单细胞藻类的培养液汇总

第六节单细胞藻类的培养液藻类的生长繁殖需要吸收各种营养元素，单细胞藻类的培养液必须具备这些营养元素,而且在营养成分和数量上都应该符合藻类的需要，各种藻类对营养的需要有很多共同点，所以一些培养液配方，能应用于多种藻类的培养。然而，藻类的不同种类，对营养的要求是有差别的，各有其特殊性，不同种类的培养液配方，当然也应该不同。只有较好地符合培养种类需要的配方，才可能获得较理想的效果。一个培养液配方的提出，首先必须了解这种藻类对营养的要求，要达到这一点，进行一系列的试验是必要的。还必须在使用中验证配方的效果，并在实践过程中不断总结经验，加以改进，使配方达到更理想的水平。本节内容分培养液成分、培养液配方和培养液的配制三部分。一、培养液成分单细胞藻类培养液的成分有下列七类。(一)大量元素1.氮(N)单胞藻培养液常用的氮源有硝酸钾(KNO3)、硝酸钠(NaNO3)、尿素(NH2CONH2)、硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钙［Ca(NO)3)2］、氯化铵(NH4C1)、硫酸铵［(NH4)2SO4］、发酵人尿……等。其中以硝酸钠和硝酸钾最常用。但不同的藻类对硝酸态氮和铵态氮的吸收利用情况是不同的，必须根据不同的藻类选择合适的氮源。2.磷(P)单胞藻培养液常用的磷源有磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸二氢钠、(NaH2PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)4种。海水单胞藻培养液应用磷酸二氢钾，如用磷酸氢二钾所配培养液会产生大量沉淀。3.铁(Fe)单胞藻培养液常用的铁源有三氯化铁(FeCb)、硫酸铁(FeSOJ、硫酸高铁［Fe2(SO4)3］、氧化铁(FeO)、柠檬酸铁(FeCeHsO?)、柠檬酸铁铵［Fe(NH4)3(C6H5O7)］等。其中最常用的是三氯化铁和柠檬酸铁。无机铁在水中容易形成一种胶体复合物，无可逆反应，不能为生物利用。铁也容易产生沉淀。所以尽管铁在数量上所需很少，但要满足藻类需要却很困难。要保持溶液中可利用态铁的数量，通常采用3种方法，这些方法都取得一定的成功，但都不够十分完善。在培养液内加入土壤抽出液：由于自然有机质(一般称为腐殖酸)的作用阻止了铁的沉淀和溶胶化(Pringsheim，1963)。在培养液内加入某种有机酸或其盐类以形成可溶性铁化合物：已证明较有效的有柠檬酸盐和酒石酸盐：迈尔(Myers，1947)证实应用硫酸铁和柠檬酸钠能使小球藻生长十分良好。⑶应用络合剂：最常用的为乙二胺四乙酸(EDTA)，络合剂能防止铁和微量营养元素沉淀，并按照质量作用定律释放出足够数量的离子供藻细胞利用。由于无机铁容易形成胶体复合物和沉淀，而有机铁，如柠檬酸铁、酒石酸铁等则是可溶性的，易为藻类细胞利用，在培养液配方中可使用有机态铁代替无机态铁。因藻类对铁元素需要量不大，也有部分科学工作者，把铁列为微量元素。钾(K)单胞藻培养液中钾的来源常用的有氯化钾(KCl)、硝酸钾(KNO3)、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾（K2HPO4）等。一般培养液中由于氮、磷元素的加入，也附带加入了钾营养元素。除此以外，可再加入氯化钾。镁（Mg）培养液中镁的来源，常用的是硫酸镁（MgSO4）和氯化镁（MgCl2）两种。可以镁元素在天然海水中的含量很大（1200mg/L以上），单独使用其中一种，也可两种同时使用。一般是足够的。①湛水101号培养液（湛江水产学院）NaNO30.03g维生素B1200⑷Co（NH2）20.03g维生素B12200m^gKH2PO40.005g人尿1.5mlFeC6H5O7（1%溶液）0.2ml海水1000ml培养绿藻类、金藻类、硅藻类……使用。在培养硅藻时应加入0.02g/L硅酸钠。②ASP2培养液[Provasoli,L.;McLaughlinJJ.A.;Droop,M.R.1957]:NaCl1.8gNnCl20.12mgMgSO4-7H2O0.5gCoCl20.3（jgKCl0.06gCuCl20.12gCaC1210.0mgH3BO30.6mgNaNO35.0mg维生素B120.1jgK2HPO40.5mg维生素溶液S（3参考第70页）1.0mlNa2SiO310H2O15mgNa2EDTA3.0mg三［羟甲基］氨基甲烷0.1mgFeCl30.08mg纯水100mlZnCl315旧pH7.6~7.8培养绿藻类、金藻类、蓝藻类、隐藻类、涡鞭藻类使用。2）绿藻培养液配方：NaNO30.1g2W3C6H5O711H2O0.02gKH2PO40.01gFe（SO4）3（1%溶液）10滴海水1000ml②亚心形扁藻培养液（湛江水产学院）：NaNO30.05g维生素B12200mjgKH2PO40.005g人尿2mlFeC6H5O7（1%溶液）0.2ml维生素B1200jg海水1000ml培养成亚心形扁藻及其他绿藻使用，多用于小型培养和中继培养，如能加入海泥抽出液①海洋三号扁藻培养液（海洋研究所,1960）：20ml，效果更好。③亚心形扁藻培养液（厦门水产学院）（NH4）2SO4200mg海泥抽出液V20ml（参考第60页）过磷酸钙30mg[Ca（H2PO4）2H2O+2（CaSO4H2O）]FeC6H5O7（1%溶液）0.5ml海水1000ml过磷酸钙溶液的配制：取含有效磷为16%的普通二级过磷酸钙配成3%的母液，过滤，使用时每1000ml海水加入1ml。