食品中苯甲酸山梨酸和糖精钠的测定-标准文本（食品安全国家标准）

食品安全国家食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定范围本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。第一法液相色谱法原理样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂氨水（NH3•H2O）。氢氧化钠（NaOH）。硫酸（H2SO4）。亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6•3H2O）。乙酸锌（Zn(CH3COO)2•2H2O）。氯化钠（NaCl）。酒石酸（C4H6O6）。硅酮树脂。磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）。磷酸二氢钾（KH2PO4）。中性氧化铝。甲醇（CH3OH）：色谱纯。乙酸铵（CH3COONH4）。3.2试剂配制3.2.1氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。3.2.2氢氧化钠溶液（4g/L）：称取4g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000mL。3.2.3硫酸溶液（0.5mol/L）：移取30mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500mL水中，冷却至室温后，转移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。3.2.4亚铁氰化钾溶液（92g/L）：称取106g亚铁氰化钾加水至1000mL。3.2.5乙酸锌溶液（183g/L）：称取220g乙酸锌溶于少量水中，加入30mL冰乙酸，加水稀释至1000mL。3.2.6酒石酸溶液（15%）：称取15g酒石酸，用水定容100mL。3.2.7的磷酸盐缓冲液（pH7.2）：分别称取16.72g磷酸二氢钠和2.72g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1000mL，经微孔滤膜过滤后备用。3.2.8中性氧化铝：层析用，100目~200目。105℃干燥2h，于干燥器中冷却至室温，每100g中加入2mL水降活，混匀后密封，放置12h后使用；或按照使用量的不同，选择合适的活化温度及时间。3.2.9乙酸铵溶液（1.54g/L）：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并稀释至1000mL，经微孔滤膜过滤后备用。3.3标准品3.3.1苯甲酸钠（C6H5COONa）：CAS：532-32-1，纯度≥99%。3.3.2山梨酸钾（C6H7KO2）：CAS：590-00-1，纯度≥99%。3.3.3糖精钠（C6H4CONNaSO2）：CAS：128-44-9，纯度≥99%。3.4标准溶液配制3.4.1苯甲酸钠标准储备液：准确称取0.2360g苯甲酸钠，加水溶解并定容至200mL。此溶液每毫升相当于含苯甲酸1.00mg。3.4.2山梨酸钾标准储备液：准确称取0.2680g山梨酸钾，加水溶解并定容至200mL。此溶液每毫升相当于含山梨酸1.00mg。3.4.3糖精钠标准储备液：准确称取0.2340g糖精钠（120℃烘4h），加水溶解并定容至200mL。此溶液中糖精钠的含量为1.00mg/mL。3.4.4混合标准系列使用液：分别准确吸取不同体积苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠标准储备溶液，将其稀释成苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量分别为0.000mg/mL、0.020mg/mL、0.040mg/mL、0.080mg/mL、0.160mg/mL、0.320mg/mL的混合标准系列使用液。仪器和设备4.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器。4.2天平：感量为0.001g和0.0001g。5分析步骤5.1试样制备5.1.1液体样品5.1.1.1汽水等含气类样品：称取5g~10g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.1.2预调酒等含醇类样品：称取10g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.1.3高蛋白类样品：贮藏在冰箱中的乳与乳制品，应在试验前预先取出，并达室温，称量20g（精确至0.001g）样品于100mL容量瓶中。向容量瓶中加入25mL氢氧化钠溶液，混合后置于超声波水浴或70℃水浴中处理15min。冷却后，用硫酸溶液将pH调节到8（用pH计或pH试纸均可），然后加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL乙酸锌溶液。剧烈振摇，静置15min，混合后冷却到室温，再用水定容，静置15min，上清液经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.1.4食醋样品：称取50.0mL，加入40g氯化钠，5mL15%酒石酸溶液，1滴硅酮树脂（作为消泡剂），加水至约200mL，混匀后，进行蒸馏（蒸馏速度约为2.5mL/min），收集约90mL馏出液，用水定容至100mL。清液经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.1.5其他液体样品：称取5g~10g（精确至0.001g）样品，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至适当体积，经微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.2半固体、固体样品5.1.2.1高油脂类样品：称取2g~3g（精确至0.001g）样品于50mL具塞离心管中，加入10mL磷酸盐缓冲液（pH7.2），用旋涡混合器充分混合，然后于4,000r/min离心5min，小心吸出水层转移到25mL容量瓶中，再加入10mL磷酸盐缓冲液（pH7.2）于具塞离心管中，重复上述步骤，合并两次水层液，用磷酸盐缓冲液（pH7.2）定容至刻度，混匀，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.2.2高蛋白类样品：称取粉碎均匀的2g~3g（精确至0.001g）样品于小烧杯中，用20mL水分数次清洗小烧杯，将样品移入25mL容量瓶中，超声振荡提取5min，取出后加2mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入2mL乙酸锌溶液，摇匀，用水定容至刻度。移入离心管中，4,000r/min离心5min。取上清液，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.1.2.3固态乳制品：称取3g（精确至0.001g）样品于100mL容量瓶中，加10mL水，用玻璃棒搅拌至完全溶解。再按“5.1.1.3高蛋白类样品”处理。5.1.2.4其他固体样品：称取2g~3g（精确至0.001g）样品，加水适量，转移至25mL容量瓶中，再加水至约20mL，置60℃~70℃水浴中加热片刻，加塞，剧烈振摇使其分散均匀后，加氨水（1+1）调节pH至近中性，加塞，剧烈振摇，使样品在水中分散均匀，置60℃~70℃水浴锅中加热30min，取出后趁热超声5min，冷却后用水定容至刻度，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。5.2色谱参考条件5.2.1色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5µm或同等性能的色谱柱。5.2.2检测器：紫外检测器。