植物ABC转运蛋白及其在Al胁迫下的功能研究进展

植物ABC转运蛋白及其在Al胁迫下的功能研究进展2010年20(5)生物技术3讨论脂联素亦称Acrp30、GBP-28、AdipoQ、APM-1，它是由成熟脂肪组织分泌的一种与细胞外基质相互作用的特异性血清蛋白。人类脂联素的基因是单拷贝基因，位于染色体3q27，包含3个外显子和2个内含子，而染色体3q27区是型糖尿病的易感基因位点[4]。脂联素可以保护血管内皮细胞，其机制与其胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化、抗炎和抗氧化作用有关[2]。本研究中1和表2的结果表明冠心病和冠脉造影阳性患者的血清脂联素水平均较相应对照组下降，提示无论冠心病的病变严重程度如何，脂联素可作为冠心病的辅助诊断和判断严重程度的指标之一，与文献报道基本一致[5]。冠心病是糖尿病的常见并发症之一，据文献报道，冠心病和糖尿病患者的血清脂联素水平均较其相应正常对照组下降[5,6]。那么糖尿病患者并发冠心病的情况是否与血清脂联素水平有关系呢?本实验表3结果提示糖尿病或糖耐量受损患者中，并发冠心病组的血清脂联素水平明显低于未并发冠心病组，这点未见文献报道。糖尿病患者糖代谢紊乱可导致脂代谢紊乱，因此易继发血管病变，如冠脉疾病、肾病等，血清脂联素浓度降低可能作为糖尿病患者脂代谢紊乱程度严重，可能并发冠心病的一个新预测指标。我们前期工作证实，在根据年龄、性别相应匹配对照组后，实验组BMI、腰围、甘油三酯、高密度脂蛋白c、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-(TNF-)均与脂联素水平相关，提示：脂联素与血脂及动脉硬化相关炎性因子也密切相关[7]。TNF-和IL-6及其受体可抑制脂联素表达，脂联素降低和TNF-、IL-6升高与型糖尿病正相关[8]，这些工作与本文的研究结果是一致的。冠心病患者和糖尿病或糖耐量受损并发冠心病患者的血清脂联素水平下降提示血清脂联素浓度降低可能作为冠心病的辅助诊断和病变严重程度的新指标；同时它也可能成为糖尿病是否并发冠心病的新预测指标，有潜在的临床应用价值。参考文献:[1]Wei-ShiungYang,Lee-MingChuang.Humangeneticsofadiponectininthemetabolicsyndrome[J].JMolMed,2006,84:112-21.[2]NanlanLuo,JianLiu,B.HongChung,eta.lMacrophageadiponectinexpressionimprovesinsulinsensitivityandprotectsagainstinflammationandatherosclerosis[J].Diabetes,2010,59:791-9.[3]YbarraJuan,PouJoseM,PlanasFrancesc,eta.lCorrelationbetweeninsulinresistancesurrogatesandechocardiographicfindingsinasymptomaticpatientswithmorbidobesity:across-sectionalstudy[J].EndocrPract,2007,13:590-600.[4]FrancisVasseur,FrdricLeprtre,CorinneLacquemant,eta.lThegeneticsofadiponectin[J].CurrDiabRep,2003,3:151-8.[5]ChristophH.Saely,LorenzRisch,GuenterHoefle,eta.lLowserumadiponectinisindependentlyassociatedwithboththemetabolicsyndromeandangiographicallydeterminedcoronaryatherosclerosis[J].ClinChimActa,2007,383:97-102.