七叶皂苷钠抑制急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株增殖的机制研究

七叶皂苷钠抑制急性T淋巴细胞白 血病Jurkat细胞株增殖的机制研究 开题 前言 选题依据及意义 国内外研究进展 研究目标和内容 研究方法和路线 已完成工作 创新之处 年度研究计划 参考文献 前言 七叶皂苷钠是从七叶树科植物天师栗干燥成熟果实娑罗子中提取的三萜皂苷钠盐，结构式如下： 七叶皂苷钠具有抗渗出及增加静脉张力的作用，在临床上用于： 1、治疗脑水肿、创伤或手术所致肿胀 2、治疗静脉回流障碍性疾病 3、治疗其它渗出性疾病、非感染性炎症 本研究所用七叶皂苷钠购自山东绿叶制药有限公司，产品批号ZL-09010A,七叶皂苷钠含量为99.24%，其中含A:33.0%、B27.6%、C:17.7%、D:11.8% 急性淋巴细胞白血病（ALL）以儿童多见，美国统计资料显示75%的患者小于15岁，发病高峰在3～7岁，10岁以后发病率随年龄增长逐渐下降，但大于50岁的成年人发病率又略有上升。通常男性比女性稍多见。 小儿白血病95%为急性，70-85%为急性淋巴细胞白血病。 急性淋巴细胞白血病的治疗： 联合化疗是白血病治疗的核心，并贯彻治疗的始终。 对于常规化疗失败的病人，异基因造血干细胞移植是主要治疗手段。 干细胞移植由于来源有限，移植过程中并发症如移植物抗宿主疾病等致移植失败、移植后复发、费用昂贵等，使其应用受到一定的限制。 选题依据及意义 目前西医治疗白血病的手段普遍短期效果明显，而远期疗效差，治疗效果不稳定是其明显不足，从中长期看疾病仍严重威胁患者的生命。 西医主要难点： 1、如何减少复发，如何延长生存期？ 2、如何防治耐药性及毒副作用？ 中医药的参与可提高传统治疗效果，保障治疗的持续化，尤其使远期效果更加有保障。 中医药对策： 1、解毒抗癌调节免疫，消除微小残留白血 病细胞，减少复发。 2、充分发挥中草药拮抗作用逆转多药耐药。 中西医结合治疗白血病的优点在于： 　　1 、减轻化疗药物的毒性。 　　2 、促进造血功能回复。 　　3 、促进免疫功能的恢复。 4 、改善患者生命质量。 近年来随着中药现代化、国际化战略目标的确立，从中草药中开发抗肿瘤新药已成为抗肿瘤研究的热点领域。 七叶皂苷钠作为一种中草药制剂，符合未来用药趋势。 七叶皂苷钠已经在临床上得到广泛应用，安全性已得到认可。 我们前期的实验结果证明七叶皂苷钠对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株的增殖具有抑制作用，而对正常人胚肾HEK-293细胞无抑制作用。 Jurkat细胞 肝癌HepG2细胞 人胚肾HEK-293细胞 卵巢癌SK-OV-3细胞 乳腺癌MDA-MB-231细胞 胰腺癌PANC-1细胞 非小细胞肺癌A549细胞 国内外研究进展 目前国内外对七叶皂苷钠的研究主要集中于其治疗水肿、血肿，以及治疗静脉疾病方面。 七叶皂苷钠的抗肿瘤作用则鲜有报道。 Xue-ying Zhou等报道七叶皂苷钠可诱导肝癌细胞株HepG2凋亡，并将其阻滞在G1/S检验点。在这一过程中cyclinE/CDK2、pRb、E2F的表达量下降。七叶皂苷钠诱导HepG2凋亡的途径和经典凋亡途径不同，该途径依赖线粒体，却不依赖caspase, 在凋亡中AIF和细胞色素c从线粒体转位到细胞核，而不在胞浆中积累。 研究目标和内容 本研究将分别从分子水平、细胞水平、整体动物水平研究七叶皂苷钠抑制急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株的作用机制。 旨在通过对七叶皂苷钠抗T淋巴细胞白血病作用的研究，为开发七叶皂苷钠成为治疗白血病新药提供理论和实验依据，并为寻找、发现和合成新型抗癌先导化合物提供有用线索。 研究方法和路线 1、体外实验 MTT法 流式细胞分析 western blot 2、体内实验 裸鼠人JurkatT淋巴细胞白血病模型 MTT PI染色流式细胞仪分析 细胞周期阻滞 S期 G2/M期 检测凋亡指标 诱导凋亡 G0/G1期 DNA Ladder Hoechst33258 FITC-Annexin V/PI Caspase3,8,9 内源途径 线粒体膜电位 细胞色素C 促凋亡蛋白 抗凋亡蛋白 死亡受体 外源途径 Jurkat细胞悬液接种裸鼠背部皮下 移植瘤结节约10×10mm3 对照组 七叶皂苷钠组 阿糖胞苷组 4周后 瘤重 两侧大腿股骨的骨髓细胞 提DNA 检测人Alu序列 移植瘤组织 HE染色 抑瘤率 瘤细胞坏死情况 免疫组化 抑瘤机制 Jurkat细胞在裸鼠中的浸润情况 每天观察活动情况 每周测体重、瘤体大小 已完成工作 1、MTT法检测不同肿瘤细胞株对七叶皂苷钠的敏感性，发现七叶皂苷钠对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞株的体外增殖具有时间依赖、浓度依赖的抑制作用。 2、实验证明七叶皂苷钠对人胚肾HEK-293细胞株无抑制作用。 创新之处 七叶皂苷钠的抗肿瘤作用最近才被发现，有关七叶皂苷钠抗急性T淋巴细胞白血病的作用尚未见报道。 本课题拟通过细胞药效学研究、整体动物药效学研究和分子作用机理研究，为开发七叶皂苷钠成为抗白血病新药提供理论基础和实验依据，具有开创性意义。 