丙酮-冰醋酸 f 7:1:0.1,R 0.41;氯仿-甲醇-冰醋酸25:1:0.1,R 0.61;因此化合物