培养过程中以追肥形式分2次加入0.2%人尿液效果更好。④布彻（Butcher）培养液［Butcher，（1959）］:NaNO30.1g土壤抽出液50mlK2HPO40.05g海水1000ml培养扁藻使用。⑤盐藻培养液:甲液:K2HPO40.05gNaCl5~10gFeC6H5O70.001g海水500ml海泥抽出液V（参考第60页)20~30ml乙液:海水500mlNaNO30.5g使用时，将甲、乙两液混合。如果再加入0.2%~0.3%人尿，效果更好。⑥赫特纳（Hutner）培养液［Hutner,S.H.（1950）］:NaCl0.25~4gK2HPO420mgMgSO47H2O0.25g醋酸钾0.2gCa(NO3)24H2O15mg甘氨酸0.25gEDTA0.05gZn3.0mgFe0.6mgCu0.5mgMn1.0mg纯水100mlMo1.0mgpH7.5培养盐藻使用。⑦赖瑟（Ryther）培养液［Ryther，J.（1954）］:NaCl2.67gNa3HPO412H2O2.0mgMgCl26H2O0.22gNa2SiO39H2O2.0mgMgSO47H2O0.32gNa2C6H5O72H2O0.02mgKCl73mgKBr5.8mgNaHCO320mgB1.0mgNH4Cl5.3mg纯水100mlCaCl2150mg培养微绿球藻和Stichococcus使用。⑨屋岛改良培养液（平田八郎，1980):过磷酸钙[Ca(H2PO4)2H2O]+2(CaSO4H2O)50g硫酸铵(NH4)2SO4300g海水1m3大量培养海产小球藻使用。（3）硅藻培养液配方:①艾伦—内尔森（Allen-Nelson）培养液[Allen,E.J.etal(1910)]:A.KNO320.2g纯水100mlB.Na2HPO412H2O4.0gCaCl26H2O4.0gHCl(浓)2.0ml纯水80mlFeCl32.0mlB液的配制法:先把氯化钙4g溶解于40ml纯水中。另外把磷酸氢二纳4g溶解40ml纯水中，再把三氯化铁溶融液2ml，缓慢滴入，摇动，产生白色沉淀，加热，缓滴入浓盐酸2ml，沉淀的白色沉淀即重新溶解。把以上两溶液混合。使用时，取A液2ml和B液1ml，加入1000ml海水中，充分混合后加热消毒，消后静置24h，然后将上层清液倒出使用。卢因（Lewin）培养液［Lewin,J.C.;Lewin,L.A.（1960）］:Ca（NO3）24H2O0.02gZn0.1mgK2HPO40.05gB0.1mgNa2SiO39H2O0.5mgCo0.1mg胰蛋白1.0gCu0.1mg维生素B121.0gMo0.1mgFe0.3mg海水1000ml③米奎尔（Miquel）培养液［Miquel,P.（1890~1893）］:A.MgSO410gKI0.2gNaCl10g纯水100mlNa2SO45gB.Na2HPO412H2O4gNH4NO31gCaCl26H2O4gKNO32gFeCl3（溶融）2mlNaNO32gHCL（浓）2mlKBr0.2g纯水80ml每1000ml海水加入A液2ml，B液1ml。④须藤培养液［须藤俊造（1959）］：NaCl24gNaHCO30.168gMgSO47H2O8gNa2SiO30.008gKCl0.7gP1（参考第70页）1mlCaCl22H2O0.37g维生素B120.02gNaNO30.1gNa2HPO412H2O0.125g纯水1000ml培养中肋骨条藻使用。⑤廖氏改良培养液转引自张立言等，1989）：KNO360mgNaSiO310mgNa2HPO412H2O10mg海水1000ml培养中胁骨条藻用。⑥中胁骨条藻培养液（厦门大学）KNO30.4gNaSiO30.02gNa2HPO412H2O0.04gFeSO47H2O0.014g土壤抽出液15ml4~5国际单位“920植”物生长刺激海水1000ml素⑦硅藻培养液（湛江水产学院）NaNO30.08g维生素B1200ggK2HPO40.008g维生素B12200mggFeC6H5O7（1%溶液）0.2ml人尿1.5mlNa2SiO30.02g海水1000ml培养三角褐指藻、小新月菱形藻、钙质角毛藻、牟氏角毛藻使用。⑧牟氏角毛藻培养液（黄海水产研究所）：NH4NO35~20mgFeQH5O73H2O0.5~2.0mgKH2PO40.5~1.0mg海水1000ml⑨小新月菱形藻培养液（朱树屏等，1964)：NO3—N4gFe(FeC6H5O73H2O)0.04gPO4—P0.4g海水1m3⑩赫特纳(Hutner)培养液[Hutner,S.H.(1948)]:NaCl0.2gMn0.05gMgS047H2O0.25gMo5.0gNH4NO350mgZn5.0ggCaC0314mgCu5.0ggK2HP0440mgB0．05ggNa2SiO39H2O5mg纯水100mlNa3C6H5072H20100mgFe0.5mgpH7.2~7.5培养三角褐指藻使用。（4）金藻培养液配方：①E—S培养液（Allen,M.B.）NaNO30.12g土壤抽出液1（参考第60页）50mlK2HPO40.001g海水1000ml培养等鞭藻Isochrysisgalbana使用。②F/2培养液(Guillardetal.,1962):NaNO374.8mgF/2微量元素溶液1ml（参考第70页）NaH2PO44.4mgF/2维生素溶液1ml（参考第71页）Na2SiO39H2O8.4~16.7mg海水1000ml小型培养金藻使用。