食品检验工高级操作技能试卷及答案

1.食物中核黄素的测定方法 任何一种方法均可。 1主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。 本标准适用于各类食物中核黄素的测定。 第一微生物法 2原理 某一种微生物的生长(繁殖)必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei，简称L.C.)的生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中核黄素的含量。 3试剂 本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为纯。 3.1冰乙酸。 3.2甲苯。 3.3无水乙酸钠。 3.4乙酸铅。 3.5氢氧化铵。 3.6干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei ATCC 7469)。 3.7盐酸：0.1mol/L。 3.8氢氧化钠：1mol/L和0.1mol/L。 3.90.9%氯化钠溶液(生理盐水)：使用前应进行灭菌处理。 3.10核黄素标准储备液(25μg/mL)：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。 3.11核黄素标准中间液(10μg/mL)：准确吸取20mL核黄素标准储备液，加水稀释至50mL。 3.12核黄素标准使用液(0.1μg/mL)：准确吸取1.0mL中间液于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液。 3.13碱处理蛋白陈：分别称取40g蛋白陈和20g氢氧化钠于250mL水中。混合后，放于37±0.5℃恒温箱内，24～48h后取出，用冰乙酸调节pH至6.8，加14g无水乙酸钠(或23.2g含有3分子结晶水的乙酸钠)，稀释至800mL，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。 3.140.1%胱氨酸溶液：称取1gL－胱氨酸于小烧杯中。加20mL水，缓慢加入约5～10mL盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至1L，加少许甲苯盖于溶液表面。 3.15酵母补充液：称取100g酵母提取物干粉于500mL水中，称取150g乙酸铅于500mL水中，将两溶液混合，以氢氧化铵调节pH至酚酞呈红色(取少许溶液检验)。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节pH至6.5。通入硫化氢直至不生沉淀，过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。 3.16甲盐溶液：称取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至500mL。加入少许甲苯以保存之。 3.17乙盐溶液：称取10g硫酸镁(MgSO4·7H2O)，0.5g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和0.5g硫酸锰(MnSO4·4H2O)，加水溶解，并稀释至500mL，加少许甲苯以保存之。 3.18基本培养储备液：将下列试剂混合于500mL烧杯中，加水至450mL，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，用水稀释至500mL。 碱处理蛋白陈100mL 0.1%腕氨酸溶液100mL 酵母补充液20mL 甲盐溶液10mL 乙盐溶液10mL 无水葡萄糖10g 3.19琼脂培养基：将下列试剂混合于250mL三角瓶中，加水至100mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用1mol/L盐酸趁热调节pH至6.8。尽快倒入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa(10lb/in2)压力下灭菌15min，取出后直立试管，冷至室温，于冰箱中保存。 无水葡萄糖1g 乙酸钠(NaAc·3H2O)1.7g 蛋白陈  0.8g 酵母提取物干粉  0.2g 甲盐溶液0.2mL 乙盐溶液0.2mL 琼脂1.2g 3.200.04%溴甲酚绿指示剂：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研磨，直至完全溶解。用水稀释至250mL。 3.210.04%溴麝香草酚蓝指示剂：称取0.1g溴麝香草酚蓝于小研钵中，加1.6mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。 4仪器与设备 4.1实验室常用设备。 4.2电热恒温培养箱。 4.3离心沉淀机。 4.4液体快速混合器。 4.5高压消毒锅。 5菌种的制备与保存 5.1储备菌种的制备：以L.C.纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中。在37±0.5℃恒温培养箱中保温16～24h。贮干冰箱内，至多不超过2周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续2～3d方可使用，否则生长不好。 5.2种子培养液的制备：取5mL核黄素标准使用液和5mL基本培养储备液于15mL离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa(10l/in2)压力下灭菌15min。