XA21和PI-D2激酶蛋白质在酿酒酵母中的表达及其自我磷酸化研究

XA21和PI-D2激酶蛋白质在酿酒酵母中的表达及其自我磷酸化研究 XA21和PI-D2激酶蛋白质在酿酒酵母中的 表达及其自我磷酸化研究 47卷6期 2007年l2月4日 微生物 ActaMicrobiologicaSinica 47(6):lOO9,1012 4December20o7 XA21和PI.D2激酶蛋白质在酿酒酵母中的表达 及其自我磷酸化研究 王书利,李莉云,尚俊军,王静,刘国振 (河北农业大学生命科学学院保定071001) (中国科学院遗传与发育生物学研究所北京100101) 摘要:白叶枯病和稻瘟病是最主要的水稻病害.Xa21是水稻白叶枯病抗性基因,P一d2是稻瘟病抗性基因,二者 都编码类受体激酶蛋白质.在前期研究中,曾系统地研究了细菌中表达XA21激酶蛋白质的生化活性.在此实验 中利用真核表达系统酿酒酵母对Xa21和编码的蛋白激酶进行了表达,纯化及自我磷酸化活性分析,为进一 步的生化分析,蛋白质一蛋白质相互作用研究,底物筛选等奠定了基础. 关键词:水稻;白叶枯病;稻瘟病;抗病基因;酿酒酵母 中图分类号:Q786,Q936文献标识码:A文章编号:0001—6209(2007)06—1009—04 水稻是最重要的粮食作物之一,是全世界一半 以上人口的主要粮食来源.水稻病害的侵染会导致 减产甚至绝收.白叶枯病和稻瘟病是水稻两大主要 病害,对抗病基因介导的抗病分子机理研究对水稻 生产具有重要的意义.Xa21是第一个克隆的水稻 抗病基因,对水稻白叶枯病具有广谱抗性.其编码 的蛋白质是一个类受体蛋白激酶….刘国振等对 Xa21编码蛋白的激酶区进行了系统的生化特性的 研究,证明了Xa21编码一个有活性的蛋白激酶,是 丝,苏氨酸特异的.稻瘟病是真菌性病害,由异宗 配合子囊菌Magnaporthegrisea.的无性世代 culariagrisea.产生的分生孢子侵染而使水稻致 病.—d2抗稻瘟病基因最早在水稻品种地谷中发 现,并定位在第6号染色体上.经图位克隆法克 隆后,发现—d2也编码一个类受体激酶.本实 验中,我们将XA21和PI—D2蛋白激酶在真核表达系 统酵母中进行了表达.纯化后获得了考染可见并具 有自我磷酸化活性的蛋白质,为两个蛋白激酶的大 量表达,进而开展相关生化分析奠定了基础. l材料和方法 1.1材料 1.1.1质粒和菌株:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y258菌株与pEGH穿梭载体由中国科学院 北京基因组研究所朱衡研究员惠赠,该载体是 URA3高拷贝表达载体,含有受半乳糖诱导的GALl 启动子,表达GST一6×His融合蛋白. 1.1.2主要试剂和仪器:EcoRI和HindIII购自大 连宝生物公司;lkbDNAladder,Tween一20,DTr购自 AmershamBiosciences;琼脂糖,卡那霉素,氨苄青霉 素,Yeastnitrogenbase(YNB),SDS购自上海生工;过 硫酸铵,EDTA,t3-巯基乙醇购自Sigma;抗HIS单克隆 抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自上海 午立生物技术有限公司.PCR仪购自德国Biometra 公司;凝胶成像,蛋白质电泳和Westernblot湿转系 统购自Bio—rad公司;台式高速冷冻离心机(型号 6K15)购自Sigma公司. 1.1.3寡核苷酸引物的合成:根据酿酒酵母同 源重组特点,pEGH载体及XA21激酶和PI—D2激酶 区序列,采用Sequencer软件设计了相应的特异扩增 引物,用于扩增XA21K的正反向引物分别为: PrimXA21K—F(5一GCATCACCATCACCATCACGGTGGT GGTCACAAGAGAACI'AAAAAGGGAGC一3),PrimXA21 K—R(5'-AGGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAATCAG AATTCAAGGCTCCCACCT一3);用于扩增PI—D2K的正 基金项目:国家自然科学基金(30328019,30370872,30670175) 通讯作者.Tel:86—312.7528250;E?mail:gzhliu@genomics.org.cn 作者简介:王书利(1979一),女,河北省石家庄人,硕士研究生,主要进行植物分子生物学方面研究.E-mail:wangshul 收稿日期:2007.03—23;接受日期:2007.04.13;修回日期:2007—07.16 WANGShu—lieta1./ActaMicrobiologicaSinica(2007)47(6) 反向引物分别为:PrimPi—d2K—F(5'-GCATCACCAT CACCATCACGGTGGTGGTGCTGGTTCATCGGAAGATGA 1'G一3),PrimPi—d2K—R(5一AGGCAGATCGTCAGTCAGT CACGArGAArCATCTGGGACCAGAGAGCCTCACA一3). 