人类染色体标本制备

人类染色体标本制备标题大纲大纲1外周血非显带染色体标本的制作大纲2染色体显带技术大纲3高分辨染色体制片【掌握】1.染色体标本制作的主要步骤2.染色体不同显带技术的检测目的【了解】其余大纲1外周血非显带染色体标本的制作染色体制备原理及主要步骤人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），这种小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。步骤：接种→培养→收获→滴片→烤片→消化→染色染色体标本制备流程一.接种a.接种前准备工作1.操作人员做好个人防护:穿戴工作服，隔离帽，口罩，手套2.在操作前30分钟，开启生物安全柜的消毒灯进行消毒。3.取出冰冻的培养基，于37℃水浴箱复融。之后擦干培养瓶身，贴好识别标签（条码、实验号）。4.打印标签。为每个标本打印多个标签，贴于操作中将用到的培养瓶，滴管，离心管上。5.将血标本，贴好标签的培养基，注射器移置生物安全柜b.双人接种：一人核对好标本和培养基后，交给另一人核对；一人将培养瓶胶盖、血液抗凝管胶盖在消毒灯上灭菌、注射器抽取1ml的外周血，平均打入到2瓶培养基中，轻轻摇匀，然后把血标本和对应培养瓶递给另一人核对标识。核对后按顺序分别放在两个篮筐里，并做好标记（注明接种日期，时间，接种人姓名，接种标本的实验号）。二.培养。将每个标本已接种的两个培养基，分别放入培养箱中，37℃培养68~72小时。三.收获1.在收获前2小时，将培养瓶从培养箱中取出，放入生物安全柜。2.在每个培养瓶内加入0.1ml浓度为20µg/ml的秋水仙素，轻轻摇匀后，放置回培养箱中继续培养。3.开启抽风柜的风扇及灯，将贴好条码的吸管、离心管、塑料试管、培养好的培养瓶一一对应摆在抽风柜中。4.用吸管将培养瓶中的细胞吹打均匀，移入两个离心管中。5.离心管置于离心机中以2000～2200r/min，离心5分钟6.离心后弃上清液，加入已在37℃预热的0.075mol/L的KCL溶液8ml，充分混匀，在37℃水浴箱中低渗23分钟～30分钟7.低渗后加入固定液（甲醇与冰乙酸按3：1混匀）2ml混匀,以2000～2200r/min，离心10分钟。8.弃上清液，再重复两次上述的固定步骤。9.弃上清液，将两管离心管中剩下的细胞合成一管，并加入适量固定液调成细胞悬液。四.滴片：取出在4℃冰水中预冷的清洁玻片，对玻片进行标识，把玻片置于滴片板上，用吸管吸取细胞悬液约0.3ml在20cm～25cm的高度滴于玻片上，玻片的头体尾各一滴即可。五.将标记好、滴好的玻片置于75℃烤箱中烤片3小时。六.将烤好的玻片进行消化，染色。大纲2染色体显带技术一.G显带1.实验原理：附着在玻片上的染色体经过烤片加热变性，再经过胰蛋白酶抽提和DNA上富含GC碱基对区段相结合的蛋白质，降低该区段对染料的亲和力，在之后的姬姆萨染液染色中呈浅带；反之，DNA上富含AT碱基对的区段与组蛋白结合紧密，胰酶处理时不易被抽提，故对染料有较强的亲和力，呈深带。胰蛋白酶浅带CG染料胰蛋白酶深带AT染料2.试剂0.025%胰酶:取0.5%、3.5ml胰酶一管，加入70ml的PBS缓冲液，充分混匀70ml～100ml的生理盐水姬姆萨染液：取10ml～15ml姬姆萨母液，加入70ml的PBS缓冲液，充分混匀将abc液置于37℃水浴箱预热20分钟3.试片：将试用片放入胰酶中消化（30s），之后放入生理盐水中过水，随后立即放入染液中染色（2~10min）。4.染色后的玻片用自来水冲洗，风干后镜检5.镜下观察染色体是否发毛/没带，发毛为胰酶消化时间过长；没带为消化时间不够。颜色深浅是否合适。如不达要不断进行调整，增加或减少消化、染色时间。图没带6.用试片得出的合适的消化、染色时间进行批量标本的消化、染色。二.C显带1.原理异染色质区域经强酸碱变性后，再用温热盐溶液复性，其复性速度明显快于其他区域（常染色质），所以其经吉姆萨染色后着色深，而常染色质区域极浅。C显带常用于检测1、9、16、Y染色体的异染色质区域变异。C显带2.主要过程滴好的玻片→HCL15min→蒸馏水冲洗→Ba(OH)210min→蒸馏水冲洗→SSC溶液1h→蒸馏水冲洗→吉姆萨染色10~20min三.N显带1.原理：端着丝粒染色体（13、14、15、21、22号染色体）的次缢痕与核仁的形成有关，称之为核仁组织区，其中具有转录活性的18SrRNA和28SrRNA的基因位于此区域，这类rRNA富含酸性蛋白质，能使硝酸银中的Ag+还原成Ag颗粒使该区域被镀上银颗粒而呈现黑色，而没有转录活性的区域不着色。四.R显带其与G显带的带纹相反，即G带显示为深带，R带显示为浅带。主要用于检测染色体末端的异常。大纲3高分辨染色体制片原理：人外周血淋巴细胞，在有丝分裂刺激剂（PHA）作用下，转化为淋巴母细胞，进行有丝分裂。当细胞增殖到一定数量时，加入5-氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷从而抑制DNA的合成，将其同步在S期，17个小时后加入胸腺嘧啶核苷（TDR）释放细胞，使细胞有丝分裂继续，进入分裂期后加入染色体缩短抑制剂溴化乙锭（EB）,并加入秋水仙胺破坏纺锤丝的形成。同步化使细胞处于相同的阶段，EB使DNA的螺旋化程度降低，通过这种方法制备的染色体有较多条带，最高可达上千条带，能够更好地显现染色体细微的结构，提高人类染色体分辨率，特别有益于智力低下、反复流产等病因分析。