每次可制备2～4管。 6操作步骤 因核黄素易被日光和紫外线破坏，故一切操作要在暗室内进行。 6.1接种液的制备：使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中，同时制做管。在37±0.5℃保温16～24h。取出后离心10min(3000rpm)，以无菌操作方法倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗二次，再加10mL消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已消毒的注射器内，立即使用。 6.2样品的制备 6.2.1将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。 6.2.2称取约含5～10μg的核黄素样品(谷类约10g，干豆类约4g，肉类约5g)，加入50mL 0.1mol/L盐酸溶液，混匀。置于高压锅内，在10.3×104Pa(15lb/in2)压力下水解30min。 6.2.3冷至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至4.6(取少许水解液，用澳甲酚绿检验，溶液呈草绿色即可)。 6.2.4加入淀粉酶或木瓜蛋白酶，每克样品加入20mg酶。在40℃恒温箱中过夜，大约16h。 6.2.5冷至室温，加水稀释到100mL，过滤。对于脂肪量高的食物，可用乙醚提取，以除去脂肪。 6.3标准管的制备 两组试管中每管各加核黄素标准使用液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，每管加水至5mL，再每管加5mL基本培养储备液混匀。 6.4样品管的制备 6.4.1吸取样品溶液5～10mL，置于25mL具塞试管中，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至6.8(取少许溶液，用溴麝香草酚蓝检验)，加水稀释至刻度。 6.4.2取两组试管，各加(6.4.1)样品稀释液1、2、3、4mL，每管加水至5mL，每管再加5mL基本培养储备液混匀。 6.5灭菌：将以上样品管和标准管全部塞上棉塞，置于高压锅内，在6.9×104Pa(10lb/in2)压力下灭菌15min。 6.6接种和培养 6.6.1待试管冷至室温，在无菌操作条件下接种，每管加一滴接种液(6.1)，接种时注射器针头不要碰试管壁，要使接种液直接滴在培养液内。 6.6.2置于37±0.5℃恒温箱中培养约72h，培养时每管必须在同一温度。培养时间可延长18h或减少12h。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混浊度测定法，以培养18～24h为宜。 6.7滴定 将试管中培养液倒入50mL三角瓶中，加0.001%溴麝香草酚蓝溶液5mL，分二次淋洗试管，洗液倒至该三角瓶中，以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，终点呈绿色。以第一瓶的滴定终点作为变色参照瓶。约30min后再换一参照瓶，因溶液放置过久颜色变浅。 6.8用标准核黄素溶液的不同浓度为横坐标及在滴定时所需0.1mol/L氢氧化钠的毫升数为纵坐标，绘制标准曲线。 6.9计算 X1= ×F× 式中：X1——样品中核黄素含量，mg/100g； c——以曲线查得每毫升试样中核黄素含量，μg/mL； V——样品水解液定容总体积，mL； F——试样液的稀释倍数； m——试样质量，g； 样品含量由ug/g换算成mg/100g的系数 7结果的允许误差 同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值≤10%。 第二荧光法 8原理 核黄素在440～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。 9试剂 试验用水为蒸馏水。试剂不加说明为分析纯。 9.1硅镁吸附剂：60～100目。 9.22.5mol/L无水乙酸钠溶液。 9.310%木瓜蛋白酶：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。 9.410%淀粉酶：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。 9.50.1mol/L盐酸：同3.7。 9.61mol/L氢氧化钠：同3.8。 9.70.1mol/L氢氧化钠：同3.8。 9.820%低亚硫酸钠溶液：此液用时现配。保存在冰水浴中，4h内有效。 9.9洗脱液：丙酮∶冰乙酸∶水(5∶2∶9)。 9.100.04%澳甲酚绿指示剂：同3.20。 9.113%高锰酸钾溶液。 9.123%过氧化氢溶液。 9.13核黄素标准液的配制(纯度98%)。 9.13.1核黄素标准储备液(25μg/mL)：同3.10。 9.13.2核黄素标准使用液：吸取2.00mL核黄素标准储备液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素， 10仪器与设备 10.1实验室常用设备。 10.2高压消毒锅。 10.3电热恒温培养箱。 10.4核黄素吸附柱：见图。 （图略） 10.5荧光分光光度计。 11操作步骤 整个操作过程需避光进行。 