1.2PCR扩增 PCR反应体系为25gL.扩增条件:94?5min; 94?1min,58?lmin,72?lmin,30个循环;最后 72?延伸5min.XA21K扩增的来自美国佛罗 里达大学植病系宋文源博士实验室,PI—D2K扩增的 模板来自中国科学院遗传与发育生物学研究所朱立 煌教授实验室. 1.3酿酒酵母转化及重组子的验证 将PCR产物与线性化的pEGH载体DNA混合 后,用LiAC/PEG方法进行酵母转化(受体菌株 Y258).转化后的菌液涂在不含尿嘧啶的SC培养 基上进行筛选.每个转化挑取6个单克隆分别接种 到3mLSC—Ura一/Glucose液体培养基中,30"12 230r/min振荡培养过夜.用玻璃珠破碎法提取酵母 质粒,获得的质粒DNA用热激法转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)XL1一Blue感受态细胞,挑取单克隆, 提取质粒DNA,对得到的质粒进行EcoRI酶切验 证.酶切验证正确的重组质粒再进行测序验证,测 序工作由北京华大基因研究中心完成. 1.4蛋白质表达,纯化及考染检测 将上述经过酶切鉴定的阳性克隆,重新转化酵 母.挑取单菌落,在SC—Ura一/Raffinose培养基中, 30"12振荡培养使DD枷达到0.6,0.8.加入半乳糖 至终浓度2%,诱导12h.离心收集菌体,加入预冷 的裂解缓冲液和适量锆珠(直径2mm),4?剧烈振 荡.3000r/min5min离心后取上清,与GSTResin (AmershamBioscience)混匀,4?旋转混合过夜.离 心后取沉淀,用我WashingbufferI和Washingbuffer ?分别洗3次,每次3000r/inin1.5min.得到的沉淀 即为GST融合蛋白质.利用7.5%SDS—PAGE分 离,考马斯亮蓝染色30min,脱色过夜后观察和扫 描. 1.5Westernblot检测 将纯化后的XA21K和PI—D2K激酶蛋白质进行 SDS—PAGE分离,之后将蛋白质转到PVDF (Polyvinylidene—F1uoride)膜上,用5%的脱脂奶粉封 闭lh后,用抗6×His的鼠源单克隆抗体在4~C进行 过夜孵育,孵育后的PVDF膜用TYBS溶液(Tween 0.1%,Tris0.1mol/L,NaC10.15mol/LpH7.9)洗3次, 再用HRP标记的IgG二抗在室温孵育lh.孵育后 的PVDF膜用TYBS溶液洗3次,然后用ECL发光检 测液(GEHeathcare)对PVDF膜进行发光反应,暗室 中曝光光片,显影,定影后观察扫描. 1.6激酶自我磷酸化 将结合在GSTResin上的融合蛋白质用激酶缓 冲液漂洗3次后,加入2Ci[7一.P]ATP(3000Ci/ mmol,中国同位素公司),反应体系为20t&,室温放置 30min后加入SDS—PAGE上样缓冲液终止反应. 7.5%SDS—PAGE,干胶,于一70"12进行光片曝光. 2结果 2.1Xa21和pf一激酶区的PCR扩增 利用设计的引物和相应的模板,对XA21K和 PI—D2K进行PCR扩增,扩增产物用琼脂糖电泳分离 (图略).这两个片段的理论大小分别是1050bp和 1061bp,电泳结果可以看出扩增产物大小与理论值 相符. 2.2阳性转化子的验证 将PCR产物与线性化的酵母表达载体pEGH混 合,转化Y258酵母菌株,每份转化挑取l0个阳性克 隆,提取DNA,用载体通用引物进行PCR扩增验证 插入片段.与细菌不同,酵母中可以容纳两个或多 个的不同的质粒,因此再提取PCR验证阳性的酵母 质粒DNA,转化细菌,获得阳性细菌克隆,再提取细 菌的质粒DNA,进行酶切和测序验证,结果表明,我 们获得了序列完全正确的整合到pEGH表达载体的 XA21K和PI—D2K克隆(数据未附). 2.3蛋白质诱导表达和Westernblot检测 将测序正确的质粒重新转化酵母,并进行蛋白 质的诱导表达,纯化后XA21和PI—D2激酶蛋白质的 SDS—PAGE图谱见图l—A.本实验所用的pEGH载体 表达的是GST一6×His一目标蛋白质构成的融合蛋白 质,根据XA21和PI—D2激酶蛋白质的序列,预测的 融合蛋白质的分子量分别为65kDa和66kDa,电泳 结果(图1)与此相符.根据考染结果,XA21和PI— D2激酶蛋白质在酵母中的表达量约在0.5,lmg/L 培养基.