R和C带技术及其临床意义

R和C带技术及其临床意义1.目的：R显带可补充G显带末端浅染的缺点，加强染色体末端微小变异的识别；R显带适用于大批量实验以及较难处理的标本如骨髓。2．应用范围外周血、骨髓等各种标本的染色体分析技术。3．实验原理3.1．R显带法产生的带纹在染色强度上与G带相反，故也称为逆转显带。R显带染色体的末端为阳性染色，为了观察染色体的末端缺失，应当用R带。在这一点上G带和Q带不如R带。虽然有许多荧光素不必预处理就能在染色体上产生R带。但的R带技术是把染色体放在高温（通常为87℃）的离子溶液中，再以Giemsa或吖啶橙染色。这时原来为G带阴性的带，经Giemsa染色后为阳性带，经吖啶橙染色者为绿色荧光，而原来G带的阳性带则呈现红色的吖啶橙荧光。3.2．R带按制备的不同可分为荧光R带和姬母萨R带两类，但以Dutrillaux首创的热处理姬母萨R显带法为最基本的方法。其显带机制尚未完全明了。Dutrillaux认为是由于DNA受热变性的缘故。此时富含AT碱基对的区段单链化，故不易为姬母萨液所染色，乃呈浅带；而富含GC碱基对的区段仍保持正常的双链结构，故易于为姬母萨液染色，乃呈深带。但目前了解的Giemsa着色机制并不十分支持次假说。3.3．R带与G带、Q带技术产生的大多数条带在整个染色体臂上显示出一系列阳性和阴性的染色带，但没有“间带”。这些带的带型在不同组织中是恒定的，且在发育期间不发生变化。在分裂的前期是许多的细微带出现在细长的染色体上，到了前中期由于它们彼此融合而成为稍大一点的带，带的数目也随之减少；在高度浓缩的中期染色体上，这些带几乎合并成一个带而占据着整条染色体。可见这些带在有丝分裂过程中不断地改变其大小，故称为变动带。变动带相当于粗线期的染色粒，而且代表了有丝分裂中染色体上的浓缩过程，蛋白质的巯基被氧化成二硫化物。最先浓缩的染色体带一般是在S期的后期复制的DNA，它们富含A-T碱基对，几乎没有活性基因。阴性的G带和阳性的R带通常是早复制的，浓缩得晚些，含有大多数活性基因，很易遭受染色体损伤。变动带在分裂前期的发展和融合表明，在染色体上最先浓缩和最晚浓缩的区段之间，某些特性的变化可能是逐步发展的过程，而不是划分得一清二楚的。4．实验流程4.1．标本采集4.1.1．采集要求4.1.1.1．外周血以晨起空腹采血为佳；4.1.1.2．骨髓抽取以髂骨、胸骨为佳。4.1.2．标本类型肝素钠抗凝血或培养液保存的血。4.1.3．标本量4.1.3.1．外周血为3ml左右。4.1.3.2．骨髓为5±1ml。4.1.4．储存容器一次性无菌肝素钠抗凝管或培养液。4.1.5．标本保存4.1.5.1．外周血4～10℃保存，24h内尽快送检；4.1.5.2．骨髓2～8℃保存，6～8h尽快送检。4.1.6．标本拒收标准4.1.6.1．标本缺乏唯一性条形码识别；4.1.6.2．标本量不足检测；4.1.6.3．标本严重溶血、凝血、脂血、污染；4.1.6.4．标本使用非肝素钠抗凝；4.1.6.5．骨髓标本计数有核细胞过少。4.2．试剂与仪器4.2.1．试剂4.2.1.1．试剂组成1640培养基（外周血或骨髓），秋水仙素，甲醇，冰醋酸，生理盐水，NaCl，KCl，NaH2PO4.2H2O，Na2HPO4，MgSO4.7H2O，葡萄糖，酚红，CaCl2，Tris-Base，Giemsa粉，甘油，香柏油，无水乙醇，三蒸水等。4.2.1.2．储存和稳定性4.2.1.2.1．储存1640培养基-20℃保存，秋水仙素、Earle's液2～8℃保存，其它试剂均于室温下保存，切莫倒置。4.2.1.2.2．稳定性未开封，正确保存可稳定至表明的保质期；开封后，正确保存可稳定12周。4.2.1.3．使用方法4.2.1.3.1．1640培养基、秋水仙素、生理盐水、香柏油等直接按照使用；4.2.1.3.2．甲醇、冰醋酸、KCl、无水乙醇、Earle's液等使用时配制成工作液即可，其中Earle's液需4℃保存，固定液则须现用现配。4.2.1.3.3．Giemsa粉、Tris-Base等应提前配制成贮存液，使用时按比例稀释即可。4.2.2．仪器CO2恒温培养箱，超净工作台，恒温水浴箱，恒温水浴锅，烤箱，水平离心机，显微镜，染色体自动分析系统，冰箱，天平等。