③F/2改良培养液（厦门水产学院）NaNO374.8mg人尿1.5mlNaH2PO44.4mg海水1000ml海泥抽出液V（参20~60ml考第60页）生产性培养金藻使用。④等鞭藻OA—3011培养液（陈椒芬等，1987)：NaNO360mg维生素B120.5~1.5ggKN2PO44mg维生素B1100~500ggFeC6H5O70.5mgNaHCO31gNa2SiO35mg海水1000ml⑤湛水107—13培养液（湛江水产学院）NaNO380mg维生素B120.5~1.5ggK2HPO48mgNaHCO31gFeC6H5O7(1%溶液)0.2mg维生素B1200gg海水1000ml培养湛江等鞭藻、亚心形扁藻、钙质角毛藻使用。⑥湛水107—18培养液（湛江水产学院）NaNO350mg维生素B120.5~1.5g4K2HPO45mg人尿1.5mlFeC6H5O7(1%溶液)0.2mlNaHCO30.5g维生素B12004海水1000ml培养湛江等鞭藻、亚心形扁藻、钙质角毛藻使用。⑦等鞭藻9201培养液（周汝伦等，未发表）Co(NH2)230mg/L维生素B10.2mg/LNaNO330mg/L维生素B120.0005mg/lKH2PO48mg/LFeC6H5O70.5mg/L海水培养等鞭藻9201品系使用。⑧绿色巴夫藻培养液（陈椒芬，未发表）NaNO360g维生素B1100mgKH2PO44g维生素B120.5mgFeC6H5O70.5gNa2SiO39H2O5g海水1m3⑨异胶藻培养液I（陈世杰，1979)：(NH4)2SO410~20mgFeC6H5O70.1~0.2mgKH2PO41~2mg海水1000ml⑩异胶藻培养液n（陈世杰，1979)人尿3~5ml海水1000ml大量培养使用。2．淡水单胞藻培养液配方（1）一般用培养液配方：①朱氏10号培养液（朱树屏，1942）：Ca(NO3)20.04gNa2SiO30.025gK2HPO40.01~0.05gFeCl30.0008gMgSO47H2O0.025gNa2CO30.02g淡水1000ml培养浮游藻类使用，以海水代替淡水可用于培养海产藻类。②诺普(Knop)改良培养液[Pringsheim,E.G.(1949)]:KNO31.0gMgSO47H2O0.1gCa(NO3)20.1gFeCl30.001gK2HPO40.2g淡水1000ml（2）绿藻培养液配方：①水生4号培养液（黎尚豪等，1959）：(NH4)2SO40.2gKCl0.025g过磷酸钙0.03gFeSO4(1%溶液)0.15ml[Ca(H2PO4)2H2O+2(CaSO4H2O)]MgSO47H2O0.08g土壤抽出液W0.5ml（参考第60页）NaHCO30.10g淡水1000ml培养斜生栅藻（Seenodesmusobliquus）和蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidosa）使用。②水生6号培养液（黎尚豪等，1959）：NH2CONH20.133gFeSO4（1%溶液）0.200mlH2PO40.33mlCaCl20.030gMgSO47H2O0.100g土壤抽出液W0.500ml（参考第60页）NaHCO30.100gKCl0.033g淡水1000ml培养种类同水生成号，使用水生6号培养液培养，藻细胞生长繁殖比使用水生成号迅速。③布里斯托尔(Bristol)培养液[Bristol,B.M.(1920)]:NaNO30.5gNaCl0.05gKH2PO40.5gFeCl36H2O0.01gMgSO47H2O0.15gCaCl20.05g淡水1000ml培养绿藻类使用。（3）硅藻培养液配方：[76]，1975)：①水生硅1号培养液（水生生物研究所藻类研究室藻类应用组NH4NO3120mgNa2SiO3100mgMgSO47H2O70mgCaCl220mgK2HPO440mgNaCl10mgKH2PO480mgFeC6H5O75mgMnSO42mg淡水1000ml培养泉生偏缝藻（NitzschiafonticolaGrun.），椿状偏缝藻（NitzschiapaleaSmith）,双尖菱板藻（HantzschiaamphioxysGrun.），梅尼小环藻（CyclotellameneghinianaKutz.）使用。②水生硅2号培养液（水生生物研究所藻类研究室藻类应用组[76]，1975）：NH2CONH2150mgNaHCO3100mg过磷酸钙50mgMnSO43mg[Ca(H2PO4)2H2O+2(CaSO4H2OMgSO47H2O50mgEDTA-Fe1mlKCl30mg土壤抽出液W4ml（参考第60页）Na2SiO3100mg淡水1000ml培养种类同水生硅1号，大量培养使用。③福格(Fogg)培养液[Fogg,M.B.,(1956)]:Ca(NO3)20.8gNa2SiO30.025gK2HPO40.01gFeC6H5O70.0008gMgSO47H2O0.025g土壤抽出液I（参考第60页）20mlNa2CO30.02g纯水1000ml培养舟形藻(Nauiculapelliculosa使用)。（4）蓝藻培养液配方：①B.G.M.培养液(Allen,M.B.):KNO32.02gK2HPO40.35gMgSO47H2O2.46gA8（参考第70页）3.0mlNaCl2.30gCaCl20.07g纯水1000ml.K]rt.7{A^3^田培养一般蓝藻用。②扎鲁克（Zarrouk）培养液(PinnanSoong,1980):NaHCO316.8gCaCb•2H2O0.04gK2HPO40.5gFeSO4•7H2O0.01gNaNO30.2gEDTA0.08gK2SO41.0gA51mlNaCl1.0gB61mlMgSO4•7H2O0.2g淡水1000ml培养螺旋藻最广泛使用的配方。