实验8植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

实验8植物组织中可溶性蛋白质含量的测定时间：2021.03.09创作：欧阳法I.斐林-酚试剂法［原理］斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脉试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在威性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷锢酸、磷鹄酸试剂还原，生成磷钿蓝和磷鹄蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩腺法高100倍。由于肤键显色效呆增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为5〜1()()临蛋白质)。［材料、仪器设备及试剂］材料各种植物材料。仪器设备722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。试剂(1)().5mol/LNa()Ho⑵斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4%碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液等体积混合。B液：1%硫酸铜(CuS04•5H20)溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合。使用前将A与B按5():1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。⑶斐林-酚试剂乙液：称取鹄酸钠(Na2W04oH20)100g,钮酸钠(Na2Mo()4-2H20)25g,加蒸锦水700ml溶解于150()mL的圆底烧瓶中。之后加入85%的H3P()450mL,浓HcllOOmL,安上回流装置(使用磨口接头，若用软木寒或橡皮塞时，就必须用锡縮纸包起来)，使其慢慢沸腾1()h。冷却后加入硫酸锂(Li2SO4.H2O)15()g,蒸馅水50ml,渓水2-3滴，打2021.03.09开瓶口煮沸15min,以逐出过量的渓，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴渓水，继续煮沸15min）。待冷却后稀释至1000ml,过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于lmol/L酸度。因此在使用前应进行标定。标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内,用lmcl/L氢氧化钠溶液滴定，酚醮作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于lmol/L的酸度。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH#l（）的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钿酸-磷鹄酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。⑷标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馅水中，使终浓度为250|Ag/mlo［实验步骤］（一）标准曲线的绘制取18mmX200mm试管7支，1-7编号，分别加入()mL、().1mLx().2mL、0.4mLs().6mL、().8mL、l.OmL标准蛋白质溶液，用蒸馅水补足ImL,使每管含蛋白量分别为Opmol/L、25p.mol/Ls5()pmol/L%100pmol/L、15()p.mol/L>200|imol/L、250p.mol/Lo用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液，混匀，于3()°C下放置lOmino再向试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在3()°C下准确保温30min以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用lcm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。样品的测定样品的提取：称取鲜样().5g,用5mL蒸馅水或缓冲液研磨成匀浆后，1000()r/min离心lOmin,取上清液1.OmL(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2〜4步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样為中的蛋白质含量。［结果计算］样品中蛋白的含量=(mg/g)式中：C为查标准曲线值，rig；VT为提取液总体积，mL；WF为样品鲜重，g；Vs为测定时加样量，mLo'还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。U.考马斯亮蓝G-250染色法［原理］考马斯亮蓝G-250(CoomassicbrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm,后者在5951lnmo在一定蛋白质浓度范围内(1〜l()()()|Ag),蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下lh内保持稳定。此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋臼质与色素结合状况有一定差异。［材料、仪器设备及试剂］（一）材料小麦叶片及其他植物材料。（二）仪器设备722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管等。（三）试剂⑴标准蛋白质溶液：l（）（）Rg/mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋臼25隅，加水溶解并定容至lOOmL,吸取上述溶液40mL,用蒸懈水稀释至1OOmL即可。⑵考马斯亮蓝G-250溶液：称取lOOmg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入1OOmL85%（W/V）的磷酸，再用蒸镐水定容到1L,贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。［实验步骤］（一）标准曲线的绘制取6文具塞试管，按表2-29-1加入试剂（（）〜100|ig/mL的标准蛋白）。混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（二）样品测定⑴样品提取。方法与斐林-酚试剂法相同。⑵吸取样品提取液1.0ml,放人具塞试管中（每个样品重复2次），加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。［结果计算］样品中蛋白质的含量=（mg/g）式中：C、VT、WF.Vs的表示意义与斐林-酚法相同。111.紫外吸收法［原理］蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度下，蛋臼质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。核酸在紫外区(260nm)也有吸收，可通过校正加以消除。［材料、仪器设备及试剂］材料.小麦叶片及其他植物材料。仪器设备紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。试剂().lmol/LPH7.()磷酸缓冲液。［实验步骤］样器提取与菲林-酚法相同。测定取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1mol/LpH7.0磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零。［结果计算］蛋白质浓度=1.45A280-0.744A260(mg/mL)蛋白质含量二式中：1.45和().74为校正值：A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；A260为蛋白质溶液在260nm处的吸光度；n为稀释倍数。思考题1.测定植物体内可溶性蛋白质含量有什么意义和用途?试举二例说明。2.三种测定方法各有何优缺点?在实验中如何选择合适的方法并克服其缺点？3.福林-酚试剂法测定蛋白质含量的原理是什么？测定中应注意什么问题？时间：2021.03.09创作：欧阳法