[6]FumiyukiOtsuka,SeigoSugiyama,SunaoKojima,eta.lHypoadiponectinemiaisassociatedwithimpairedglucosetoleranceandcoronaryarterydiseaseinnon-diabeticmen[J].CircJ,2007,71:1703-9.[7]陶红，米树华，陈瑞，等.冠心病患者血清脂联素水平与炎性相关因子的研究[J].中华医学杂志,2006,86(增刊):327.[8]JongMinLee,SooRyangKim,SeJeongYoo,eta.lTherelationshipbetweenadipokines,metabolicparametersandinsulinresistanceinpatientswithmetabolicsyndromeandtype2diabetes[J].JIntMedRes,2009,37:1803-12.专题综述REVIEWARTICLES植物ABC转运蛋白及其在Al胁迫下的功能研究进展王康，徐慧妮，李昆志*(昆明理工大学生命科学与技术学院生物工程技术研究中心，云南昆明650224)摘要:ABC(ATP-BindingCassette)转运蛋白家族是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族，能利用水解ATP的能量来参与生物体内多种物质的转运，这一基因家族成员在哺乳动物和微生物中已广泛鉴定，在植物中的研究是一个相对较新的研究领域。铝是酸性土壤作物生产的一个主要的限制因素,ABC转运蛋白在植物铝耐受性方面有重要作用。该文主要对ABC转运蛋白的特点、生物学功能及植物ABC转运蛋白在Al胁迫下的作用进行了综述，并其存在的问题，展望今后可能开展的研究方向。关键词:ATP;ATP-BindingCassette；转运蛋白;Al胁迫；有机酸中图分类号:Q945.78;Q946.1文献标识码:Ado:i10.3969/.jissn.1004-311X.2010.05.176AdvancesinPlantABCTransportersandFunctionsunderAlStressWANGKang,XVHui-ni,LIKun-zhi*(BiotechnologyReasearchCenter,CollegeofLifeScienceandTechnologyKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650224,China)Abstract:ABC(ATP-BindingCassette)transportersconstitutedthelargestproteinfamilywiththemostvarietyoffunctions.MostofthemusedenergyofATPhydrolysistoparticipateinthetransportingofmanykindsofsubstrateinlivingorganisms.Themembersofthisproteinfamilyinmammalandmicroorganismhavebeenwidelystudied,whileinplantsABCtransportersisarelativelynewresearchfield.Aluminum(Al)toxicitywasamajorfactorlimitingcropgrowthinacidicsoi.lPlantABCtransportersplayedimportantrolesinplantAltolerance.Inthisreview,thecharacteristicsandbiologicalfunctionsofABCtransportersaswellastheroleofABCtransportersunderAlstressweresummarized,andmakesprospectsforitsexistenceproblemsandpossiblefutureresearchdirections.Keywords:ATP;ATP-Bindingcassette;transporter;Alstress;organicacid收稿日期:2009-12-02；修回日期:2010-05-05基金项目：云南省中青年学术技术带头人后备人才培养基金项目(2006py01-10)资助作者简介：王康(1985-)，女，在读硕士生，研究方向：植物营养基因工程,Emai:lwangkang858@163.com;*通讯作者：李昆志(1963-)，男，教授，博士生导师，从事植物营养基因工程研究,Emai:llikunzhikm@yahoo.com.cn。