N乙酰半胱氨酸对肺纤维化大鼠Smad3基因表达的影响

N-乙酰半胱氨酸对肺纤维化大鼠Smad3基因达的影响 李祥亭1刘婷2柳明坤2裴复阳2 1.遵义医学院，贵州遵义563003；2.大连大学附属中山医院呼吸内科，辽宁大连116001 [摘要] 目的 探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）对博莱霉素（BLM）诱导的大鼠肺纤维化模型Smad3表达的影响及意义。方法 选取2013年5~12月提供的健康Wistar大鼠60只，随机分为四组，每组15只。A组：单纯BLM处理组，B组：BLM处理及氢化可的松琥珀酸钠干预组；C组：BLM处理及NAC干预组；D组：空白对照组。四组动物在给药处理后的第7、14天和28天随机处死5只；用免疫组化肺组织中Smad3蛋白表达水平。结果 不同时期各组大鼠Smads 蛋白表达：A组Smad3 蛋白表达最强，B组次之（P0.05），C组较B组差异无统计学意义（P0.05），D组最低（P0.05）。结论 NAC通过参与调控博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织Smad3的表达，抑制大鼠肺纤维化程度。 关键词 肺间质纤维化；N-乙酰半胱氨酸；Smad3；RT-PCR [中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１5）02（a）－０089-02 [作者简介] 李祥亭（1988－），男，山东泰安人，硕士，医师，主要从事呼吸疾病相关研究。 [通讯作者] 刘婷（1959.10-），女，辽宁大连人，硕士研究生，主任医师，肺间质纤维化。 N-乙酰半胱氨酸（NAC）是谷胱甘肽（GSH）的前体，肺组织主要的抗氧化系统是由NAC/GSH及其氧化还原酶构成的，研究表明，氧化/抗氧化失衡是肺间质纤维化的重要机制之一[1-2]。此外，越来越多的证据表明多种细胞因子共同参与是导致肺间质纤维化的主要原因，其中转化生长因子β（TGF-β）是最重要的促纤维化的因子之一。而Smads蛋白中Smad3是TGF-β/Smad信号传导通路中的主要信号蛋白。2013年5~12月该研究通过建立博莱霉素诱导的大鼠肺间质纤维化模型，观察NAC干预对Smads家族成员Smad3表达的影响，在分子水平上研究NAC对肺间质纤维化的影响，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 2013年5~12月取Wistar大鼠60只（由大连医科大学动物中心提供），周龄4～6周，体重180～220 g，随机分为4组，每组各15只。A组：单纯BLM处理组，采用Tang H等[3]研究方法制备肺纤维化模型；B组：BLM处理及氢化可的松琥珀酸钠干预组，模型制备同A组方法，此外每日给予氢化可的松琥珀酸钠（25 mg/kg）腹腔注射；C组：BLM处理及NAC干预组，模型制备同A组方法，但于BLM处理后每天（至处死）强饲法口服NAC（3 mmol/kg）；D组：空白对照组，参照Tang H等[3]的方法气管内注入生理盐水代替博来霉素。四组动物在给药处理后的第7、14 天和第28天随机处死5只，取大鼠肺组织进行免疫组化处理。 1.2 支气管肺组织病理改变观察 利用免疫组化染色以及图像分析技术。免疫组化结果判定：①对细胞着色强度进行计分：将肺泡巨噬细胞着色深浅分用0～4分四级计分；②对阳性细胞进行百分比计分：标记指数根据阳性细胞数所占百分比得出，即U=阳性细胞数/200个巨噬细胞（成纤维细胞）×100％分为I-V五级计分。①×②即为该例标本的免疫组化判定分值。 1.3 统计方法 数据处理采用SPSS 13.0统计学软件进行。用均数±差（x±s）表示所有计量资料，等级计数资料转化为计量资料，具体方法如下：0分表示0级，1分表示I级，2分表示Ⅱ级，3分表示Ⅲ级。显著性分析采用单因素方差分析进行。 2 结果 2.1 肺组织病理变化 对病理半定量进行评分，结果如下：D组未出现明显病理改变情况。A组第7天有大量炎性细胞浸润，出现肺泡间隔明显增宽情况，14 d出现大量成纤维细胞、平滑肌细胞，伴有胶原纤维沉积，28 d可见双肺大量纤维化形成，肺泡结构破坏，毛细血管管腔较前明显增厚，但炎性细胞较前减少。B组和C组肺泡炎和纤维化程度均较A组有所减轻（P0.05）。C组同B组相比较，肺泡炎和纤维化程度差异无统计学意义（P0.05），但仍较D组严重（P0.05）（表1）。 2.2 肺组织Smad3蛋白表达 各组Smad 3蛋白表达（见表2，免疫组化染色图片见图1～3）结果如下：D组于少量血管内皮细胞、支气管粘膜上皮细胞胞浆呈弱阳性表达。A组在巨噬细胞、肺泡上皮细胞及增生的成纤维细胞胞浆中呈强阳性表达。B组和C组蛋白表达强度明显弱于A组（P0.05），C组同B组相比较，蛋白表达强度差异无统计学意义（P0.05），但仍高于D组（P0.05）。