淋球菌菌种保存研究进展

淋球菌菌种保存研究进展 ( ) ,取一接种环菌苔移 种于上 述 新 鲜 脱 纤 维 羊 血 试 管 作条件下 淋病奈瑟菌又称淋球菌 go nococcus,为我国目前流行的 发病率极高的 性传播疾病 ———淋病的病原体 , 其培养 很 中 ,盖紧管塞 ,立即放置 - 25 ?冰冻保存 。每隔 3 个月取出试 高 ,抵抗 力 弱 , 不 耐 热 和 寒 冷 , 干 燥 环 境 下 1 , 2h 55 ?下 管 ,室温自然冰融 ,取两接种环于血平板上划线分离 ,在前述条 [ 1 ] 件下孵育 。菌种 的 存 活 情 况 明 , 淋 球 菌 1 年 左 右 需 移 种 1 5mi n 即死亡 ,淋球菌自身还能产生自溶 素使菌体葡萄糖耗 [ 2 ] 次 ,存活的菌株仍维持其原有特性 。结果表明 ,用本方法保存 竭而死亡 。一般实验室对淋菌的保存极其困难 ,且传代手续 淋球菌等菌株效果良好 。 较繁 ,购买菌种亦较昂贵 ,这给科研和教学带来诸多不便 。目 1 . 3 脱脂鲜奶保存法 由于鲜牛奶来源充足 ,未经工业加工 前 ,淋球菌一般采用传统的冷冻真空干燥法 ,此法虽然可靠 ,但 处理 ,营养成份基本上未丢失 ,且操作简单易行 ,经济实用 ,保 操作繁琐费时 ,需要贵重仪器 ———冰冻干燥机和真空泵等 ,成 本较高 。如何经济 、简便而又可靠地长期保存淋球菌 ,一直是 存细菌存活率高 ,是一种较为理想的淋球菌保存法 ,具有较高 广大科研工作者关心的问题 。本文就淋球菌菌种保存方法的 相关研究进展做一综述 。 的推广价值 ,特别适用于从事淋球菌研究的科研和教学单位 。 1 培养基保存法[ 5 ] 赵翠英等 实验结果表明 , 普通冰箱可存活 5 , 6d , - 22 ?至[ 3 ] 1 . 1 巧克力液体培养基保存法 我国学者王兰君等 试制巧 [ 6 ,7 ] 少可存活 2 个月 , - 70 ?至少可存活 1 年半 。还有学者 用 克力液体培养基以保存淋菌菌种 ,试验方法与结果如下 : ?巧 鲜奶法 、脱纤维血法 、普通奶粉法和冷冻真空干燥法同时保存 80 多株淋球菌 。结果显 示 , 冷冻真 空干燥法 1 年和 2 年内复 克力液体培养基成份及制备 : 基础液含胰蛋白 1 克 , NaCl 01 5 苏 ,复 活 率 均 为 1001 0 % ; 鲜 奶 法 1 年 内 复 苏 , 复 活 率 为 克 , KHPO01 1 克 ,酵母粉 01 8 克 ,10 %玉米粉浸出液 1 毫升 ,2 4 蒸馏水 100 毫 升 , 添 加 剂 3 毫 升 , 其 中 辅 酶 Q5 克 , 维 生 素 10 1001 0 % ,2 年内复苏 ,复活率为 971 7 % ; 脱纤维血法 1 年内复 B201 1 克 ,无菌脱纤维兔血 10 毫升 。先将基础液 61 8 千克 30 1 苏 ,复活率为 1001 0 % ,2 年内复苏 ,复活率为 821 3 % ;冷冻真空 分钟灭菌 ,当晾至 60 ?时以无菌手续加入 添加剂与脱纤维兔 ( 干燥法 、鲜奶法和脱纤维血法明显高于普通奶粉法组 91 3 % , 血 ,摇匀 ,85 ?水浴加热 15 分钟 ,取出 ,以无菌手续分装于无菌 ) 11 2 %。因此 ,我们认为在没有冷冻干燥设备的情况下 ,鲜奶 小试管内 ,每管 1 毫升或 2 毫升 ,置 4 ?冰箱备用 。 ?淋菌菌种 的保存 :淋菌菌种接种于巧克力液体培养基 ,最初于 48 、96 、144 法保存淋球菌具有经济 、简便实用 、存活率高等优点 ,是一种较 h 各传种于巧克力平板 1 次 。此后每周传种 1 次 ,直至 34 天再 理想的贮存淋球菌的方法 。 传种于巧克力平板 ,培养后观察结果 。发现淋菌的菌落 、菌形 、 1 . 4 肉汤保存法 肉汤保存法所使用的材料来源方便 ,并且 排列 、染色性和氧化酶试验等特征均保持不变 ,并将后 3 次传 [ 8 ] 肉汤的透明度高 ,有利于对细菌的浓度进行观察 。有学者 将 种法经过多次重复试验 ,观察其结果均如上述所见 。