为了进一步验证获得的蛋白质的正确性, 我们用抗His抗体进行Westernblot检测(图l—B), 王书利等:XA21和Pl—D2激酶蛋白质在酿酒酵母中的表达及其自我磷酸化研究., 微生物(2007)47(6) 阳性条带与考染结果相符,x光片上主带清晰,表明 纯化的效果较好. kDa Il6— 66.——?一66kDa ?一65kDa 图1酿酒酵母中表达XA21K和PI.D2K蛋白质的SDS. PAGE分离(A)及Westernblot检测(B) Fig.1SDS—PAGEseparation(A)andwe~emblotdetection(B)of XA21KandP1一D2KproteinsexpressedinS.cerevisiae.M.Protein Masker:1.GST—PI—D2K:2.GST-XA21K. 2.4激酶自我磷酸化活性检测 将纯化后的XA21K,PI.D2K激酶蛋白质在体外 进行自我磷酸化反应后对x光片进行曝光.结果 表明,在酿酒酵母中表达的XA21K,PI.D2K激酶蛋 白质是有活性的,能够发生自我磷酸化(图2.B). 二kDI6 66二酶誊一,一誊一一鼍? B 图2XA21K和PI-D2K在酿酒酵母中的表达(A)及自我 磷酸化活性分析(B) Fig.2ExpressionofXA21KandPI—D2KproteinkinasesinS. cerevisiae(A)andautophosphorylationassay(B).M.Proteinmarker; 1.GSTXA21K:2.GST—PI—D2K. 3讨论 利用酿酒酵母系统,本实验表达了水稻抗白叶 枯病Xa21和抗稻瘟病基因p.d2的激酶区.纯化 后的蛋白质经SDS.PAGE分离,考染可见清晰的条 带.自我磷酸化分析表明,目的蛋白质具有磷酸化 活性.一般认为,真核系统表达的蛋白质可能修饰, 而这种蛋白质修饰是细菌表达系统不可能发生的. 虽然本文没有对细菌和酵母两个系统表达的蛋白质 的激酶活性进行定量比较,缺乏是否发生修饰的直 接证据,但从表达量上看,酵母系统比细菌的表达量 约高十几倍,达到0.51mg/L的水平.该实验为进 一 步的生化特性,蛋白质.蛋白质相互作用研究以及 底物筛选研究等提供了条件.利用酵母表达的PI. D2K蛋白质,我们已筛选出一些可能的底物(未发表 数据). 参考文献 SongWY,WangGL,ChenLL,eta1.Areceptorkinase—likeprotein encodedbythefleediseaseresistancegene,Xa21.Sc/ence,1995, 270(5243):1804—1806. LiuGZ,PiLY,WalkerJC,eta1.Biochemicalcharacterizationofthe kinasedomainofthericediseaseresistancereceptor-likekinase XA21.JBC,2002,277(23):20264—20269. ChenXW,LiSG,XuJC,eta1.1dentificationofTwoBlast ResistanceGenesinaRiceVariety,Digu.J.Phytopathology, 2003,151(1511):1—9. ChenXW,ShangJJ,ChenDX,eta1.AB—leetinreceptorkinase geneconferring6ceblastresistance.ThePlantJourna1.2006.46 (5):794—804. ZhuH,KlemicJF,ChangS,eta1.Analysisofyeastproteinkinases usingproteinchips.NatGenet,2000,26(3):283—289. GietzRD,SehiestlRH,WillemsAR,eta1.Studiesonthe transformationofintactyeastcellsbytheLiAe/SS-DNA/PEG procedure.Yeast,1995,11(4):355—360. 李莉云,孙健,王海娇,等.水稻蛋白激酶的规模化克隆, 表达及活性研究.