③CFTRI培养液（转引自何连金，1988)：NaHCO34.5gMgSO40.2gNaNO31.5gCaCl20.04gK2HPO40.5gFeSO40.01gK2SO41.0gNaCl1.0g淡水1000ml培养螺旋藻使用。④M—Ssl培养液（转引自何连金，1988)：NaHCO34gFeCl3（0.1%溶液）0.2mlNH2CONH20.25gKH2PO40.05g海水1000ml室内小水体培养螺旋藻使用。NaHCO32~4gFeCl3（0.1%溶液）0.2mlNH2CONH20.214gKH2PO40.042g海水1000ml室外大面积培养螺旋藻使用。3．微量元素溶液配方（1）A5-B6微量元素溶液[Holm-Hansen,O.,Gerloff,G.C.,Skoog,F.,(1954)]:A5B6H3BO32.86gNH4VO3229.6mgMnCI2•4H2O1.81gCr2k2(SO4)4•24H2O960.2mhgZnSO4•7H2O0.22gNiSO4•6H2O447.8mgCuSO4•5H2O0.08gCo(NO3)2•6H2O493.8mgNa2MoO40.021gNa2WO4•2H2O179.4mg纯水1000mlTi溶液20mlH2SO41滴1/20mol/LH2SO41000mlA6-B6微量元素溶液使用很广泛，A5单独使用的例子很多。钛（Ti）溶液配法：把草酸钛，溶解于小量纯水中，加入氢氧化铵使成碱性，发生沉淀。用离心法将沉淀集中，用736.6g/20mol/L的硫酸20ml溶解。用量：第1000ml培养液加入A5、B6溶液各1ml。2）普罗瓦索利的P8微量元素溶液（Provasolietal.,1957):羟乙基替乙二胺三醋酸CO(Cl)1mg脂钠3gCu(Cl)2mgFe(Cl)200mgB(H3BO3)200mgZn(Cl)50mgMo(MoO3)50mgMn(Cl)100mg纯水1000ml每1000ml培养液加入10ml。(3)M—F微量元素溶液[Miller,J.D.A.,Fogg,G.E.,(1957)]:B(H3BO3)0.2gCu(SO4)0.02gMn(Cl2)0.2gZn(SO4)0.02gMo(MoO3)0.2gCo(Cl2)0.02g纯水1000mlH2SO4(浓)1滴每1000ml培养液加入1ml。（4）Pi微量兀素溶液[Pinter,I.J.,Provasoli,L.,(1958)]：EDTA1.0gCo(Cl)0.001gZn(Cl)0.005gCu(Cl)0.00004gMn(Cl)0.04gFe(Cl)0.01g纯水1000ml每1000ml培养液加入30ml。(5)S—M微量元素溶液[Sorokin,C.;Myers,T.,(1957)]EDTA50gMoO30.7gB3BO311.4gCuSO4•5H2O1.6gZnS04•7H2O8.8gCo(NO3)2•6H2O0.5gMnCI2•4H2O1.0g纯水1000mI（6）“f/2”微量兀素溶液:ZnS04•4H2O23mgNa2MoO4•2H2O7.3mgMnCI2•4H2O178mgCoCI2•6H2O12mgCuSO4•5H2O10mgNa2EDTA4.35gFeC6H5O7•5H2O3.9g纯水1000mI每1000mI培养液加入1mI。(7)艾伦(AIIen)的As微量兀素溶液（AIIen,M.B.)：Fe0.4gMo(MoO3)0.001gMn(CI2)0.05gV0.001gZn(SO4)0.005gCo(NO3)0.001gCu(SO4)0.002gN/10H2SO4300mIB(H3BO3)0.05g每1000ml培养液加入3ml。4．维生素溶液配方(1)维生素溶液S3[Provasoli,L.,McLaughlin,J.J.A.,Droop,M.R.,(1957)]硫胺素盐酸盐0.05g肌醇0.5g尼古丁酸（烟酸）0.01g叶酸0.2Q泛酸钙0.01g胸（腺）间氮苯0.3g对氨安息香酸1.0g维生素H0.1g纯水1000mI每1000mI培养液加入1mI。(2)埃弗索尔(EversoIe)的维生素溶液[EversoIe,R.A.,(1956)]：硫胺素盐酸盐100mg盐酸胆碱200mg维生素B6醇75mg叶酸1mg泛酸钙200mg维生素H0.05mg双氨安息香酸5mg肌醇1000mg烟酸胺75mg纯水1000ml每1000ml培养液加入1ml。(3)“f/2”维生素溶液：维生素B120.5mg维生素H0.5mg维生素B1100mg纯水1000ml每1000ml培养液加入1ml。6．硫(S)培养液中硫的来源一般是加入其他营养元素的硫酸盐类(如硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁、硫酸高铁、硫酸锰、硫酸铜等)在获得其他营养元素的同时，也获得了硫元素。钙(Ca)培养液中钙的来源，常加入氯化钙(CaCI2)或硝酸钙［Ca(N03)2］。&硅(Si)在硅藻培养液中一般都加入硅元素，硅元素的来源，常用的是硅酸钠(Na2SO3)和硅酸钾(K2SiO3)。微量元素微量元素的种类很多，但单胞藻培养液配方中常用的约10余种。现将其名称及一般使用的化合物列举如下：硼(B)硼酸(H3BO3),焦性硼酸钠(Na2B4O7)。锰(Mn)硫酸锰(MnSO4)，氯化锰(MnCI2)。.锌(Zn)硫酸锌(ZnSO4),氯化锌(ZnCl2)。.