这种巧克 ( 纯培养 24 小时后的淋球菌菌落接种于预温的肉汤管中 菌浓 力液体培养基保存淋菌菌种的方法 , 与传统的每隔 24 小时传 8 ) 度约为 1 ×10,分别置 - 20 ?、- 30 ?、- 70 ?冰箱以及液氮 种一次法比较 ,不仅手续简便 ,不易被杂菌污染 ,且保存时间较 长 ,适于一般实验室保存淋菌菌种用 。 中保存 。研究 发 现 , 淋 球 菌 在 - 20 ?至 少 可 保 存 2 个 月 , -[ 4 ] 1 . 2 脱纤维血冷冻菌种保存法 有学者 用无菌手续抽取羊 30 ?至少可保存 2,3 个月 , - 70 ?至少可保存 1 年以上 ,并发 颈静脉血 ,注入已灭菌的带玻璃珠瓶中脱去纤维 ,然后分装加 现液氮中淋球菌的保存效果最好及保存时间最长 。 盖无菌小试管中用于保存淋球菌等菌株 。将淋球菌置恒温箱 2 液氮低温保存法于5 %, 1 0 % CO、3 6 ?条 件 下 培 养 1 6 , 1 8 h 。然 后 在 无 菌 操2 液氮低温保存淋球菌是一种方便且效果较好的方法 ,是将 接种有淋球菌的保存管封口 ,于液氮生物容器中保存 。我国学 [ 9 ] 者唐谦等 用液氮低温保存 11 株淋球菌 , 并进行了较长时 间的观察 ,11 株菌复温转种后均完全生长 , 集落和菌 体形态 、 染色特异性未见改变 。保存和复苏过程中要注意以下事项 : ? 置放时动作要快 ,菌种保存管应先直放 ,不能倒置 。 ?复苏时 ( )基金项目 :云南省教育厅科学研究基金项目 No . 07 Z40591 () 从液氮中取出菌种后 ,应迅速放入 38 ?2?温水中解冻 ,完全 通讯作者 :张 雷 , E2mail :leigezha ng @163 . co m 龙北国. 高级医学微生物学 [ M ] . 北京 : 人民卫生出版 社 , 2006 : [ 1 ] 解冻后即刻转种 。 ?复温转种用培养基 , 应先在 37 ?温箱中 预温后再应用 。 323 . Sp ence J M . Wright L , Cla r k VL . L a bo rato r y mai nt ena nce of [ 2 ] 3 冷冻干燥保存法 Nei sseria go no r r hoeae [J ] . Cur r Pro toc Micro biol , 2008 , Chap t er 是先将微生物在低温中迅速冷冻 ,然后在高真空状态下迅 4 : U nit 4 A . 1 . 速脱水干燥 ,真空密封而成 。干燥细菌或病毒时常用脱脂牛奶 王兰君 ,陈廷梅 ,耿 燕. 应用巧克力液体培养基对淋病奈瑟菌进 [ 10,12 ] [ 3 ] 做保护剂 ,这种方法可维持微生物生命达数年之久 ,是目 ( ) 行菌种保存的观察[ J ] . 中国皮肤性病学杂志 ,1995 ,9 3: 170 . 尹前淋球菌最理想的保种方法 。此法虽然可靠 ,但操作繁琐 ,费 洪萍 ,蔡玲斐. 一种脱纤维血冷冻菌种保存法 [ J ] . 杭州医学高 等[ 4 ] ( ) 专科学校学报 , 2003 ,24 1: 25 . 时 、费力 ,需价格昂贵的冷冻真空干燥机和真空泵等设备 ,故成赵翠英 ,赵宏儒 ,单丽娟 ,等. 用脱脂牛奶保存淋病双球菌的效果 本较高 ,给实际工作带来诸多不便 。 ( ) 观察[J ] . 中国皮肤性病学杂志 ,2000 ,14 1:56 . [ 5 ] 4 其他余俊龙 ,罗映辉 ,邹明祥 ,等. 一种简便的淋球菌保存方法的实验 如明胶纸片干燥保存法 ,可使菌株存活至少 1 年 ,但操作 ( ) 研究[J ] . 中国感染控制杂志 ,2002 ,1 1: 47 . [ 6 ] [ 13 ] 罗桂梅 ,刘红军 ,刘三九. 淋球菌保存方法的实验研究 [ J ] . 实用预 十分繁琐 。Pier re 等 在 - 20 ?条件下用明胶干燥保存法保 ( ) 防医学 ,2007 ,14 1:192 . 存 6 株淋球菌 ,一年复苏 ,6 株菌均存活 ; 一年半复苏时 5 株菌[ 7 ] 宋矿余 ,陈华顺 ,傅颖媛 ,等. 肉汤保存法用于淋球菌保种的研究 存活 。并认为在 - 20 ?明胶干燥保存淋球菌至少可达 1 年之 ( ) 及效果观察[J ] . 