创新型实验报告

宁波大学考核答纸 （20 10  —20 11  学年第 1  学期） 常见食品防癌的机制研究 实验目的：证明枸杞多糖对癌细胞有抑制作用 实验原理：（1）PBS有冲洗旧培养液的作用 （2）DMSO可以溶解枸杞多糖 （3）MTT溶解在无酚红Hanks液中，作为显色剂 （4）DMSO可以溶解成色产物 （5）在一定波长下，用酶标仪可以测定未处理肿瘤细胞A值 实验材料：肿瘤细胞若干，胰蛋白酶液，枸杞多糖，DSMO,溶解在无酚红Hanks溶液中的MTT 实验步骤:一、肿瘤细胞培养：方法同实用细胞培养技术。 二、胰蛋白酶消化： 1、加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37摄氏度。 2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连成片，表明此时细胞消化适度。 3、加入培养液：培养基可以终止消化，加入新鲜的培养液。 4、吹打分散细胞：吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 三、细胞计数： 1、盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2、将细胞悬液滴入计数板 将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 3、统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格(每个大格含有16个中格)中的细胞数目。 4、计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)*10000 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 四、药物配制 精密称取枸杞多糖5g,用10mlDMSO溶解，配制成500mg/ml的母液，实验时把母液加到培养液中制成终浓度为0mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml的含药培养液。  五、细胞增殖测定 将肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔5000个细胞；24~48小时后，加入含有10mg/ml、 20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml的不同浓度枸杞多糖的培养液100ul，分别在37摄氏度，5%CO2，饱和湿度条件下培养1、2、3、4、5天后，用快速翻转法除去培养液，加入MTT20ul/孔（MTT溶解在无酚红Hanks液中，浓度为2mg/ml）,培养4小时后加入DMSO150ul/孔，摇床上震荡，待成色产物溶解后，用酶标仪测A值（波长=492nm单波长测定）。 六、结果比较 第一天： 浓度（mg/ml） 0 10 20 30 40 数据1 0.102 0.19 0.254 0.557 0.449 数据2 0.116 0.142 0.259 0.487 0.437 数据3 0.111 0.173 0.255 0.406 0.42 平均值 0.1097 0.1683 0.256 0.483 0.4353 抑制率   -53.4184% -133.36% -340.29% -296.81%             第二天： 浓度（mg/ml） 0 10 20 30 40 50 数据1 0.289 0.224 0.344 0.532 0.511 0.682 数据2 0.277 0.256 0.39 0.515 0.577 0.641 数据3 0.266 0.276 0.331 0.493 0.547 0.673 平均值 0.277333 0.252 0.355 0.513333 0.545 0.665333 抑制率   9.13% 9.13% 9.13% -96.51% -139.90%               第三天： 浓度（mg/ml） 0 10 20 30 40 50 数据1 0.348 0.368 0.464 0.423 0.743 0.905 数据2 0.337 0.301 0.422 0.438 0.758 0.902 数据3 0.333 0.385 0.473 0.562 0.754 1.3 平均值 0.2545 0.351333 0.453 0.4305 0.751667 0.9035 抑制率   -38.05% -78.00% -69.16% -195.35% -255.01%               第四天： 浓度（mg/ml） 0 10 20 30 40 50 数据1 0.171 0.212 0.175 0.211 0.177 1.386 数据2 0.165 0.171 0.157 0.259 0.285 1.871 数据3 0.179 0.202 0.158 0.221 0.211 1.515 平均值 0.171667 0.207 0.1575 0.216 0.248 1.4505 抑制率   -20.58% 8.25% -25.83% -44.47% -744.95%               第五天： 浓度（mg/ml） 0 10 20 30 40 50 数据1 0.584 0.246 0.201 0.123 0.226 0.974 数据2 0.498 0.226 0.19 0.151 0.222 0.295 数据3 0.545 0.228 0.198 0.165 0.213 0.387 平均值 0.5215 0.233333 0.196333 0.158 0.220333 0.341 抑制率   55.26% 165.62% 69.70% 57.75% 34.61%               七、结果讨论 1.第一天和第三天的抑制率为负值，说明枸杞多糖在第一天和第三天对癌细胞为促进作用。该结果可能是操作不当引起的实验误差导致的，也有可能枸杞多糖在第一天对癌细胞的作用时间短，表现为促进。 2．第二天枸杞多糖对癌细胞的作用为开始为抑制，当枸杞多糖达到一定浓度时转为促进。可能说明低浓度的枸杞多糖对癌细胞为抑制作用，高浓度促进。 3.第四天枸杞多糖在浓度为20mg/ml时对癌细胞起抑制作用，其余浓度均为促进作用，可能是由于实验操作不当引起的误差导致。 4.第五天枸杞多糖对癌细胞的作用均为抑制。该结果说明在一定时间后，枸杞多糖对癌细胞起抑制作用，既是无论高低浓度都为抑制作用，以20mg/ml的浓度为抑制率最高。 5.在全部五天的试验中，都会出现抑制率偏差较大的现象，可能是由于误差引起。 6.只有在第五天才出现全部抑制现象，可能说明枸杞多糖对癌细胞的作用与癌细胞的营养状态、生存状态有关。