11.1样品提取 11.1.1水解 称取2～10g样品(约含10～200μg核黄素)于100mL三角瓶中，加入50mL 0.1mol/L盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40mL瓷柑埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，10.3×104Pa(15lb/in2)30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿色，pH为4.5。 11.1.2酶解 11.1.2.1含有淀粉的水解液：加入3mL 10%淀粉酶溶液，于37～40℃保温约16h。 11.1.2.2含高蛋白的水解液：加3mL 10%木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保温约16h。 11.1.3过滤 上述酶解液定容至100.0mL，用干滤纸过滤。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。 11.2氧化去杂质 11.2.1视样品中核黄素的含量取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液(约含1～10μg核黄素)分别于20mL的带盖刻度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰乙酸，混匀。加3%高锰酸钾溶液0.5mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3%双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色褪掉。剧烈振摇此管，使多余的氧气逸出。 11.3核黄素的吸附和洗脱 11.3.1核黄素吸附柱：硅镁吸附剂约1g用湿法装入柱，占柱长1/2～2/3(约5cm)为宜(吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上)，勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。 11.3.2过柱与洗脱：将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20mL热水洗去样液中的杂质。然后用5.00mL洗脱液(9.9)将样品中核黄素洗脱并收集于一带盖10mL刻度试管中，再用水 洗吸附柱，收集洗出之液体并定容至10mL，混匀后待测荧光。 11.4测定 11.4.1于激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量样品管及标准管的荧光值。 11.4.2待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液(约5～7mL)中加0.1mL 20%低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。 11.5计算 X2= ×F× 式中：X2——样品中含核黄素的量，mg/100g； A——样品管荧光值； B——样品管空白荧光值； C——标准管荧光值； D——标准管空白荧光值； f——稀释倍数； m——样品的质量，g； S——标准管中核黄素含量，μg； 2.食品中水分的测定方法 本方法用于各类食品中水分含量的测定。 第一法直接干燥法 1原理 食品中的水分一般是指在100℃左右直接干燥的情况下，所失去物质的总量。 直接干燥法适用于在95～105℃下，不含或含其他挥发性物质甚微的食品。 2试剂 2.16N盐酸：量取100ml盐酸，加水稀释至200ml。 2.26N氢氧化钠溶液：称取24g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。 2.3海砂：取用水洗去泥土的海砂或河砂，先用6N盐酸煮沸0.5h，用水洗至中性，再用6N氢氧化钠溶液煮沸0.5h，用水洗至中性，经105℃干燥备用。 3操作方法 3.1固体样品：取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热0.5～1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至恒量。称取2.00～10.0g切碎或磨细的样品，放入此称量瓶中，样品厚度约为5mm。加盖，精密称量后，置95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入95～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放干燥器内冷却0.5h后再称量。至前后两次质量差不超过2mg，即为恒量。 3.2半固体或液体样品：取洁净的蒸发皿，内加10.0g海砂及一根小玻棒，置于95～105℃干燥箱中，干燥0.5～1.0h后取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量，并重复干燥至恒量。然后精密称取5～10g样品，置于蒸发皿中，用小玻棒搅匀放在沸水浴上蒸干，并随时搅拌，擦去皿底的水滴，置95～105℃干燥箱中干燥4h后盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。以下按3.1自“然后再放入95～105℃干燥箱中干燥1h左右”起依法操作。 3.3计算 X1= ×100 式中：X1——样品中水分的含量，%； m1——称量瓶(或蒸发皿加海砂、玻棒)和样品的质量，g； m2——称量瓶(或蒸发皿加海砂、玻棒)和样品干燥后的质量，g； m3——称量瓶(或蒸发皿加海砂、玻棒)的质量，g。 