4.3．质控程序4.3.1．对每批新进的培养基，对每个批号的培养基，必须做过预实验后方可使用，并做好；4.3.2．对每批新进的甲醇和冰醋酸，必须做过预实验后方可使用，并做好记录；4.3.3．对每批新进的秋水仙素，对每个批号的秋水仙素，必须做过预实验后方可使用，并做好记录；4.3.4．对每批新进的Giemsa粉，必须提前配好几批贮存液，分别做好预实验后使用，并做好记录。4.4．操作步骤4.4.1．细胞培养针对不同的送检标本选择合适的培养方法，并在结束培养之前选择适当的秋水仙素处理。4.4.2．收获细胞4.4.2.1．将培养完全的两瓶培养物倒入1个离心管内，以1500rpm离心10分钟，弃上清，留下细胞沉淀。4.4.2.2．低渗：向离心管内加入37℃预温的0.075mol/L的KCL8ml，用滴管反复吹打分散细胞，置37℃水浴箱中温浴25-30分钟。4.4.2.3．预固定：向低渗后的细胞悬液内缓慢加入新鲜配制的固定液（甲醇：冰醋酸＝3:1）1ml到1.5ml，轻轻混匀后置37℃水浴箱中温浴5分钟，随后1500rpm离心10分钟，弃上清，留下细胞沉淀。4.4.2.4．固定：沿管壁向上述沉淀细胞缓慢加入固定液8ml，轻轻混匀后37℃温浴静置30分钟，1500rpm离心10分钟，弃上清，再加入固定液6ml,轻轻混匀后盖上离心管盖，置冰箱2℃～8℃保存备用。4.4.3．制片4.4.3.1．低位滴片法将备用的细胞悬液以1500rpm离心10分钟，弃上清，留下细胞沉淀，重新加入新配制的固定液，将悬液配制成乳清色（具体情况需参照沉淀物的量和制片后的细胞的分布情况），混匀后，在预备好的洁净冰玻片上方约1cm滴片，每张玻片滴2滴，均匀铺展后酒精灯火焰过火两次，自然干燥或烤箱烤干备用。4.4.3.1．高位滴片法将备用的细胞悬液以1500rpm离心10分钟，弃上清，留下细胞沉淀，重新加入新配制的固定液，将悬液配制成稀牛奶状（具体情况需参照沉淀物的量和制片后的细胞的分布情况），混匀后，在预浸泡在25%酒精的玻片上方，至少30cm以上滴3滴悬液，迅速水平过火一次，接着倾斜玻片缓慢过火，使其着火，再连续水平过火数次，直到玻片被烤干。4.4.4．显带与染色4.4.4.1．取适量的（由标本量而定）容积为50ml的白瓷立式染缸，倒入适量的pH6.5～6.8的Earle's溶液，加盖后置恒温水浴锅中加热至87.5℃。4.4.4.2．将表面干燥的玻片标本放入预温87.5℃的Earle's溶液中温育，玻片之间应留有间隙。4.4.4.3．标本温育60min后，每隔5～10min取出1～2张玻片，流水冲洗，温育时间约在60～120min之间。4.4.4.4．消化后的片子用新鲜配置的10%Giemsa染色液染色8～10min，取出水洗，待干，镜检。观察最初取出的标本上染色体的显带情况，有助于判断显带合适所需的时间。4.5．参考值正常男性：46，XY；正常女性：46，XX。4.6．临床意义4.6.1．与G带等显带技术一样，R带分析的主要目的在于发现体质性或克隆性核型异常。同时，R带亦具有独自的特色：其一，带型和Q带、G带正好相反，即前者的阳性带相当于后者的阴性带，而前者的阴性带则相当于后者的阳性带，因而得名；其二，除Y染色体外，其余染色体末端均呈深带。因此R带不但可代替Q带和G带作为常规显带技术应用，而且还有胜过Q带和G带之处：R带作为G带的互补带，有助于确定位于G带阴性区的染色体重排断裂点；R带对揭示涉及染色体末端的缺失和易位特别有价值。自然R带也有它的短处，即它的带纹不如G带精细，因而其解象力有时逊于G带，例如难以识别象inv(16)这样微小的异常。4.6.2．R带在白血病中的应用优势较强。这取决于骨髓的有丝分裂指数较低、分裂相较差，而G显带对片子的质量要求较高，显带和染色等步骤较难控制，很难较好地显带和着色，但R显带对片子质量并不十分苛刻，便弥补了这一不足。另外，R显带处理的染色体一般不会弯曲、扭变，且着色比较稳定，末端条带多为深染。在临床实际应用中，R带的显色流程比较简单、稳定，适合于大量标本的检测；同时条带较少并不一定是缺点，它可简化片子的后续分析，缩短检验周期，而无法分析出病变的标本，可采用FISH结合诊断。4.7．注意事项4.7.1．