铝(Al)是地壳最丰富的金属元素。通常土壤中的铝以硅铝酸或其他沉淀物形式存在，对植物是无毒的。然而，在酸性条件下(pH<5)，铝以离子形式被释放到土壤(Al3+)，在微摩尔浓度级水平就可对植物产生毒害。一些植物物种和变种在受到铝胁迫后进化出应对铝毒的机制。近期研究表明,ABC转运蛋白(ATP-BindingCassette)在植物铝耐受性方面有89生物技术2010年20(5)重要作用。ABC转运蛋白超家族是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族，这一基因家族成员已在哺乳动物和微生物系统中广泛鉴定，在植物中的研究是一个相对较新的研究领域。关于ABC转运蛋白和植物铝耐受性关系方面未见系统报道，为此，作者对ABC转运蛋白及其在Al胁迫下的功能进行了综述。1ABC转运蛋白概述1.1ABC转运蛋白的结构特点在结构上,ABC转运蛋白一般都含有核苷酸结合域(NucleotideBindingFold,NBF)和高度疏水跨膜域(TransmembraneDomain,TMD)。每个NBF包含3个特征性基序:WalkerA盒[GX4GK(ST)],WalkerB盒[(RK)X3GX3L(hydrophobic)3],WalkerA盒和WalkerB盒间被C基序[(LIVMFY)S(SG)GX3(RKA)(LIVMYA)X(LIVMF)(AG)]约120个氨基酸隔开，其中C基序是ABC转运蛋白区别于其他包含Walker序列的NTP结合蛋白(如激酶)的特征性序列。每个TMD都含有多个跨膜的螺旋(在膜上TMD反复跨膜通常4~6次)，形成了溶质跨膜(或者从膜的一侧移动到另一侧)的通道，已被证明与底物特异性有关。亲水的NBF面向胞内，能结合并水解ATP供能，而疏水的TMD能够利用NBF释放的能量选择底物并跨膜转运底物。NBF在ABC转运蛋白家族不同的成员间序列相对保守，同源性通常为30%~40%[1]。ABC转运蛋白的结构域组织形式多种多样。通常，全分子的ABC转运蛋白包含2个NBF和2个TMD,4个结构域结合在一起才能执行转运功能。在大多数已鉴定的真核ABC转运蛋白中，最常见的排列方式是这4个结构域以正向方式TMD-NBF-TMD-NBF(如多药耐药相关蛋白MRP以及酵母中专门负责运出-性外激素的STE6转运蛋白)或者相反的NBF-TMD-NBF-TMD(如酿酒酵母中作为排出胞内有毒化合物泵的PDR5和SNQ2转运蛋白)反向方式连接在一条多肽分子上，形成全分子ABC转运蛋白[2,3]。一些ABC转运蛋白像果蝇色素转运蛋白仅含有1个NBF和1个TMD为半分子的ABC转运蛋白[4]。半分子的ABC转运蛋白通过形成二聚体或多聚体来实现功能，这种二聚体可为同二聚体，又可为异二聚体。不同的单体还可以在表达和纯化时提高相互的稳定性[5]。通常情况下NBF和TMD存在于不同的多肽上的转运蛋白称为1/4分子转运蛋白。也有许多ABC转运蛋白并没有参与运输，而是参与DNA修复、基因表达的转录和调控等细胞过程，如有些蛋白没有TMD域而是由两个NBF域融合在一起[6]。另外，一些ABC转运蛋白出现起调节作用的额外域，如囊性纤维变性膜透性调节蛋白(CFTR)的R-域。在细菌周质透过酶中，一个额外的亚基结合底物并传递至转运体中，这些周质结合蛋白也有与膜结合受体相互作用的能力并作为一个信号级联的一部分[4]。总之，各转运蛋白之间的氨基酸序列上虽有同源性，但结构差异巨大，这种差异可能与功能的差异有关。1.2ABC转运蛋白的生物学功能大多数ABC转运蛋白都能利用水解ATP的能量来驱动生物体内多种物质的转运，其中包括肽、糖、脂、重金属螯合物、多糖、生物碱、类固醇、无机离子和谷胱甘肽结合物等[1]。