铜(Cu)硫酸铜((ZuSO4),氯化铜(CuCl2)。钼(Mo)钼华(MoO3)，钼酸铵［(NH4)2O.7MoO3］。6.钴(Co)氯化钻(C0CI2)。钛(Ti)氯化钛(TiCl2)。钨(W)钨酸钠(Na2wO4)。铬(Cr)硫酸铬钾［CrK(SO4)2］，铬酸钾(K2CrO4)。镍(Ni)硫酸镍(NiSO4)。钒(V)钒酸钠(NaVO3)，钒酸铵(NH4VO3)。镉(CA)氯化镉(CdCl2)。锶(Sr)硫酸锶(SrSO4)。这些微量元素可以分开单项列于培养液配方中，也可以把微量元素集中配成微量元素溶液，然后按一定量加入培养液中。这些微量元素溶液有各种配方，一些常用配方将在第69〜70页介绍。藻类对微量元素的需要量和中毒量(致毒量)的差距一般很狭小，略微超过需要量即会引起中毒。微量元素也容易形成胶体复合物和发生沉淀，使藻类细胞不能利用。由于以上两种原因，致使在培养液中保持适量的微量元素是很困难的。络合剂的应用是解决以上困难的办法之一。良好的田园土壤抽出液一般含有藻类生长繁殖所需要的各种微量元素和溶解有机物质，且具有类似络合剂的作用。所以在培养液中加入土壤抽出液是解决微量元素供应的有效办法。辅助生长有机物质藻类除了必须吸收无机营养之外，也吸收水中的溶解有机物质，如维生素Bl、维生素B12、生物素……等，这些物质对藻类的生长有辅助作用，称为辅助生长有机物质。辅助生长有机物质能促进藻类细胞的生长繁殖，还能增强藻类细胞对环境的适应能力，因此受到重视，加入培养液中的辅助生长有机物质种类也愈来愈多。常用的有维生素B12、维生素B1（硫铵素）、维生素B2、维生素B6、维生素H、生物素、柠檬酸、乳精酸、烟酸，对氨安息香酸、叶酸、泛酸钙、肌醇、腐肉碱、胸（腺）间氮苯、葡萄糖、肝抽出物、酵母抽出物、贝肉汤、鱼粉、咸鱼汁等。辅助生长有机物质可以分别加入培养液中，也可以把多种辅助生长有机物质配成混合液，称维生素溶液，在配制培养液时按一定比例加入。土壤抽出液除含有无机微量元素外，还含有某些辅助生长有机物质。在培养液中加入土壤抽出液实际上加入了某些辅助生长有机物质。（四）土壤抽出液土壤抽出液含有单细胞藻类需要的微量元素和辅助生长有机物质，培养液中加入适量的土壤抽出液，一般能获得良好效果。土壤抽出液的制作虽然简单，但处理方法各有不同。现将常用的方法介绍如下。土壤抽出液I取土壤1kg，加纯水1000ml，煮沸60min，在暗处放置2d,过滤，以滤液600ml加纯水400ml使用。土壤抽出液n取土壤1kg,加纯水1000ml,再加入氢氧化钠2〜3g,煮沸120min,冷却后过滤，滤液直接使用。土壤抽出液川取土壤1kg，加自来水2000ml，煮沸煎浓，把上部泥浆倾入烧杯中澄清，静置一昼夜后，次日吸取上层清液，再煮沸煎浓。第3天再如法煎煮，最后倾入三角烧瓶中,加棉花塞,煎浓,直至得到l000ml的深褐色的土壤抽出液。每次使用后,煮沸灭菌保存（朱树屏,1964.）。土壤抽出液W取田园土壤1kg，加水2000ml，搅拌均匀，浸泡，用前吸取上清液，煮沸消毒后使用（黎尚豪等,1959）。海泥（或土壤）抽出液V取海滩上砂质较少,有机质较多而又不是过分淤黑的上层软泥（或田园土壤）,清除其中的小树枝和小石块等杂物,以容量计算1份泥加2份水,充分搅拌均匀，静置I〜2min，待粗砂、小石下沉，把上层泥浆倾人铝锅中，弃去底部粗砂、小石等杂物，按每1000ml泥浆加入NaOH1g的量加入NaOH，煮沸20〜30min，煮时需不断搅拌。煮后静置24h,吸取上清液使用。海泥抽出液吸出后，除当天使用外，可以装入大烧瓶中再经煮沸1〜2次（每天1次）,可作较长时间的保存,使用时再经煮沸。不同地点取的土壤或海泥制成的土壤抽出液或海泥抽出液的营养成分和数量是不相同的,这是由于不同地点的土壤或海泥所含物质的成分和数量存在着差别的缘故。因此在取用土壤或海泥时,必须固定地方,不要经常变换,对其培养效果及合适的使用量,均应通过培养试验,了解掌握。（五）络合剂无机态铁和微量金属元素容易形成胶体复合物和发生沉淀,不能为藻类利用。为了防止这些元素溶胶化和沉淀的发生,保持其对藻类的可利用态,以维持在培养液中的适量存在,哈特纳（Hutnei,1950）首先应用了称为络合剂的化合物。迈尔（Myers,1951）在培养小球藻中成功地使用了EDTA。其后，在许多培养液配方中，都有络合物的使用。最常用的络合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，此外还有亚硝基R盐、三价氮基三醋酸(NTA)、羟基乙基乙烯二胺三醋酸(HOEDTA)等。络合剂，本质上相当于环状有机化合物这一类，非常稳定，应用一定数量的络合剂，可以防止铁和微量元素的沉淀和溶胶化，并能根据质量作用定律释放出足量的离子供藻类细并能使元素的量达到比藻类胞利用，能够大大地减少对藻类供应适量铁和微量元素的困难,所能忍受的较高的浓度。(M.R.Droop,1969)。有促进藻类细胞生长繁殖的生(1986;1989)在亚心但也有关于应用络合剂后，引起某些金属元素缺乏的报道植物生长调节剂植物生长调节剂又称植物生长激素，作用。在培养液中加入某些植物生长调节剂，增产效果明显。向曙光等形扁藻的培养液中加入30〜50mg/L增产灵，净增产率为60%〜70%。又加入40rng/L乙烯利，净增产率为56%[87]。徐淑凤等(1987)培养底栖硅藻，在培养液中添加0.5mg/L的:-夸乙酸钠，对底栖硅藻的生长繁殖具有明显的促进作用[85]。缓冲剂在培养液中加入缓冲剂，可加强缓冲作用。常用的缓冲剂有三羟甲基氨基甲烷和二甘氨酸。以上介绍了培养液的成分，共七类。