5.2.3流动相：甲醇+乙酸铵溶液=5+95或相当性能的流动相。5.2.4流速：1mL/min。5.2.5检测波长：230nm。5.2.6进样量：10µL。5.3标准曲线的制作将混合标准系列使用液分别注入液相色谱仪中，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠的浓度，平行测定次数不少于两次。6结果计算试样中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量A1按公式（1）计算：……………………………………（1）式中：A1——样品中待测组分含量，单位为克每千克（g/kg）；c1——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V1——样品定容体积，单位为毫升（mL）；m1——样品质量，单位为克（g）。试验结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值示，结果保留两位有效数字。7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他取样量为2.5g时，样品检出限：苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限分别为2mg/kg、2mg/kg、3mg/kg；样品定量限：苯甲酸、山梨酸、糖精钠的检出限分别为6mg/kg、6mg/kg、9mg/kg。第二法气相色谱法8原理试样酸化后，用乙醚提取出苯甲酸、山梨酸，用附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较，外标法定量。9试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。9.1试剂9.1.1乙醚（C2H5OC2H5）：不含过氧化物。9.1.2石油醚：沸程30℃~60℃。9.1.3盐酸（HCl）。9.1.4氯化钠（NaCl）。9.1.5无水硫酸钠（Na2SO4）。9.2试剂配制9.2.1盐酸溶液（1+1）：取100mL盐酸，边搅拌边慢慢加入至50mL水中，冷却至室温后，加水稀释至200mL。9.2.2氯化钠酸性溶液（40g/L）：于氯化钠溶液（40g/L）中加少量盐酸（1+1）酸化。9.2.3石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂：取150mL石油醚和50mL乙醚，混合。9.3标准品9.3.1苯甲酸（C6H5COOH）：CAS：65-85-0，纯度≥99%。9.3.2山梨酸（C6H8O2）：CAS：110-44-1，纯度≥99%。9.4标准溶液配制9.4.1苯甲酸、山梨酸标准储备液准确称取苯甲酸、山梨酸各0.2g（精确至0.0001g），置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解后并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于2.0mg苯甲酸或山梨酸。9.4.2苯甲酸、山梨酸标准系列工作液吸取适量的苯甲酸、山梨酸标准储备液，以石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂稀释至每毫升相当于50µg、100µg、150µg、200µg、250µg苯甲酸或山梨酸。10仪器和设备10.1气相色谱仪：具有氢火焰离子化检测器（FID）。10.2天平：感量为0.001g和0.0001g。11分析步骤11.1试样制备称取2.5g（精确至0.001g）事先混合均匀的试样，置于25mL具塞量筒中，加0.5mL盐酸（1+1）酸化，用15mL和10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层乙醚提取液吸入另一个25mL具塞量筒中，合并乙醚提取液。用3mL氯化钠酸性溶液（40g/L）洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL具塞刻度试管中，置于40℃水浴上挥干，加入2mL石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解残渣，用微孔滤膜过滤，滤液为试样溶液。11.2色谱参考条件一11.2.1色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长2m，内装涂以5%DEGS+1%磷酸固定液的60目~80目ChromosorbWAW。11.2.2气流速度：载气为氮气，50mL/min（氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件）。11.2.3温度：进样口230℃；检测器230℃；柱温：170℃。11.2.4进样量：2µL。11.3色谱参考条件二11.3.1色谱柱：毛细管柱HP-WAX，内径320µm，长30m，膜厚度0.50µm，或其它等效毛细管柱。11.3.2气流速度：载气为氮气，流速为30mL/min（氮气和空气、氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件），不分流模式。11.3.3温度：进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；柱温升温程序：初始温度：80℃，保留2min，以10℃/min的速率升温至230℃，保留5min。11.3.4检测器：FID。11.3.5进样量：1µL。11.4标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入气相色谱仪中，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。11.5试样溶液的测定将试样溶液注入气相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中苯甲酸、山梨酸的浓度，平行测定次数不少于两次。12结果计算试样中苯甲酸、山梨酸含量A2按公式（2）计算：……………………………………（2）式中：A2——试样中待测组分含量，单位为克每千克（g/kg）；c2——由标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V2——加入石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂的体积，单位为毫升（mL）；m2——试样的质量，单位为克（g）；5——测定时吸取乙醚提取液的体积，单位为毫升（mL）；25——试样乙醚提取液的总体积，单位为毫升（mL）。试验结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。由测得的苯甲酸的量乘以1.18，即为试样中苯甲酸钠的含量；由测得的山梨酸的量乘以1.34，即为试样中山梨酸钾的含量。13精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。14其他苯甲酸和山梨酸标准溶液的检出限均为0.2mg/kg；定量限均为0.65mg/kg。酱油试样取样量为2.5g时，苯甲酸和山梨酸的检出限均为1mg/kg；定量限均为5mg/kg。附录A苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效液相色谱图图A.1给出了苯甲酸钠、山梨酸钾和糖精钠标准溶液的高效液相色谱图。SHAPE\*MERGEFORMAT图A.1苯甲酸、山梨酸和糖精钠的高效液相色谱图图A.2给出了苯甲酸和山梨酸标准溶液的气相色谱图。图A.2苯甲酸、山梨酸的气相色谱图（毛细管柱）0.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.5min-0.250.000.250.500.751.001.251.501.752.00uV(x10,000)苯甲酸钠山梨酸钾糖精钠I_1234567890.unknown_1234567891.unknown