江西医学院学报 ,2004 ,44 4: 101 . 久 ,而且此保存载体使用和制作较容易 ,在 4 ?, 8 ?可存放 1 唐书谦 ,叶庆佾. 淋球菌低温液氮保存法 [ J ] . 第三军医大学学报 , [ 8 ] [ 14 ] 年 。还有学者 用冻存管储存系 统在 - 70 ?保存淋球 菌 , 每 ( ) 1993 ,15 2: 162 . 个月用改良的 New Yo r k 培养基复苏 1 次 。一年复苏存活率 张秀 珍. 当 代 细 菌 检 验 与 临 床 [ M ] . 北 京 : 人 民 卫 生 出 版 社 , [ 9 ] 为 991 8 % ,两年复苏存活率为 971 8 % 。结 果表明此法保存淋 1999 :3702376 . 球菌高效而且方便 ,甚至比冷冻干燥法更优 。 [ 10 ] 5 结语 淋球菌是一种苛养菌 ,在一般实验实培养和保存都非常困 [ 11 ] 姬云堂. 医用诊断细菌学[ M ] . 北京 :人民军医出版社 ,1998 :2162 难 ,给我们的科研和教学带来很多不便 ,而购买菌株又较 220 . 昂贵 。国内外学者在淋球菌保存方面做了一些研究 ,找出了一 [ 12 ] 陆德源. 医学微生物学[ M ] . 北京 :人民卫生出版社 ,2001 :43248 . 些保存淋球菌的有效方法 。但仍未研制出一种简便易行 保 [ 13 ] Pier re S , Ha r bec . Pre ser vatio n of Nei sseria go no r r hoeae at - 存时间长且使菌种生物学特性无改变的淋球菌保存方法 。因 20 ?[J ] . Cli nic Micro b , 1996 :114321146 .此 ,有效保存淋球菌国内外学者仍需要做大量的研究 。 [ 14 ] Mo ye s A , Yo ung H . Sto rage and rep eat ed reco ver y of Nei sseria ( ) go no r r hoeae usi ng cr yo vial s[ J ] . Br J Bio med Sci , 1995 , 52 1 : 【参考文献】 19221 . ( ) 收稿日期 : 2009201208 ; 编辑 : 母存培 ( )[ 12 ] Gradma n A H . Ali ski ren , a no vel o rall y eff ective reni n i n hi bito r , 上接第 1596 页 2 2dep endent anti hyp ert en sive efficacy a nd placebo2li ke Prepa ratio n , p urificap ro vides do se[ 6 ] Skeggs L T , Ka hn J R , L entz KE , et al . tolera bilit y i n hyper t en sive patient s [ J ] . Ci rculatio n , 2005 , 111 tio n , a nd a mi no acid sequence of a pol yp ep ti de reni n subst rat e ( ) ( ) 8:101221018 . [J ] . J Exp Med , 1957 ,106 3: 4392453 . [ 7 ] Fi sher ND , Hollenber g N K. Reni n i n hi bitio n : w hat a re t he t her2 [ 13 ] Nao mi DL , Fi sher . Renal a nd ho r mo nal re spo n se s to di rect re2 ap eutic oppo rt unities[ J ] . J A m Soc Nep hrol . 