但不是说单胞藻培养液都必须具备这七类成分。其中最重要而且是必不可少的是大量元素，其次是微量元素和辅助生长有机物质，其他成分只在某些培养液配方中使用其中的一类或两类。二、培养液配方用纯水配制的培养液在实验室进行藻类植物的培养研究或其他生理、生化研究时，必须使用纯水配制培养液，并使用纯度较高的A.R.级或C.P.级化学试剂。这样，培养液中营养元素的种类和数量才能比较准确地在人为控制之下。较理想的纯水，是使用离子交换树脂处理的无离子水，用这种无离子水做微量元素的研究，证明是有效的。通过蒸馏取得的蒸馏水，无论蒸馏器是金属或玻璃的，在蒸馏水流过蒸馏器时，可能带有少量的微量元素。因此，在许多微量元素研究中不宜采用。用纯水配制培养液，营养元素的种类必须全面，使用的化合物也较多。一些科学工作者还根据天然海水的化学成分，在纯水中加入无机化合物配成人工海水，应用于海洋生物的研究。用天然淡、海水配制的培养液一般单胞藻饵料培养和以生产有机物质为目的的生产性培养都使用天然淡、海水配制培养液。天然淡、海水是水生生物长期适应于其中生活的优良环境，已存在着植物必须吸收的各种营养物质，所以在配制培养液时只需要增加某些在培养中可能引起缺乏的营养元素就成了。尤其是大量生产中，往往只加入最主要的几种营养元素，也不必要求采用纯度较高的化学试剂，可使用工业纯和农肥。常用单胞藻培养液配方国外使用的单胞藻培养液配方，数量众多。田宫博和渡边笃(1965)编著的《藻类实验法》和金尼[KinneO.(1976)]编著的《海洋生态学》(MARINEECOLOGY)第三卷，第一部分等专著已有较系统的介绍。在此，只重点介绍在国内较常用的培养液配方，也介绍一些国外配方供参考。1.海产单胞藻培养液配方(1)一般用培养液配方：培养液的配制培养液是根据培养液配方配制的。为了减少每次称量的麻烦，固体的营养元素一般都配成母液，在使用时，只要吸取一定的量加入培养液-中即成。主要营养元素可以单项营养元素配成母液，也可以分成若干组，每组2种或多种营养元素同配在一起。微量元素和辅助生长有机物质也多种组合在一起，配成母液。在浓营养溶液中一般生物因不能忍受而死亡。如果配制培养液的海水或淡水是采取常压加热消毒的，应在消毒后，待冷，在接种前再加入营养物质。因为有些营养物质（特别是有机物质）和海水一起加热消毒时，常发生沉淀。各种（组）营养物质可以单独消毒，如果营养物质是洁净的，在配制时，只要把容器消毒好，使用蒸馏水或无离子水作溶剂，则可以不用消毒。营养元素的加入，应该有一定顺序。如先加氮，再加磷，后加铁一…•等。每加入一种（或一组）营养物，搅拌均匀，再加第二种。经试验和使用过，比较成熟的培养液配方配成的培养液，其RE一般是适合的。但研究和使用新的配方，配好培养液后，应测定RH。如需要，可用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠调节。天然海水的RH为8.2〜8.4,而培养液的RE一般调节至7.5左右。第七节藻种的分离、培养和保藏方法单细胞藻类的培养，首先需要有藻种。藻种是从哪里来的呢？原始的藻种是从天然水域混杂的生物群中，运用一定的方法，把所需要的藻类个体分离出来，获得单种培养的。获得单种培养的藻种，经培养和保藏而长期保存下来，供培养使用。本节介绍藻种的分离、培养和保藏方法。一、藻种的分离（一）采样分离藻种，首先要采集生长有需要分离的藻类的水样。个体较大的浮游藻类，可用密浮游生物网在水中捞取。通过浮游生物网的过滤，可获得数量很大的藻类样品。但在水产动物的人工育苗中所需要的饵料藻类，一般是个体很小的几」m到十几」m的微型藻类，用浮游生物网无法采集到，需要把水样采回室内处理。水样可取白天然水域，无论是开敞的水面或小港湾都可以采水。但应特别注意海岸上存留下来的小水洼，这些小水洼可能只在大潮时有海水淹没，有一短段时间和大海隔绝，盐度略高于当地海区海水，尤其在盐场地区存在甚多。在这些小水洼中，往往生长有适于静水体培养的藻类，且种类比较单纯，一种或数种藻类占优势，容易分离。还有，培养水生生物的或储水的各种容器、水池，均可能生长大量浮游或附着藻类，也是采样的理想场所。如要分离底栖性微型硅藻，可刮取潮间带的“油泥”，加海水搅拌后，弃去沉淀的泥砂，用密筛绢滤除大型藻类和杂质，即获得藻细胞浓度很高的水样。也可以把附着在大型藻类（如马尾藻等）藻体上或其他附着物上的附着藻类洗刷下来作为分离的水样。水样采回来后，进行显微镜检查，如果发现有需要分离的藻种，而这种藻类在水样中数量较多时，可立即进行分离。若数量很少，分离困难时，必须先进行预备培养，待其数量增多后再分离。（二）预备培养用作预备培养的培养液，各大类藻类应该是不同的，一般绿藻、硅藻和金藻的培养液比较现成。对一些难以培养的藻类，最好加入土壤抽出液。预备培养的培养液的营养浓度应低些，一般只用原配方的1/2、1/3或1/4。如果水样中藻类的种类较多，就应使用几种不同的培养液，使各种不同的藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。因此，为了培养好各种藻类，有必要准备各种适宜的培养液，特别是对于不容易得到的贵重的样品，应该使用多种预备培养液培养。预备培养的容器，通常用3300ml容量的三角烧瓶。在瓶中加入100ml培养液，把经密筛绢过滤除去大型生物的水样50cm3接种进去，放在室内靠北面的窗口下培养。在分离浮游种类的预备培养过程中，应该每天摇动一次培养容器。但在分离附着种类时，容器可静止不动。因为藻类种类不同，产生特有的藻群，在培养中往往有单一的藻类集群，这些藻群吸移出来，有可能获得单种，或虽然达不到单种，由于混杂的生物数量少，分离容易。