痰抗酸杆菌的荧光染色法

抗酸杆菌的荧光染色检查法抗酸杆菌的荧光染色检查法 主要内容 1.原理 2.操作程序 3.舜宇EX30荧光显微镜的操作使用 4.质量控制抗酸杆菌荧光染色的原理 抗酸杆菌是无色半透明的有阴电荷和很微弱的固有荧光的微生物，而荧光素金胺O是一种含有自由氨基的金黄色碱性染料，它的离子带有阳电荷，因此金胺O能和带阴电荷的抗酸杆菌结合而使其着荧光色素，当其遇到紫外线或青色线时，即可激发出桔黄色荧光。抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （一）涂片 ①取经95%乙醇擦拭脱脂过的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于玻片磨砂端用铅笔在背面左端1/3标注实验编号和序号； ②在生物安全柜内，小心打开标本容器，用折断的竹签（需事先准备好）茬端挑取痰标本的脓样、干酪样部分，于玻片右侧2/3处均匀涂抹成10×20mm卵圆形痰膜，待自然干燥。抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （二）染色 1．把痰片放在染色架上，痰片间距应大于10mm，火焰固定(5秒钟火焰在玻片下方通过4次)；2.滴加0.1%金胺Ｏ染液，盖满痰膜，保持染色15分钟。染色时应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （二）染色 3．流水自玻片上端轻缓冲洗，洗去染色液后倾斜玻片沥去残余水； 4．滴加脱色液（3%盐酸乙醇），脱色3分钟或至痰膜无色； 5.流水自玻片上端轻洗，如果脱色不彻底，重复脱色操作； 抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （二）染色 6．沥去残余水； 7．滴加0.5%高锰酸钾复染液，保持染色1～4分钟（根据试剂书或经验）； 流水自玻片上端轻洗，洗去复染液，沥去残余水，待自然干燥。 抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （三）镜检和报告 使用汞光源灯或LED光源的荧光显微镜，用10×目镜，20×物镜观察，发现疑似抗酸菌的杆状物，转用40×物镜确认。在黑暗背景下，抗酸杆菌呈黄色绿荧光，杆状略弯曲。按下列标准报告结果： 1.抗酸杆菌阴性：连续观察50个视野，未发现抗酸杆菌。抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （三）镜检和报告 2.　抗酸杆菌（1~9条）：1～9条抗酸杆菌/50个视野（报告抗酸杆菌数）。 3.　抗酸杆菌阳性（1＋）：10～49条抗酸杆菌/50个视野。 4.　抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （三）镜检和报告 5.　抗酸杆菌阳性（3＋）：10～99条抗酸杆菌/每视野。 6.　抗酸杆菌阳性（4＋）：≥100条抗酸杆菌/每视野。 镜检结果应及时记录在“结核病细菌学实验室登记本”和检验报告单上。抗酸杆菌荧光染色检查操作程序 （四）痰片保存 荧光染色的痰涂片，在存放过程中抗酸杆菌的荧光会随时间的延长而衰减，因此，荧光染色的标本片必须尽快放置到避光环境、4℃冰箱保存，一般可保存半年。 注意:荧光染色的痰涂片必须避光低温存放，否则阳性标本因荧光衰退，可导致抽查复检时呈假阴性!舜宇EX30显微镜荧光镜操作简要程序 1.接通电源之前，确认荧光器组的调光手轮是断开（OFF）状态； 2.把外接电源变压器输出接口（直流6V）插入LED荧光照明器组的电源插口，然后把另一端直接插到供电插座上； 3.缓缓顺时针方向开启荧光器组件的调光手轮，不必开到最大； 4.将荧光滤光块箭头切换到指向Flourescence标志舜宇EX30显微镜荧光镜操作简要程序 5.把荧光染色并已干燥的痰片装入载物台，目镜10×配合物镜20×寻找荧光物，在黑暗背景中寻找到荧光镜象，发现形似抗酸杆菌的荧光物时，转用40×物镜确认。 6.镜检完毕，逆时针方向旋转荧光器组件的调光手轮至关断（OFF）位置，最后关断电源插座开关或拨出显微镜变压器供电端的插头。 (镜检后的标本置于标本盒内，放4℃冰箱避光保存)萋—尼氏法与荧光法的主要区别： 项目 萋—尼氏染色法 荧光染色法 初染色 碱性复红热染5分钟（或冷染15分钟） 0.1%金胺Ｏ染液，不加热染色15分钟， 脱色时间 1分钟（脱色不彻底可重复） 3分钟（脱色不彻底可重复） 复染液 亚甲兰复染，30秒 高锰酸钾复染，1～4分钟 镜检 普通显微镜，目镜10×，油镜100× 荧光显微镜，目镜10×，物镜40× 阴性报告 300个视野未发现抗酸杆菌 50个视野未发现抗酸杆菌 报告抗酸杆菌数 1~8条抗酸杆菌/300视野 1~9条抗酸杆菌/50个视野 抗酸杆菌阳性(1＋) 3－9条抗酸杆菌/100视野 10~49条抗酸杆菌/50个视野 抗酸杆菌阳性(2＋) 1－9条抗酸杆菌/10视野 1~9条抗酸杆菌/每视野 抗酸杆菌阳性(3＋) 1－9条抗酸杆菌/每视野 10~99条抗酸杆菌/每视野 抗酸杆菌阳性(4＋) ≥10条抗酸杆菌/每视野 ≥100条抗酸杆菌/每视野 标本片保存 拭去镜油后放玻片盒，室温保温 玻片盒避光、4℃冰箱保存 标本片保存期　 长期 半年内抗酸杆菌荧光染色检查质量控制 主要包括：标本收集、试剂、涂片、染色操作、显微镜维护、镜检和结果登记及痰片的保存。 1.标本收集：用密封有盖盒收集痰标本，容器应标明病姓名、送检日期及门诊号。标本性质：应为深咳痰液，痰性状类别：脓样痰、干酪样痰、血性样痰、脓性粘液痰和水样痰。抗酸杆菌荧光染色检查质量控制 2.试剂：染液外观无沉淀、无悬浮物（金胺O非常稳定，一般不产生沉淀），贮存环境避光通风、避免高温，每次使用后及时盖紧，已开瓶的试剂的使用，一般控制在6个月内用完或弃去。 3.涂片：应当取痰的脓样、干酪样部分，于玻片右侧2/3均匀涂成10×20mm痰膜，自然干燥，染色前固定。抗酸杆菌荧光染色检查质量控制 4.染色：初染15分钟要避免染液干燥，可续加染液；脱色符合要求，复染操作根据试剂说明书或经验控制好时间，时间过长可导致荧光亮度消失。初染、脱色、复染的水洗后，都要沥去玻片上的残余水。 5.显微镜维护：防尘、防潮、防震、避免阳光直射，按操作规范使用，定期清扫灰尘。为延长光源灯的使用寿命，一般不把光源调到最强，并且注意使用后及时关闭光源灯开关和变压器电源。抗酸杆菌荧光染色检查质量控制 6.镜检：镜头清晰，无霉菌，视野清晰，物镜20×寻找黑暗背景中的荧光镜象，发现形似抗酸杆菌的时，用40×物镜确认，注意抗酸杆菌荧光染色镜检不使用油镜。 7.登记和保存：每份标本准确记录，痰片注明序号，按顺序放置标本盒内，避光、4℃冰箱保存。 THANKYOU！