年度研究计划 研究生一上学期：专业课的理论学习； 研究生一年级下学期：阅读大量的专业文献，学习细胞培养等相关技术； 研究生二年级上学期 ：完成MTT实验，流式细胞分析，凋亡指标的检测，以及一部分western blot实验； 研究生二年级下学期 ：完成体外实验，并完成文章一篇； 研究生三年级上学期 ：完成体内实验，并完成文章一篇； 研究生三年级下学期 ：撰写毕业，准备答辩。 参考文献 1 Zhou X , Fu F , Zhen L , et al. Escin, a natural mixture of triterpene saponins exhibits antitumor activity against hepatoecellular carcinoma[J]. Planta Med , 2009 , 103 ( 2 ) : 679-688. 2 Oh J , Lee T , Kim S ,et al. Induction of apoptosis by withaferin A in human leukemia U937 cells through down-regulation of Akt phosphorylation[J]. Apoptosis , 2008 , 13 : 1494–1504. 3 Catherine G , Sinead W , Colm M , et al. Resveratrol sensitizes androgen independent Prostate cancer cells to death-receptor mediated apoptosis through multiple mechanisms[J]. 2007 , 67 : 1641-1653. 4 Sven B , Stefanie F , Marco G , et al. Wogonin preferentially kills malignant lymphocytes and suppresses T-cell tumor growth by inducing PLC{gamma}1- and Ca2+-dependent apoptosis[J]. Blood , 2008 , 111: 2354-2363. 5 Rosanna C , Pasquale P , Filomena R , et al. Antineoplastic cyclic astin analogues kill tumour cells via caspase-mediated induction of apoptosis[J]. Carcinogenesis , 2005 , 26 ( 4 ) : 733—739. 6 Yu F , Chen C , KellyAnne K , et al. Apoptosis induction in human melanoma cells by inhibition ofMEK Is Caspase-Independent andMediated by the Bcl-2 FamilyMembers PUMA, Bim, and Mcl-1[J]. Clin Cancer Res , 2007 , 13 (16) : 4934-4942. 7 Wu J , Huang J , Yang J , et al. Caspase inhibition augmented oridonin-induced cell death in murine fibrosarcoma L929 by enhancing reactive oxygen species generation[J]. J Pharmacol Sci , 2008 , 108 : 32 – 39. 8 Wahidur R , Shadan A , Amro A ,et al. Inactivation of NF-κB by 3,3-diindolylmethane contributes to increased apoptosis induced by chemotherapeutic agent in breast cancer cells[J]. Mol Cancer Ther , 2007 , 6 (10) : 2757-2765. 9 Li T , Wang W , Chen H , Li T , et al. Evaluation of anti-leukemia effect of reseratrol by modulating SATA3 signaling[J]. Int Immunopharmacol ,2009 , 201 ( 9 ) : 1375-1383. 10 Attia R , Gardner L , Mahrous E , et al. Selective targeting of leukemic cell growth in vitro using a gene slincing approach to diminish S-adenosylmethionine synthesis[J]. J Biol Chem ,2008 ,283 ( 45 ) : 30788-30795. 谢谢！ 敬请老师同学指导！