有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。在此情况下，改变培养液的浓度；加入葡萄糖、蛋白胨等有机物；补充微量元素和辅助生长有机物质；加入土壤抽出液，有可能获得较好的效果。在预备培养过程中，要经常观察。如发现培养液呈现出淡淡的颜色，即进行显微镜检查。如果是需要分离的藻类，数量占优势，应立即进行分离。如果没有需要分离的藻类，或者有需要分离的藻类，但数量不占优势，分离有困难时，可再培养一段时间，等待优势种发生交替。或者再接种到不同的培养液中培养，有可能在新的培养液中容易形成优势。总的来说，在预备培养中，要勤观察，勤检查，掌握时机，及时分离。经过预备培养占优势的种类，分离容易。也适合于在小型静水体中生长繁殖。（三）分离方法单细胞藻类单种的分离方法，常用的有下列3种。1．微吸管分离法选直径约5ram的细玻璃管，在酒精喷灯上加热，待熔，快速拉成口径极细的微吸管。微吸管的另一端套接1条长约30cm（长）或8cm（短）的医用乳胶管，在分离操作时长乳胶管的另一一一端用牙齿咬紧，如果用短乳胶管则用手指压紧，用以控制吸取动作。将稀释的水样，置浅凹载玻片上，在显微镜下观察、挑选要分离的藻细胞，吸取时把微吸管口对准藻细胞，牙齿或手指放松，由于气流的关系，藻细胞被微吸管吸入。接着把吸出的水滴放在另一凹玻片上．，显微镜检查这一滴水中是否只有吸出的藻细胞，无其他生物混杂。如不成，再反复做，直至达到单种分离的目的。然后把分离出的藻细胞移入预先装有培养液的试管中，管口塞上棉塞，在适宜的光照条件下培养。每天轻轻摇动1次，待培养液呈现出藻色，再经显微镜检查，如无其他生物混杂，才达到分离的目的。微吸管分离法操作技术难度大，往往吸取1个细胞要反复几次至十几次才能成功。而且适宜手分离个体较大的藻类和其他浮游生物，较小的藻类用此法分离较为困难。2．水滴分离法选直径约5mm的细玻璃管，拉制成全长约8cm的短微吸管5支。另取载玻片30〜50块、试管10-20支、小烧杯2-3只和吸管2支，洗刷清洁后用布抹干，置恒温烘箱消毒备用。选择微吸管（无吸管橡皮帽）1支，插入水样中约2cm，提起微吸管，待无水滴自然滴下，此时微吸管内尚有少量水样，把微吸管口与载玻片接触，即有一小滴水样留在载玻片上。水滴大小以在显微镜低倍镜视野中能看到水滴的全部或大部为准。如果所选微吸管不理想，另选1支，直到合乎要求为止。把水样倒入小烧杯中，用培养液稀释至每一小水滴约有生物1个左右．（也可能有2个，也可能1个没有）。用微吸管吸取水样按上述方法滴到载玻片上，一载玻片滴上水滴3〜4滴，水滴作直线排列，互相间隔一定距离。然后在显微镜下观察每个水滴，如果某一水滴内只有1个需要分离的藻类细胞，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液把水滴连同在水滴中的藻细胞冲人试管中去，并加入培养液达到试管容量的1/4，试管口塞上棉花塞，放在适宜的光照条件下培养，每天轻轻摇动试管1次6至试管中的培养液呈现出藻色，经显微镜检查是否达到单种分离的目的。一般分离1种藻类，须同时分离10支试管，通常在10支试管中总有1-2支试管分离成功，获得单种培养。水滴分离法在技术上要求水滴大小符合，水样稀释适宜、动作迅速和观察准确。水滴分离法，方法简便，易行。尤其适宜于分离已在培养液中占优势的种类。3．平板分离法（1）平板培养基的制备：调配：按分离种类的需要，选用合适的无机肥配方配成培养液，加入1％〜1.5％琼胶（先把琼胶剪成短段，在淡水中浸泡12h）。融化：把培养液加热，不断搅拌，使琼胶全部融化。在加热过程中，水分蒸发，在加热完毕时加入淡水补足因蒸发损失的水分。分装：稍冷后即分装于培养皿中，培养基厚度约0.5cm左右。灭菌：采用高压蒸汽灭菌法或间歇蒸汽灭菌法灭菌。平板培养基灭菌后，平放，待冷，培养基凝固成固体状态。（2）平板分离方法：平板分离方法有喷雾法和划线法两种。喷雾法：首先用经煮沸消毒的海水把水样稀释到合适的程度，装入消毒过的医用喉头喷雾器中，打开培养皿盖，把水样喷射在培养基平面上，使水样在培养基平面上形成分布均匀的一薄层水珠。水样稀释到合适的程度是指水样喷射在培养基平面上必须相隔lcm以上才有1个生物（或1个藻类细胞），将来生长繁殖成一藻群后容易分离取出。稀释不够，将来生成的藻细胞群距离太近，不容易分离。划线法：水样不用稀释，取一金属接种环在酒精灯火焰上灭菌后，蘸取水样轻轻在培养基平面上做第一次平行划线3〜4条，转动培养皿约70。角，把接种环在火焰上灭菌，通过第一次划线区做第二次平行划线。同样方法通过第二次划线区做第三次划线。再做第四次划线。由于蘸到接种环上细胞较多，在第一划线区，藻细胞群密集分离不开，但在第三、第四划线区，可能分离出孤立的藻类群落。喷射或划线接种后，盖上培养皿盖子，放在适宜的光照条件下培养。一般经过20d左右的培养，就可以在培养基平面上生长出互相隔离的藻类群落。通过显微镜检查，寻找需要分离的藻类群落，然后用消毒过的纤细解剖针或玻璃微针把藻细胞群连同一小块培养基取出，移入装有培养液的试管或小三角烧瓶中，加棉花塞，在适宜光照的条件下培养。培养中每天轻轻摇动1〜2次，摇动时避免培养液沾湿棉花塞。经过一段时间培养，藻类生长繁殖数量增多，再经一次显微镜检查，如无其他生物混杂，才达到单种培养的目的。如还有其他生物混杂，则再分离，直到获得单种培养为止。二、藻种的培养获得单种培养后，一方面扩大培养，供应试验和生产使用。另一方面可把藻种作较长时间的保藏，需要时可随时取出使用。