2005 ,16 :5922599 . ni n i n hi bitio n wit h Ali ski ren i n healt hy hu ma n s [ J ] . Ci rculatio n , ( ) 2008 ,117 25:319923205 . [ 8 ] Pilz B , Shagda sur ren E , Well ner M , et al . Ali ski ren , a Hu ma n Reni n In hi bito r , A melio rat e s Ca r diac a nd Renal Da mage i n Do ub2 [ 14 ] Op a ril S , Ya ro w s SA , Pat el S , et al . Efflcacy and saf et y of co mbi ned use of Ali ski ren a nd val sa rt a n i n p atient s wit h hyp er2 le2Tra nsgenic Rat s[J ] . Hyp ert ensio n ,2005 ,46 :5692576 . t en sio n : a ra ndo mi sed do uble2bli nd t rial [ J ] . L ancet , 2007 , 370 [ 9 ] Shagda r suren E , Well ner M , Brae sen J H , et al . Co mple ment ac2 tivatio n i n a ngio t en si n ?2i nduced o r ga n da mage [ J ] . Ci rc Re s , ( ) 9583: 2212229 . ( ) 2005 ,97 7:7162724 . [ 15 ] Wei r MR , Bu sh C , Zha ng J , et al . A nti hyp ert en si ve efflcacy [ 10 ] Kell y DJ , Zha ng Y , Moe G , et al . Ali ski ren , a no vel reni n i n2 a nd saf et y of t he o ral reni n i n hi bito r Ali ski ren i n p atient s wit h hy2 hi bito r , i s renop ro t ective i n a mo del of adva nced dia betic nep hrop2 ( ) p ert ensio n : a pooled a nal ysi s [ J ] . Eur Hea rt J , 2006 , 27 Suppl : ( ) at hy i n rat s[J ] . Dia betolo gia ,2007 ,50 11:239822404 . 299 . [ 11 ] Woo d J M , Schnell CR , Cu mi n F , et al . Ali ski ren , a no vel o ral2 [ 16 ] A nder sen . Co mpa rati ve efficacy a nd saf et y of Ali ski ren , a n o ral l y eff ective reni n i nhi bito r , lo wer s bloo d p re ssure i n mar mo set s di rect reni n i n hi bito r , a nd ra mip ril i n hyp ert en sio n : a 62mo nt h , a nd spo nt a neo u sl y hyp ert en sive rat s [ J ] . J Hypert en s , 2005 , 23 ra ndo mized , do uble2bli nd t rial [J ] . J Hyp ert en s ,2008 ,26 :589 . ( ) 2:4172426 . ( )收稿日期 : 2008212226 ; 修回日期 : 2009206219 ; 编辑 : 母存培