见表2。 3 讨论 肺间质纤维化是一种弥漫性肺实质的渐进性疾病，其具体发病机制目前尚未阐明。现阶段主要应用糖皮质激素和细胞毒类药物， 毒副作用较大，效果欠佳。 多项研究表明，氧化应激与氧化-抗氧化失衡在肺间质纤维化的发生发展过程中起着关键作用[4]。作为抗氧化剂GSH的前体物质，NAC可补充损伤肺组织缺失的GSH水平，提高纤维化疾病患者的肺部功能。NAC通过提高细胞内GSH水平方式，抑制转化生长因子β （TGF-β）表达，从而降低TGF-β诱导的胶原合成[5]。TGF-β是致纤维化的关键性细胞因子，它通过促进成纤维细胞增殖及聚集，将成纤维细胞表型转化为成肌纤维细胞表型，使成肌纤维细胞参与细胞外基质的沉积，这在肺纤维化的发病机制中起重要作用[6]。Smads作为TGF-β下游的信号蛋白，是将TGF-β信号从细胞外转入细胞内的关键因子。为此该研究分析了Smads在NAC治疗后大鼠肺纤维化模型中蛋白水平的表达情况，研究发现在活化的成纤维细胞和肺泡上皮细胞内均见Smad3表达，且随肺纤维化程度加重，Smad3表达水平增高。经NAC和激素治疗后Smad3表达水平降低，提示NAC可能是通过下调TGF-β通路关键因子Smad3的表达实现抗纤维化作用的。唐志宇等[7]研究表明鳖甲煎丸能够减轻博莱霉素导致的大鼠肺纤维化程度，其作用机制与调控TGF-β的Smad蛋白表达有关。Meurer等[8]在体外培养的肝脏细胞研究中发现，NAC通过破坏分子间二硫键，改变了TGF-βRIII的结构，降低与TGF-β1的亲和性，抑制构成TGF-β信号通路的重要分子Smad3的磷酸化，从而抑制TGF-β信号通路的各个方面。 综上所述，抗氧化剂NAC通过抑制Smad3实现BLM诱导的肺纤维化大鼠的保护作用。但肺纤维化作用机制错综复杂，故还需进一步探索。 参考文献 [1] Cho WS， Duffin R， Howie SE， et al.Progressive severe lung injury by zinc oxide nanoparticles； the role of Zn2+ dissolution inside lysosomes[J]. Part Fibre Toxicol，2011，8：27. [2] 王文俊，张德平．姜黄素对与A549细胞共培养的肺成纤维细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制 [J]．中国呼吸与危重监护杂志，2013， 12（3）：289-292． [3] Tang H， Mao J， Gao L， et al.Effect of antisense TIMP-1 cDNA on the expression of TIMP-1 and MMP-2 in lung tissue withpulmonary fibrosis induced by bleomycin[J].Mol Med Rep，2013，7（1）：149-153. [4] Cheresh P，Kim SJ，Tulasiram S，et al.Oxidative stress and pulmonary fibrosis[J].Biochim Biophys Acta，2013，1832（7）：1028-1040. [5] Li S， Yang X， Li W，et al.N-acetylcysteine downregulation of lysyl oxidase activity alleviating bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J]． Respiration，2012，84（6）：509-517. [6] 袁媛，杨方，徐洪．Ac-SDKP对ROCK通路介导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的调节作用 [J]．中华劳动卫生职业病杂志，2013，31（9）：654-660． [7] 唐志宇，李天朗，唐小宾．鳖甲煎丸对肺纤维化大鼠TGF-β1及smad信号通路的影响 [J]．世界中医药，2011，6（6）：522-523． [8] Meurer SK， Lahme B， Tihaa L， et al. N-acetyl-L-cysteine suppresses TGF-beta signaling at distinct molecular steps： the biochemical andbiological efficacy of a multifunctional， antifibrotic drug[J]. Biochem pharmacol， 2005， 70（7）：1026-1034. （收稿日期：2014-11-09） 1