第二法减压干燥法 4原理 食品中的水分指在一定的温度及压力的情况下失去物质的总量，适用于含糖、味精等易分解的食品。 5仪器 真空干燥箱。 6操作方法 按第3章要求称取样品，放入真空干燥箱内，将干燥箱连接水泵，抽出干燥箱内空气至所需压力(一般为300～400mmHg)，并同时加热至所需温度(50～60℃)。关闭通水泵或真空泵上的活塞，停止抽气，使干燥箱内保持一定的温度和压力，经一定时间后，打开活塞，使空气经干燥装置缓缓通入至干燥箱内，待压力恢复正常后再打开。取出称量瓶，放入干燥器中0.5h后称量，并重复以上操作至恒量。 7计算 同3.3。 第三法蒸馏法 8原理 食品中的水分与甲苯或二甲苯共同蒸出，收集馏出液于接收管内，根据体积计算含量。适用于含较多其他挥发性物质的食品，如油脂、香辛料等。 9试剂 甲苯或二甲苯：取甲苯或二甲苯，先以水饱和后，分去水层，进行蒸馏，收集馏出液备用。 10仪器 水分测定器：如图所示。 11操作方法 称取适量样品(估计含水2～5ml)，放入250ml锥形瓶中，加入新蒸馏的甲苯(或二甲苯)75ml，连接冷凝管与水分接收管，从冷凝管顶端注入甲苯，装满水分接收管。加热慢慢蒸馏，使每秒钟得馏出液两滴，待大部分水分蒸出后，加速蒸馏约每秒钟4滴，当水分全部蒸出后，接收管内的水分体积不再增加时，从冷凝管顶端加入甲苯冲洗。如冷凝管壁附有水滴，可用附有小橡皮头的铜丝擦下，再蒸馏片刻至接收管上部及冷凝管壁无水滴附着为止，读取接收管水层的容积。 12计算 X2= ×100 式中：X2——样品中水分的含量，ml/100g； V——接收管内水的体积，ml； m4——样品的质量，g。 3．维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法） 一、试剂 2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸馏水中。 1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸馏水中。 标准抗坏血酸溶液（1mg/ml）: 准确称取100mg纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。 0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150ml含有52mg NaHCO3的热水中，冷却后加水稀释至250ml，贮于棕色瓶中冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。 二、材料 苹果、卷心菜等。 三、器材 锥形瓶（100ml），组织捣碎器，吸量管（10ml），漏斗，滤纸，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。 四、操作方法 1、提取 水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g，加入20ml 2%草酸，用研钵研磨，四层纱布过滤，滤液备用。纱布可用少量2%草酸洗几次，合并滤液，滤液总体积定容至50ml。 2、标准液滴定 准确吸取标准抗坏血酸溶液1ml置100ml锥形瓶中，加9ml 1%草酸，用微量滴定管以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1ml染料相当于多少毫克抗坏血酸（取10ml 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定）。 3、样品滴定 准确吸取滤液两份，每份10ml, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10ml 1%草酸作空白对照滴定。 4、计算 式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数； VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数； C为样品提取液的总毫升数； D为滴定时所取的样品提取液毫升数； T为1ml染料能氧化抗坏血酸毫克数（由操作二计算出）； W为待测样品的重量（g）。 4．食品卫生微生物学检验大肠菌群测定 一、设备和材料 1.1温箱：36±1℃。 1.2冰箱：0～4℃。 1.3恒温水浴：44.5±0.5℃。 1.4天平。 1.5显微镜。 1.6均质器或乳钵。 1.7平皿：直径为90mm。 1.8试管。 1.9吸管。 1.10广口瓶或三角烧瓶：容量为500mL。 1.11玻璃珠：直径约5mm。 1.12载玻片。 1.13酒精灯。 1.14试管架。 二、培养基和试剂 2.1乳糖胆盐发酵管：按GB 4789.28中4.9规定。 2.2伊红美蓝琼脂平板：按GB 4789.28中4.25沥规定。 2.3乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.10规定。 2.4EC肉汤：按GB 4789.28中4.11规定。 2.5磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。 2.6生理盐水。 2.7革兰氏染色液：按GB 4789.28中2.2规定。 三、操作步骤 3.1检样稀释 3.1.1以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1∶10的均匀稀释液。 