ABC转运蛋白不仅作为依赖ATP的泵发挥作用，而且作为离子通道和通道调节者起作用。这一基因家族成员在原核和真核生物中与细菌的耐药性、囊性纤维性变和肿瘤细胞的抗药性等一些重要的生理过程密切相关[7]。植物ABC转运蛋白在植物生长素的极性转运、脂质的降解、外源毒素的解毒、植物抗病、抗重金属和气孔的功能调节等一系列过程中发挥作用[8]。1.3植物ABC转运蛋白1992年出现了第一例植物ABC转运蛋白的报道，即从拟南芥中克隆到一个ABC转运蛋白AtPGPI基因(又称为AMtDRl)[9]。随着拟南芥基因组测序的完成，人们对植物基因组中的ABC转运蛋白的情况有了很多了解，序列分析显示拟南芥中有129个转运蛋白基因[10]，总共可分为13个亚家族:MDR、MRP、PDR、AOH、PMP、WBC、ATH、ATM、TAP、RLI、GCN、SMC和NAP亚家族。以拟南芥为例，通过与其他生物比较发现植物ABC转运蛋白超家族有一些显著的特征：含有PDR、AOH和ATH三个亚家族的成员；半分子转运蛋白含量相对较多；缺少一些在其他生物中介导重要转运功能的ABC转运蛋白，如囊性纤维变性膜透性调节蛋白(CFTR)、磺脲类受体(SUR)和重金属耐受因子1(HMTl)，包含了一类新的亚家族SMCn[11]。水稻的基因组大小约是拟南芥的3.5倍，但水稻和拟南芥编码的ABC转运蛋白基因总数几乎相同。水稻与拟南芥相比具有更多的PDR蛋白和较少的ABCA蛋白。OlivierGarcia等(2004)通过预测发现水稻和拟南芥只有约30个ABC蛋白具有直系同源序列。除了在水稻中没有检测到全长ABCA转运蛋白外，在两个物种均发现了所有类型的真核ABC系统[6]。AkifumiSugiyama等(2006)发现在豆科植物百脉根基因组中至少有91个ABC转运蛋白，组成特性分析发现在其基因组中至少有6个成员与AMtRP14类似和5个成员与AtPDR12类似。使用实时定量PCR分析检测发现，一些与AtPDR12类似基因可能参与结瘤的形成过程[12]。2植物ABC转运蛋白在铝耐受性方面的作用铝是酸性土壤作物生产的一个主要的限制因素。研究表明ABC转运蛋白在植物铝耐受性方面有重要作用。拟南芥根系在Al胁迫不同时间后的芯片分析发现了88个不同的ABC转运蛋白基因[13]，这说明ABC转运蛋白与别的解毒系统一起与Al胁迫有关。Al胁迫后甘蔗中也发现了ABC转运蛋白[14]。通过差异显示的,SasakiTakaayuki等(2002)从小麦根端分离了一个MDR类的ABC转运蛋白，并命名为TaMDR1[15]。TaMDR1在5~50mol/LAl浓度处理下表达。Al敏感植株中TaMDR1诱导所需的Al浓度低于Al抗性植株，说明TaMDR1的mRNA积累与Al毒害而不是Al抗性有关。TaMDR1被钙通道抑制剂镧、钆、钌红强烈诱导表达，此外，降低生长培养基中的钙离子浓度激活TaMDR1的表达。以上结果表明TaMDR1的诱导是由Al毒害早期钙离子平衡的破坏引起的。PaulB.Larsen等(2005)发现了一个编码拟南芥Al毒抗性的定位于韧皮部的ABC转运蛋白基因ALS3。Al存在条件下拟南芥的als3突变株的根系生长受到很大的抑制，这表明这一突变体导致植株缺乏铝耐受性必需的一个基因。通过图位克隆分离到一个编码类似ABC转运蛋白的新基因，该基因与具有细菌金属耐性作用的ybbM蛋白高度同源。ALS3的Northern印迹分析表明，它在所有检测的器官中均表达，这与als3突变株表现的全株铝敏感性症状相一致，并且铝处理后ALS3在根中的表达量增加。根据GUS融合和原位杂交分析,ALS3主要在叶的排水孔和韧皮部以及铝处理后的根皮层中表达。免疫定位表明,ALS3主要在表达ALS3的细胞质膜积累。这些结果表明,ALS3编码铝耐受性所必需的类似ABC转运体902010年20(5)生物技术的蛋白，可能将积累的铝重新分配使其远离敏感的组织来保护生长的根免受铝毒害[16]。另外，使用图位克隆技术,PaulB.Larsen等(2007)分离了als1-1突变体的基因，并发现它是未鉴定的半分子ABC转运蛋白At5g39040中的一个氨基酸被替换。GUS的分析显示ALS1的表达主要定位在根尖和贯穿植物的脉管系统。