和其它显带技术一样，分裂相量多质佳是植被优良R带标本的前提，这和培养以及收获细胞技术密切相关。4.7.2．Earle's溶液配制时应采用1级纯水为佳（按美国国家临床试验标准委员会规定，最大每毫升菌落数10，pH6.0～7.0，电阻率10MΩ/cm，硅最大值0.05mg/L）。4.7.3．Earle's溶液的pH和温育温度是显带成功与否的另外两个关键。pH<6或>7，温度<80℃或>90℃，显带常失败。在此范围内，标本温育时间和Earle's溶液的pH成正比，而和温度成反比。pH6.5、温度87.5℃为最佳显带条件。4.7.4．陈旧的玻片标本或已经Giemsa染色的标本均可用于显带，但由于片龄的增加，显带时间需要缩短，即标本的老化时间与显带时间成反比。4.7.5．来自外周血淋巴细胞培养的染色体标本显带所需时间比骨髓染色体标本稍短。4.7.6．R带标本最好用相差显微镜观察，若用普通显微镜观察或显微摄影时，应加用绿色滤光片以增大反差。Ｃ带是显带技术一、实验目的通过实验，初步掌握动、染色体Ｃ带分带技术。二、实验原理Ｃ带是显带技术中最简单的一种带型。使用这种技术，能使着丝粒型的异染色质着色，这种异染色质通常位于着丝粒周围并常含有高度重复序列的DNA。因为通常都在着丝粒处出现，所以称之为C-带。关于产生Ｃ带的机理，有人认为用氢氧化钡和盐类处理染色体，能从染色体中提取高达80％的DNA。DNA被优先地从非Ｃ带区提出，结果染色体臂着色浅而着丝粒异染色质着色深。有人研究表明，着丝粒异染色质仅与组蛋白结合，而常染色质含有大量非组蛋白蛋白质。一般有这样的看法，活跃的染色质比遗传上不活跃的染色质更富以非组蛋白蛋白质。这说明，仅与组蛋白结合的染色质比含有大量非组蛋白蛋白质的染色质，结构紧密得多。也就是这种紧密的结构保护着丝粒的异染色质免受氢氧化钡和盐类的破坏，从而产生Ｃ带。三、实验材料小白鼠骨髓细胞染色体制片不经染色留用的标本片，或采用酸处理压片法制备植物根尖细胞染色体的标本片。四、实验器具和药品试剂显微镜、恒温水浴锅、分析天平、镊子、切片架、切片盒、立式染缸、漏斗、量筒、吸管、滤纸等。盐酸、氢氧化钡、Giemsa母液、磷酸缓冲液、2×SSC溶液。五、实验方法和步骤(一)BSG(Bariumhydroxide，Saline，Giemsa)法：将标本片浸入新配制的5％Ba(OH)2溶液(60℃)中处理5～10分钟后，用60℃热水慢慢倒入染色缸中，使氢氧化钡慢慢溢出，直到Ba(OH)2被热水置换出来，最后再用热水漂洗2次，以彻底洗净氢氧化钡。或经0.2NHCL漂洗数秒，用蒸馏水漂洗干净。然后在2×SSC溶液（65℃）中温浴60～120分钟。经水洗,稍干后用1/10Giemsa染液染色20分钟。流水洗片，稍干后镜检。(二)HSG(Hyolorochloricacid，Saline，Giemsa)法：将标本片在0.2NHCL中室温处理60分钟。蒸馏水冲洗后，置2×SSC溶液(65℃)中温育15分钟。经蒸馏水冲洗，稍干后用1/10Giemsa染液染色10分钟左右。水冲洗，稍干后镜检。(三)注意事项分带处理适度的染色体应为深红略带蓝色,具黑色带纹。如染色体红色，无带，则变性处理不够，应加大Ba(OH)2浓度或加长变性时间；如染色体未染上色，或只着丝点附近染成黑色，则变性过度，应降低Ba(OH)2浓度，或减少变性时间；如细胞核和染色体均不见，说明变性极过度。蚕豆和洋葱采用HSG法较好，而大麦和小麦采用BSG法效果较好。(四)带型分析将已分带的标本，进行显微摄影，冲洗、放大，按核型分析方法将染色体编号进行带型分析，要求详细记录各染色体上，各带纹的位置，宽窄着色深浅和形状。最后绘制染色体模式图，在各条染色体模式图上标出各条带纹的位置、宽窄、深浅、形状等线条。植物染色体C带主要包括四种带型：1．着丝粒带是指着丝粒及其附近的带，大部分植物都有这种带型。2．中间带分布于染色体着丝粒至末端之间的带叫做中间带。小麦B组染色体中间带较多且明显；蚕豆染色体中间带一般在长臂上。3．末端带位于染色体的末端的带。洋葱有较明显的末端带，小麦仅部分染色体显示，大麦、蚕豆则不显示。4．核仁缢痕带是指核仁染色体特殊的带型，位于核仁组织中心区，蚕豆、玉米、大麦、小麦均有明显的核仁缢痕带。