分子细胞生物,2007,411(3):253—258. ']]]- i] ?234567 [[r-[[[[ 1012WANGShu—lieta1./ActaMicrobiologicaSinica(2007)47(6) ExpressionandautophosphorylationanalysisofXA21andPI—D2 proteinkinasesinSaccharomycescerevisiae WANGShu...1i,LILi—yun,SHANGJun—jun,WANGJing2,LIUGuo—zhen ('CollegeofLifeSciences,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001.China) (l~titnteofGeneticsandDevelopmentalBiology,ChineseAcademyofSciences.Beijing100 101.China) Abstract:Ricebacterialblightandblastarethemostcrucialricedisease.Xa21confersresistan cetobacterialblight, whilePi—d2confersresistancetoriceblast.BothXa21andPi—d2encodereceptorkinase— likeproteins.Biochemical propertiesofXA21kinaseexpressedinbacterialwerecharacterizedinourpreviousreport.Inthisstudy,bothXA21and PI— D2kinasedomainwerePCRamplifiedandclonedintoyeastexpressionvectorpEGHviarecombinationalcloning strategy,kinaseproteinsexpressedineukaryoticyeastsystemwaspurifiedandautophosphorylationassaywascarriedout. TheresultsindicatedthatXA21andPI?-D2proteincanbedetectedbySDS.-PAGEandshowedexpectedmolecular weight.AutophosphorylationassayindicatedthatyeastexpressedXA21andPI— D2wereactivewhenincubatedwith labelledATP.Theexperimentprovidedbasicmaterialsforbiochemicalprosperityanalysis.protein—proteininteractionand substratescreeningresearch. Keywords:rice;bacterialblight;riceblast;diseaseresistancegene;Saccharomycescerevisiae Foundationitem:NationalNaturalScienceFoundationofChina(30328019,30370872,30670175) Correspondingauthor.Tel:86—312—7528250;E-mail:gzhliu@genomics.org.ca Received:23March2007/Accepted:13Apri12007/Revised:16July2007 《微生物》第九届编辑委员会 会议纪要 2007年9月21日《微生物》第九届编辑委员会第一次全体会议在北京召开.出席 会议的有:的23位编委(主编 谭华荣研究员,副主编曲音波教授,王敖全研究员,胡福泉教授,黄力研究员;编委郭 俊研究员,诸葛健教授,陈冠军教授,杨瑞 馥研究员,张兆山研究员,刘如林教授,刘志恒研究员,江宁研究员,钱世钧研究员,张 建中研究员,李越中教授,孙明教授,向 华研究员,张杰研究员,朱旭东教授,白逢彦研究员,李正西教授,李文均研究员),编辑部的王晋芳,张晓丽2位编辑;列席 会议的还有:微生物所联合编辑部主任武文,中国微生物学会办公室王旭,《生物工程》,《微生物学通报》,《菌物》的4 位同仁. 本次会议的主要议题是:(1)广泛征集编委的意见和建议,共同探讨我刊今后的办刊思路和发展方向;(2)进一步提高刊物 质量,与国际接轨,争取早日进入国际化检索系统,落实具体. 会议由主编,中国科学院微生物研究所党委书记兼副所长谭华荣先生主持,他对如何进一步办好作了重要发言.他 谈到,凡是有创新性,领先水平的论文本刊将优先发表,并尽快以电子杂志的形式将刊出在纸质期刊上的优秀论文公布到互 联网上,争取几年内进入SCI等国际检索系统.副主编黄力先生宣读了上一届主编李季伦院士发来的致贺信,在信中李先生 肯定了《微生物》所取得的成绩,感谢期刊的主办单位中国科学院微生物研究所和中国微生物学会多年来给予的支持,感 谢历届编委会和编辑部工作人员默默无闻所付出的辛勤劳动.李先生希望,为了加快国际化进程,应该继续发挥编委会和编 辑部的重要作用,共同努力为期刊的发展做出新的贡献.编辑部负责人王晋芳对54年来所走过历程作了全面的介绍,使 到会的编委们对的历史沿革,发展状况及所处地位等都有了更全面的了解.(下转1054页)