(完整版)外泌体提取方法总结

1、细胞培养上清：即在4℃下，首先300×g离心10min，吸取上清液，然后2000×g离心10min；吸取上清液后，10000×g高速离心30min，吸取上清液；140000×g超速离心90min；除掉上清液，所获得的积淀即为外泌体。用PBS缓冲液洗涤积淀并重悬后，140000×g再次离心90min，100μLPBS缓冲液重悬积淀，冻存于-80℃备用。2、将小鼠或人血收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝固1小时而不进行抗凝。今后，将其以2,000×g离心持续10分钟获得血清。接着将血清以3,000×g离心10分钟。将上清液以无菌PBS以1：1的比率稀释并离心再次以10,000×g保持30分钟，然后以200,000×g进行2小时超速离心。将颗粒在a中洗涤大量PBS，经过0.2-μm注射器过滤器过滤，并以200,000×g离心1小时，然后收集积淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基。3、为了从体液（比如尿液，支气管肺泡灌洗液，血清，血浆，肿瘤腹水）中纯化外泌体，只要经过惯例收集液体即可。血浆用紫色的管子，EDTA抗凝，血清的话不抗凝直接离心。在4°C下在玻璃瓶中储藏长达5天，直至进行外泌体纯化。外泌体纯化的原理与从组织培养条件培养基开始时的原理相同，但由于某些流体的粘度，必须稀释它们，并增加离心的速度和长度。该已在作者的实验室中用于从人血浆中纯化外泌体（Caby等，2005）。基本方案1中指出的所有预办理也合用于该方案。材料液体（比如，血浆：经过Ficoll离心与血细胞分别;淋巴，血清，尿液，细支气管灌洗或肿瘤腹水）磷酸盐缓冲盐水（PBS;附录）2A）冷冻离心计50毫升聚丙烯离心管0.22微米过滤装置（如Steritop，Millipore）超速离心计和固定角度或摇动式转子（见表）合用于超速离心机转子的聚合物管或聚碳酸酯瓶（见表3.22）0.1）注意：所有离心均应在4℃下进行。用等体积的PBS稀释液体。将稀释的液体转移到50毫升管中。在2,000×g，4℃下离心30分钟。将上清液转移到超速离心管或瓶中，没有颗粒污染（参见基本方案1，步骤3说明）。在12,000×g，4℃下离心45分钟。小心地将上清液转移到超速离心管或瓶中（根据办理的液体体积，可参见表3.22.1中的管）。在110,000×g，4℃下离心2小时。将积淀重悬于1mlPBS中，并将其在其中一个管中聚集。用PBS填充管以大量稀释再悬浮液。经过0.22-μm过滤器过滤悬浮液，并收集在新鲜的超速离心管或瓶中。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。将积淀重悬于1mlPBS中，然后用PBS填充管。在110,000×g，4℃下离心70分钟。倒出上清液。8.将积淀重悬于50至200μlPBS中。在-80℃下储藏长达1年。