ALS1:GFP融合蛋白在根细胞的液泡膜积累，表明ALS1可能对一些底物的细胞内移动具有重要作用，可能螯合铝来作为铝耐受机制的一部分[17]。根系分泌有机酸、酚类化合物及粘胶物质与Al螯合是耐Al作用的生理生化机制之一,ABC转运蛋白亚家族在植物根分泌化学物质中特别重要,DayakarV.Badri等(2008)通过高效液相色谱-质谱法、气体色谱/质谱法对7个ABC转运蛋白突变体和野生型拟南芥的根分泌物质进行分析，发现相比于野生型,Atpdr6这一突变体分泌低水平的有机酸[18]，说明ABC转运蛋白亚家族可能参与有机酸的运输。在空泡隔离有毒化合物是植物避免伤害的一种重要的机制。GoodwinSB和SutterTR(2009)通过对铝胁迫下拟南芥基因组的芯片分析，发现参与空泡选择，结合与运输的基因(选择受体AtELP1和MRP-ABC转运蛋白)转录水平上调，这说明这些基因参与铝胁迫下穿过空泡膜的分子调节运输。ABC转运体家族的成员用来从胞浆运输有害化学物质入泡[19]。ChaoFengHuang等(2009)的研究表明,STAR1和STAR2两种基因与水稻铝耐受性有关。STAR1编码细菌型ATP结合盒(ABC)转运体的核苷酸结合域，而STAR2编码跨膜区，任一基因的破坏都导致植株对铝毒的超敏感性。STAR1和STAR2形成一个复合体，像一个ABC转运体一样起作用，这是水稻解铝毒所必需的。STAR1-STAR2定位于膜上可负责从细胞质运输UDP-葡萄糖进入囊泡。磷酸葡萄糖或由磷酸葡萄糖衍生而来的糖苷可能通过胞外分泌，由囊泡释放到质外体，以提高水稻对铝的耐受性。类似STAR1和STAR2的基因也存在于其他物种中，如玉米、拟南芥、葡萄，而且，有趣的是，也存在于最初陆生植物的模式生物苔藓植物类。这表明,STAR1/2是一种保存在陆生植物中的普遍的铝耐受机制[20]。3存在问题3.1植物ABC转运蛋白研究局限在植物中，最具特征的ABC转运蛋白是全分子的ABC转运蛋白亚家族，包括MRP、PDR和PGP亚家族[21-23]。已知MRP转运体作用于谷胱甘肽结合物和叶绿素代谢物，糖基结合物和葡糖苷酸的空泡隔离以及监控细胞离子通量[24]。PDR亚家族的成员在植物中参与运输抗真菌双萜防御化合物到叶片表面，保护植物免受外界异源物质的侵害，排除胁迫环境下胞内积累的有毒代谢物[25,26]。PGP亚家族的成员到目前为止的研究涉及到内源生长素的运输。但关于一些ABC转运蛋白亚家族如半分子转运体ATH亚家族的功能在植物中所知甚少。植物ABC转运蛋白家族群体庞大、功能复杂，对各个亚家族的具体功能仍需探索。3.2ABC转运蛋白和植物耐铝机制间的研究植物可通过根系分泌有机酸、酚类化合物及粘胶物质与Al螯合来抗A,lAl可能直接与其结合，然后激活一个膜蛋白或一个相关的受体，或者它可能通过胞质成分间接激活通道。两个最重要的通道蛋白家族是氯离子通道家族和ABC蛋白质超家族[27]。ABC转运蛋白家族可能参与有机酸或其他植物化学物质的运输来耐Al。在啤酒酵母中，一个ABC蛋白质Pdr12，协助羧酸盐排出[28]。研究表明，多个ABC转运蛋白可以参与一种给定的植物化学物质的分泌，并且一个ABC转运蛋白可以参与多种次生代谢产物的分泌。也有研究表明,ABC转运体家族的成员从胞浆运输有害化学物质入泡，在空泡隔离有毒化合物来应答铝胁迫。因此，不同ABC转运蛋白的运输底物及其在植物铝胁迫耐受性赋予中的具体机制还需要进一步的研究。另外，对植物耐铝机制的进一步研究将会开创分子生物学、植物生理学上研究的新途径，将更好地推进我们对ABC转运蛋白家族的了解。4展望铝是酸性土壤中农作物生长受限制的主要因素。植物在遭遇铝胁迫时，一系列细胞活动受到影响，包括抑制养分的吸收，引发活性氧的产生，使细胞壁松弛，干扰质膜的稳定性，影响细胞核分裂、细胞骨架的稳定性、胞质钙稳态、激素运输和信号转导，并且这些症状发生迅速[29,30]。目前研究表明,ABC转运蛋白在植物铝耐受性方面有重要作用。由于一些ABC转运蛋白的表达赋予植物铝抗性，在植物基因工程中利用ABC转运蛋白基因培育耐铝毒的植物品种，克服铝毒害具有重要的意义。