藻种的培养要求比较严格。常用各种不同大小的三角烧瓶为培养容器，容量有100cm3、300cm3、500cm3、1000cm3等。培养容器、工具经恒温烘箱高温消毒。培养液用加热法消毒。接种后瓶口用消毒过的纸包扎。放在适宜的光照条件下培养，每天轻轻摇动两次。大约2周进行1次移养。藻种在培养过程中必须定期进行显微镜检查，保持单种培养。三、藻种的保藏单种分离是不容易的，要花费不少精力_和时间。一旦得到了单种，就要设法把它长期保存下来。藻种的保藏方法，通常是把藻种接种在固体和液体双相培养基上，在低温、弱光条件下培养，接种一次可保藏半年到一年。（一）固体培养基的制备固体培养基（即平板培养基），作为保藏藻种用的固体培养基的营养浓度应按配方增加1倍。保种用的容器有试管、三角烧瓶、克氏扁瓶……等，以500cm3容量的三角烧瓶和试管最常用。试管的培养基的分装量约为试管长的1/4，三角烧瓶的培养基的分装厚度约为0.8〜1cm。分装时应防止培养基沾在管口或瓶口上。分装后试管口和瓶口须塞上棉花塞，再用纸包扎。培养基经高压蒸汽灭菌后，取出，试管应倾置成斜面，三角烧瓶则平放，待冷，即成固体培养基。（二）接种保藏的藻种，可接种在固体培养基上。把试管的包扎纸和棉塞取下，用灭菌的接种环蘸取藻液在培养基斜面上作“之"字形划线接种，再把棉塞塞好，绑紧包扎纸。三角烧瓶和克氏扁瓶可用喷雾法接种，利用医用喉头喷雾器把藻液均匀喷射在培养基平面上。保藏的藻种，也可以在固体培养基上再加上培养液然后接种，称双相培养基。此法使用三角烧瓶为容器最理想，在固体培养基上加入比固体培养基体积多2倍的培养液，然后接种少量藻液。利用双相培养基保藏藻种，可避免固体培养基因水分蒸发而干涸的问题，保藏效果比单用固体培养基好，为通常采用的方法。（三）培养和保藏单用固体培养基保藏的藻种，接种后首先放在适宜的光照条件下培养，待藻细胞生长繁殖达到较高的密度，在平板上可看到藻色明显的条状或块状的藻细胞群，再移置低温、弱光的条件下保藏。双相培养基保藏的藻种，接种后可直接移置低温、弱光的条件下保藏，也可在适宜的光照条件下培养3〜4d后再移置低温、弱光的条件下保藏。低温、弱光的条件，通常是指放在冰箱内，温度控制在5〜8C之间，冰箱内装1支8W的日光管，开关设在冰箱外，每天照明I〜2h,也可长期连续照明。藻种保藏的目的是使藻种能在较长的时间保存下来。因此，藻种必须在低温、弱光的条件下培养，使藻细胞在培养基上慢慢生长繁殖，让培养基的营养慢慢地消耗。在此，应特别强调，藻种保藏不能没有光。在弱光的条件下保藏培养，可保存半年到1年，甚至2年以上。但如果不给予光照，保存在完全黑暗的条件下，则保藏时间大大缩短，且藻细胞“老化”。第八节敌害生物的防治在单细胞藻类培养过程中，常会发生敌害生物污染。污染的敌害生物对培养藻类的危害是十分严重的，常常使培养归于失败。敌害生物的污染和危害是造成当前单胞藻培养不稳定的主要原因。敌害生物的防治问题，目前还没有彻底解决。本节内容分敌害生物对单细胞藻类的危害作用、敌害生物污染的途径和防治措施三部分。一、敌害生物对单细胞藻类的危害作用（一）掠食一些较大型的敌害生物，如轮虫（Rotifer）、游仆虫（Euplotessp.）、尖鼻虫（Oxyrrhissp.）、变形虫（Amoebaspp.）等，直接吞食藻细胞。由于藻细胞生长繁殖速度快，如果敌害生物的数量不多，吞食量不大，影响并不显著。但当敌害生物繁殖数量多后，吞食量也增大，则对藻类产生严重的影响。尤其是轮虫的吞食量达到惊人的程度，在二三天内可以把藻细胞吃光，使藻液变清。（二）通过分泌有害物质对单胞藻起抑制和毒害作用敌害生物通过必泌某些有害的胞外产物对藻细胞产生抑制和毒害作用，是敌害生物对培养藻类危害的又一方面，它往往比直接吞食的危害程度要严重得多。当敌害生物分泌的有害物质还较少时，培养藻类表现为生长繁殖缓慢。当敌害生物繁殖数量较大，分泌的有害物质多时，即造成藻细胞大量下沉死亡。敌害生物分泌的有害物质对培养藻类的毒性大小，依不同种类而异。一种敌害生物对藻类的危害作用，可能是一方面的，也可能同时具有两个方面的危害作用。二、敌害生物污染的途径在单细胞藻类培养生产中，敌害生物可以通过下列途径污染。（一）水天然水中生活着种类繁多的生物。在单胞藻培养过程中，配制培养液的淡水和海水以及清洗消毒后的容器和工具的用水，如果不经过有效的处理或处理不彻底，不能把水中的生物除去或杀死，就会造成敌害生物的污染。从水这一途径污染敌害生物，往往污染生物的数量大，在较短的时间内即能对培养藻类产生严重的危害。目前我国在单胞藻培养生产中，藻种培养与小型培养用加热法消毒水是有效的。但也不能忽视，如果加热温度不够或持续时间不够，都可能达不到消毒目的。在大量培养中，水经砂过滤后用次氯酸钠处理或用陶瓷过滤罐作第二次过滤处理都是有效的。但应用次氯酸钠处理水，不测定次氯酸钠的有效氯含量以及处理时间不够；应用陶瓷过滤罐，也可能因滤棒破裂，安装不严，拆洗时棒及罐内部冲洗消毒不够。以上种种原因都可能造成消毒不彻底，而导致敌害生物污染。目前还有一些单位习惯使用砂滤池过滤水培养单胞藻，砂滤池对大小在15」m以下的微生物无法隔除，生物污染无法避免。（二）空气微生物通过空气污染是经常发生的，而且难以避免。开放式培养，藻液和空气的接触面大。通气培养，大量的空气进入藻液中。一些2〜大小的微生物（其中多数是单细胞绿藻类），可以借风力随尘土在空气中飞扬而污染藻液。目前还没有防止微生物从空气污染的有效方法。（三）容器、工具容器和工具消毒不彻底，引起敌害生物污染。（四）肥料肥料不清洁，消毒不干净，弓I起敌害生物污染。（五）昆虫蚊子在培养池中产卵以及水生昆虫侵入培养池，都