糖醛酸测定方法(3)

糖醛酸测定方法一•间羟基联苯比色法1•原理：多聚己糖醛酸与含四硼酸钠的硫酸溶液在高温作用下水解  ，水解产物进一步与间羟基联苯反应，生成粉红色衍生物，产生紫外吸收，且在一定浓度范围内，该衍生物吸收值与糖醛酸含量呈线性关系，可通过比色法对糖醛酸含量进行计算。2.试剂配制：间羟基联苯溶液：称取0.15g间羟基联苯溶于5mg/mL氢氧化钠溶液中，定容至100mL，其质量浓度为1.5mg/mL.四硼酸钠/硫酸溶液：0.478g四硼酸钠溶于100mL浓硫酸中，备用葡萄糖溶液：称取葡萄糖25.00mg，加水溶解并定容至25mL混匀，成1mg/mL的标准溶液。（排除中性糖对测定结果的影响）半乳糖醛酸标准溶液：称取干燥至恒重的半乳糖醛酸25.00mg，加水溶解并定容至25mL，混匀，成1mg/mL的标准溶液。3.波长扫描：取半乳糖醛酸标准溶液0.50mL，置10mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀（质量浓度为0.05mg/mL）。量取溶液1.00mL置于20mL具塞试管，置冰水浴中，加入四硼酸钠/硫酸溶液6mL，待全部加完后，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5min，冰水浴中冷却后用微量加样枪加入1.5mg/mL间羟基联苯溶液100此，混匀后振摇5min，超声除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，用UV-2450型紫外可见分光光度计在200nm~800nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长。4.标准曲线的制备：取1mg/mL半乳糖醛酸标准溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL和0.6mL置于10mL容量瓶中，加水定容，再分别取上述各配制溶液1.0mL至于20mL具塞试管，置冰水浴中，加入四硼酸钠/硫酸溶液6mL，待全部加完后，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5min，冰水浴中冷却后用微量加样枪加入1.5mg/mL间羟基联苯溶液100L混匀后振摇5min，超声除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，在最大吸收波长处测定吸光度。5.样品测定：取样品5mg置100mL容量瓶，加水溶解定容至刻度。取溶液1.00mL按标准曲线项方法操作。6.中性糖影响：在一定浓度半乳糖醛酸标准溶液中，添加不同质量的中性糖（以葡萄糖为例），测得加入不同质量浓度的中性糖对半乳糖醛酸溶液吸光度的影响。高效液相色谱法A1.标准溶液的制备:精密称取半乳糖醛酸对照品205.4mg，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀,即得（每1mL中含半乳糖醛酸4.108mg）。精密吸取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0mL置于25mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀,制得0.116432、0.132864、0.149296、0.1657280.18216、0.198592、1.1150241.131456、1.147888mg/mL的系列标准溶液。2标准曲线的绘制：取配制好的半乳糖醛酸系列标准溶液，分别进样20让,按下面色谱条件测定半乳糖醛酸峰面积，以半乳糖醛酸峰面积为纵坐标，对照品浓度（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。求得回归方程。3.色谱条件色谱柱:Sugar-PakI（300mm>6.5mm）,流动相:0.0001mol/LEDTA水溶液,流速：0.6mL/min,示差检测器，柱温：90C,示差检测池温度：40C,进样量：20此。理论板数：以半乳糖醛酸峰计算，不得低于3000。高效液相色谱法B色谱条件  色谱柱：ZORBAXSAX4.6>250mm5-MicronAgilent;柱温：40°C；流动相：0.7mol/l乙酸；流速：1.0ml/min;测定波长：示差检测；示差检测器温度：40C；进样量：20丄。标准曲线的绘制：称取古洛糖醛酸标准品，用重蒸水溶解，配制成浓度为1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的标准溶液。分别进样10丄进行HPLC测定，以峰面积为纵坐标，相应标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线进行线性回归。样品处理与检测：准确称取300mg（精确至±）.0001）海藻酸钠或者海藻，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研钵中研磨2h，用100mL蒸馏水将其转移至250mL三角瓶，100C沸水浴加热2.5h，于自来水中冷却至室温，加入过量BaCO3粉末，充分反应至溶液pH为7左右，3000r/min离心，沉淀用150mL蒸馏水洗涤3次，将上清液和洗涤液合并在一起，45°C真空旋转浓缩后，定容至10mL,进样10丄进行HPLC测定。依据样品测定的峰面积和出峰时间，在相应的标准曲线查出所测组分的量，结合所取样品的质量和定容体积，计算出各组分的含量。三•咔唑一硫酸比色法（修改后）1.原理：半乳糖醛酸在硫酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其呈色强度与半乳糖醛酸含量成正比，可比色定量。2.对照品溶液的配制：精密称取干燥至恒重的半乳糖醛酸19.8mg,用适量的蒸馏水溶解，并定容于100ml容量瓶中，配成1984/ml的对照品溶液。使用时稀释至99冯/mlo四硼酸钠-硫酸溶液的配制：精密称取0.956g四硼酸钠溶解于200ml浓硫酸中，超声溶解，备用。咔唑溶液的配制：精密称取咔唑100mg,溶解于100ml无水乙醇中，配制成0.1%的咔唑溶液备用。4.半乳糖醛酸标准曲线制备：分别精密吸取对照品0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml溶液置于10ml具塞试管中，各管加水至0.5ml，分别在冰水浴中加入四硼酸钠—  硫酸溶液3ml，用漩涡混合器混匀，于沸水浴中加热5min,取出后立即冷却至室温，加0.1%咔唑溶液0.1ml，摇匀，煮沸5min，冷却至室温后在530nm处测定其吸光度。以浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标进行线性回归。方法学考察:⑤精密度试验取同一对照品溶液，重复测定5次。⑥稳定性试验取同一供试品溶液，每隔30min测定1次，共测定2h。⑦重现性试验取同一批号样品多糖5份，按测定法操作。⑧加样回收率试验精密称取已知含量多糖5份,分别精密加入葡萄糖醛酸对照品适量，测定吸收度，计算回收率。【下载本文档，可以自由复制内容或自由编辑修改内容，更多精彩文章，期待你的好评和关注，我将一如既往为您服务】