菌种鉴定实验过程

一、仪器与试剂1、仪器仪器名称仪器来源型号测序仪AppliedBiosystems3730XLDNA电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN稳压电泳仪北京六一仪器厂DYY-5电热恒温水槽上海一恒科学仪器有限公司DK-8D凝胶成像仪上海复日科技仪器有限公司FR980恒温培养箱太仓市科教器材厂DHP-9162恒温摇床太仓市实验设备厂TH2-CPCR仪AppliedBiosystems2720thermalcycler冷冻高速离心机BBIHC-2518RSurf系列精密单道可调移液器生工SP10-10001.试剂试剂名称试剂来源cat.No.Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8255Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒生工SK8259Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒生工SK8257DreamTaq-TMDNAPolymeraseMBIEP0702dNTP生工D0056琼脂糖BBIAB0014SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒生工SK8131DNALadderMixmaker生工SM0337引物生工合成部合成枪头、PCR管、离心管等生工铸塑部生产克隆测序用pMD®18-TVector连接试剂盒TakaraD101ASanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒生工SK8191二、实验过程1、基因组DNA提取按SK8255（细菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）试剂盒操作。2、PCR扩增2.1菌种鉴定通用引物：所属类别名称序列5'→3'扩增序列PCR长度/bp细菌7F1540RCAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA16SrDNA1500bp左右27F1492RAGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT16SrDNA1500bp左右真菌ITS1ITS4TCCGTAGGTGAACCTGCGGTCCTCCGCTTATTGATATGC内转录间隔区1和2600bp左右NS1NS6GTAGTCATATGCTTGTCTCGCATCACAGACCTGTTATTGCCTC18SrDNA1300bp左右酵母菌NL1NL4GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGGGTCCGTGTTTCAAGACGG26SrDNAD1/D2区500bp左右2.2 PCR反应体系：试剂体积（μl）Template（基因组DNA20-50ng/μl）0.510×Buffer（withMg2）2.5dNTP（各2.5mM）1酶0.2F（10uM）0.5R（10uM）0.5加双蒸H2O至252.3 PCR循环条件：温度时间程序94℃4min预变性94℃45sec30cycle55℃45sec72℃1min72℃10min修复延伸4℃∞终止反应3、凝胶电泳1％琼脂糖电泳，150V、100mA20min电泳观察（见电泳图DNALadderMixmake）。16SrDNA   18SrDNA    ITS     26S4、纯化回收PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，纯化方式见附见说明书（SK8131），PCR产物用PCR引物直接测序。如需要做克隆测序需要进行下面的步骤：5、连接按TakarapMD®18-TVector连接试剂盒操作。6、感受态细胞的制备：（氯化钙法）6.1从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)。6.2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。6.3于4℃,以4000转／分离心10分钟，回收细胞。6.4倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。6.5以10ml用冰预冷的0.1mol／LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。6.6于4℃,，以4000转／分离心10分钟，回收细胞。6.7倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。6.8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2(含20%甘油)重悬每份细胞沉淀。6.9将细胞分装成小份(100µl/支)，放于-70℃冻存。7、连接产物转化7.1取100l感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。7.2加入10l连接液，轻轻混匀。冰上放置30分钟。7.342℃水浴热激90秒。冰上放置15~20分钟。7.4加400lLB培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时。7.5用枪头吸取200l培养菌液，涂布在预先用20l100mMIPTG和100l20mg/mlX-gal涂布的氨苄青霉素平板上。7.6平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。8、蓝白斑筛选当外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物半乳糖苷酶片段的活性，因此重组克隆在X-gal/IPTG平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色，选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，9、质粒提取与测序用M13_引物扩增（体系如上）。.M13/-引物测序三、测序结果分析16SrDNA序列在核糖体数据库上比对；比对结果范例：domain Bacteria (0/20/1186838)（界）phylum "Actinobacteria" (0/20/176308)（门）class Actinobacteria (0/20/176308)（纲）subclass Actinobacteridae (0/20/167455)（亚纲）order Actinomycetales (0/20/166237)（目）suborder Streptomycineae (0/20/10027)（亚目）family Streptomycetaceae (0/20/10027)（科）genus Streptomyces (0/20/9681)（属）S000691624  not_calculated 0.995 1242 Streptomycessp.a16;DQ513513按Ctrl并单击可访问连接 匹配程度 被匹配菌登录序列长度 NCBI上登录号访问18SrDNA、ITS、26S在NCBI上blast比对；结果解释：