植物ABC转运蛋白从结构到机理研究已有一定的进展，但是ABC转运蛋白家族群体庞大、功能复杂，需进一步弄清在植物铝耐受性方面起作用的ABC转运蛋白的种类以及不同ABC转运蛋白的运输底物，其在植物铝胁迫耐受性赋予中的具体机制也还需要进一步的研究。ABC转运蛋白研究的突破将为植物抗铝毒基因工程提供新的基因资源，并通过分子辅助育种和生物技术筛选培育耐铝能力强的作物品种，提高作物耐铝性。参考文献:[1]HigginsChristopherF.ABCtransporters:frommicroorganismstoman[J].AnnuRevCellBiol,1992,8:67-113.[2]SylwiaWojas,JacekHennig,SoniaPlaza,eta.lEctopicexpressionofArabidopsisABCtransporterMRP7modifiescadmiumroot-to-shoottransportandaccumulation[J].EnvironPollut,2009,157:2781-2789.[3]DavidSwarbreck,Pierre-JeanRipol,lDonnaA.Brown,eta.lIsolationandcharacterisationoftwomultidrugresistanceassociatedproteingenesfrommaize[J].Gene,2003,315:153-164.[4]TheodoulouFredericaL.PlantABCtransporters[J].BiochimBiophysActa,2000,1465:79-103.[5]WangZhanling,StalcupLindsayD,HarveyBrandyJ,eta.lPurificationandATPhydrolysisoftheputativecholesteroltransportersABCG5andABCG8[J].Biochem,2006,45(32):9929-9939.[6]OlivierGarcia,PhilippeBouige,CyrilleForestier,eta.lInventoryandcomparativeanalysisofriceandArabidopsisATP-bindingcassette(ABC)systems[J].JMolBiol,2004,343:249-265.[7]GottesmanMichaelM.,PastanIra.Biochemistryofmultidrugresistancemediatedbythemultidrugtransporter[J].AnnuRevBiochem,1993,62:385-427.[8]金宏滨，刘东辉，左开井，等.植物ABC转运蛋白与次生代谢产物的跨膜转运[J].中国农业科技导报,2007,9(3):32-37.[9]DudlerR,Hert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y;formaldehydedetoxification;propertiesofkeyenzymes;geneorganization收稿日期:2010-03-06；修回日期:2010-05-20基金项目：昆明理工大学人才培养基金项目(14118167)；云南省应用基础研究基金项目(2009ZC014X)；云南省教育厅科学研究基金项目(09C0106)资助作者简介：孟庆超(1985-)，女，在读硕士，研究方向：植物代谢基因工程,Emai:lmengqingchao0111@163.com。*通讯作者：陈丽梅(1963-)，女，教授，博导，从事植物代谢基因工程研究,Te:l-202,Emai:lchenlimeikm@yahoo.com.cn。甲基营养菌是一类能利用C1化合物作为碳源和能源生长的微生物。甲基营养菌中存在多种甲醛异化途径，如细胞色素连接的甲醛氧化途径、四氢叶酸(tetrahydrofolate,H4F)或四氢甲基蝶呤(tetrahydromethanopterin,H4MPT)依赖的甲醛氧化途径和硫醇(谷胱甘肽/真菌硫醇)依赖的甲醛氧化途径。H4MPT依赖的甲醛氧化途径是一条多种酶参与的代谢途92