3.1.2用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。 3.1.3另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。 3.2乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3.3分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 3.4证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 3.5报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。 四、粪大肠菌群(faecal coliform) 4.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内，置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养24±2h，经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。 4.2结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。 5．食品中硒的测定 一、试剂 1.1环己烷。 1.2硝酸。 1.3过氯酸。 1.4盐酸。 1.5氢溴酸。 1.6(1＋9)盐酸溶液：取10mL盐酸，加90mL水。 1.7(1＋1)氨水。 1.8(5＋95)去硒硫酸：取5mL去硒硫酸，加于95mL水中。 去硒硫酸：取200mL硫酸，加于200mL水中，再加30mL氢溴酸，混匀，置沙浴上加热蒸去硒与水至出现浓白烟，此时体积应为200mL。 1.9  0.2mol/LEDTA：称37gEDTA二钠盐，加水并加热溶解，冷却后稀释至500mL。 1.10  10%盐酸羟胺：称取10g盐酸羟胺溶于水中，稀释至100mL。 1.11混合酸：硝酸＋过氯酸(2＋1)。 1.12  0.1%2，3－二氨基萘(纯度95%～98%)：需在暗室配制。称取200mgDAN于一带盖三角瓶中，加入200mL0.1mol/L盐酸，振摇约15min，使其全部溶解。约加40mL环己烷，继续振摇5min，将此液转入分液漏斗中，待溶液分层后，弃去环己烷层，收集DAN层溶液。如此用环己烷纯化DAN直至环己烷中的荧光数值降至最低时为止(纯化次数视DAN纯度不同而定，一般约需纯化3～4次)。将提纯后的DAN溶液储于棕色瓶中，约加1cm厚的环己烷覆盖溶液表面。置冰箱中保存。必要时再纯化一次。 1.13硒标准溶液 1.13.1硒标准储备液(100μg/mL)：精确称取100.0mg元素硒(光谱纯)，溶于少量硝酸中，加2mL过氯酸，置沸水浴中加热3～4h，冷却后加入8.4mL盐酸，再置沸水浴中煮2min。准确稀释至1000mL，其盐酸浓度为0.1mol/L。此储备液浓度为100μg/mL。 1.13.2硒标准使用液(0.05μg/mL)：将3.13.1液用0.1mol/L盐酸稀释，使含硒为0.05μg/mL。于冰箱中保存。 1.14  0.02%甲酚红指示剂：称取50mg甲酚红溶于水中，加(1＋1)氨水1滴，待甲酚红完全溶解后加水稀释至250mL。 1.15EDTA混合液：取0.2mol/L的EDTA(3.9)和10%盐酸羟胺(3.10)液各50mL，混匀，再加5mL(3.14)溶液，用水稀释至1L。 2仪器和设备 2.1实验室常用设备。 2.2荧光分光光度计。 3分析步骤 3.1样品处理及消化 3.1.1粮食：样品用水洗三次，于60℃烘干，用不锈钢磨磨成粉，储于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧盖保存，备用。 3.1.2蔬菜及其他植物性食物：取可食部分用水冲洗三次后用纱布吸去水滴，用不锈钢刀切碎，取混合均匀的样品于60℃烘干，称重，粉碎，备用。 3.1.3称取0.5～2.0g样品(含硒量0.01～0.5μg)于磨口三角瓶内，加10mL(5＋95)去硒硫酸，样品湿润后，再加20mL混合酸液放置过夜。次日于沙浴上逐渐加热，当激烈反应发生后(溶液变无色)，继续加热至产生白烟，溶液逐渐变成淡黄色即达终点。某些蔬菜样品消化后常出现浑浊，难以确定终点，所以要细心观察。还有含硒较高的蔬菜含有较多的Se6＋，需要在消化达到终点时冷却后加10mL(1＋9)盐酸，继续加热，使Se6+还原成Se4＋。按上述方法确定终点。 3.2测定 于样品消化液中加20mLEDTA混合液，用氨水(1＋1)或盐酸调至淡红橙色(PH1.5～2.0)。以下步骤在暗室进行：加3mLDAN试剂，混匀，置沸水浴中煮5min，取出立即冷却，加3mL环己烷，振摇4min，将全部溶液移入分液漏斗，待分层后弃去水层，环己烷层转入带盖试管中，小心勿使环己烷中混入水滴，于激发光波长376nm，发射光波长520nm处测定苤硒脑的荧光强度。 3.3硒标准曲线绘制：准确吸取硒标准使用液0，0.2，1.0，2.0及4.0mL，加水至5mL，按样品测定步骤同时进行。硒含量在0.5μg以下时荧光强度与硒含量呈线性关系，在常规测定样品时，每次需做试剂空白与样品硒含量相近的标准管(双份)即可。 4结果 4.1计算 式中：X——样品中硒含量，μg/g A——标准管荧光读数； B——空白管荧光读数； C——样品管荧光读数； m1——标准管中硒质量，μg； m2——试样质量，g。 4.2结果的允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果相对偏差绝对值≤10%。