工业微生物分离基本方法

菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。第一节  含微生物样品的采集自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。（一）根据土壤特点1．土壤有机质含量和通气状况一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。从土层的纵剖面看，1～5cm的层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。2.土壤酸碱度和植被状况土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。3．地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。4．季节条件不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。（二）采样方法用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25处的土样10～25，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30处取样。给塑料袋编号并地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。二．根据微生物生理特点采样1.根据微生物营养类型每种微生物对碳\氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的３株石油降解菌菌株，分别为动胶菌属（Zoogloeasp.）、氮单胞菌属（Azomonassp.）和假单胞菌属（Pseudomonassp.）。当然，也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集，然后分离筛选。此外，不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物，也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。２.根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcusaquivivus）,它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。三、特殊环境下采样1．局部环境条件的影响值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷，年平均温度低，高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中，却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长，实际上也有一些嫌气菌生活，原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气，为嫌气菌创造了局部生长的有利环境，故一般土壤中也能分离到嫌气菌。海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来，但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现，20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外，美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA和DHA，最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg/L，在15℃培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋Thraustochvtriumaureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时，可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌，底层由于有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，两层中则多为紫硫菌。具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫，其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌，这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物，给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌，该菌以木质素为唯一碳源，它对处理过的花生壳的消化率可达到63%，再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%，可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。2．极端环境条件的影响微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊酶制剂方面有着巨大的应用价值。嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15℃，在0℃也可生长繁殖，最高温度不超过20℃。主要分布于寒冷的环境中，如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在8.0以上，通常在pH9～10之间的微生物，称之为嗜碱菌（alkaliphiles）。大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到。由于大部分碱湖伴有高盐，许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌。该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分，也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业。嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌。嗜热微生物是嗜热菌最好的来源。有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌。从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物，在pH2和90℃时生长最好，其代谢类型极不寻常，既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作为厌氧菌用氢还原硫，生成H2S。第二节  含微生物样品的富集培养富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。一、控制培养基的营养成分微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。当然，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养基的选择性只是相对的，它只是微生物分离中的一个步骤。现举两例，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此时分离将得到所需的微生物。又如要分离耐高渗酵母菌，由于该类菌在一般样品中含量很少，富集培养基和培养条件必须严密设计。首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养，可以达到富集的目的。在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。在配制时要特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子的产生。根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。移种的时间既可根据底物的降解情况，也可通过微生物的生长情况确定。如在分离环己烷降解菌时，样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后，培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色。同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况。此时可以2%的接种量移入新鲜的富集培养基中继续培养。连续富集培养的方法虽耗时较长，有时甚至需要6～7个月，但效果较好。通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了满意的结果。          二、控制培养条件在筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富集的目的。筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性，设计适宜的培养条件，达到富集的目的。一般所筛选的微生物通常是好氧菌，但有时也需分离厌氧菌。因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置，还可节省能耗。这时除了配置特殊的培养基外，还需准备特殊的培养装置，创造一个有利于厌氧菌的生长环境，使其数量增加，易于分离。        三、抑制不需要的菌类在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。另外据报道，重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接分离、纯化即可。第三节  微生物的分离经富集培养以后的样品，目的微生物得到增殖，占了优势，其他种类的微生物在数量上相对减少，但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起，即使占了优势的一类微生物中，也并非纯种。例如同样一群以油脂为碳源的脂肪酶产生菌，有的是细菌，有的是霉菌，有的是芽孢杆菌，有的不产芽孢，有的生产能力强，有的生产能力弱等等。因此，经过富集培养后的样品，也需要进一步通过分离纯化，把最需要的菌株直接从样品中分离出来。一、好气微生物的分离分离的方法很多，大体可分为两类：一类较为粗放，只能达到“菌落纯”，如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等。前两种方法由于操作简便有效，工业生产中应用较多。组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。另一类是较细的单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操作装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离。下面对这几种分离纯化方法分别加以介绍。        （一）    稀释涂布法把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等，样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。（二）    划线分离法用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。在样品含菌量较少或某种目的微生物不多的情况下，微生物的纯种分离方法可以简化如下：第一种方法，取一支盛有3～5ml无菌水的粗试管或小三角瓶，取混匀的样品少许（0.5g左右）放入其中，充分振荡分散，用灭菌滴管取一滴土壤悬液于琼脂平板上涂抹培养，或者用接种环接一环于平板上划线培养。这种方法不需要菌落计数，比以上常规稀释法简便。第二种方法，取风干粉末状的土样少许（几十毫克）直接洒在选择性分离培养基平板上或混入培养基中制成平板，置适温培养一定时间，长出菌落。例如分离小单孢菌就可采用该方法，从河泥中取样，风干研碎，取样品粉末20～50mg直接加到天门冬酰胺培养基中，混合均匀制成平板，培养后长出鱼卵状菌落。这种方法有时分离不够充分，可用划线法进一步纯化。（三）利用平皿的生化反应进行分离这是一种利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。1.透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。如要分离该酸水解酶产生菌，可用双层平板法，首先在普通平板培养基上把悬浮液涂抹培养，等长出菌落后覆盖一层营养琼脂，内含3%酵母RNA，0.7%琼脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42℃左右培养2～4h,四周产生透明圈的菌落，即为核酸分解酶产生菌。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时，由于乳酸是一种较强的有机酸，因此，在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用，还有酸中和作用。2.变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。在进行解脂微生物的分离时，虽然有很多精确的测定方法，如酸碱滴定法、电位滴定法、浊度滴定法、甘油滴定法及色谱法等，但由于步骤繁琐，不适于大规模筛选测定。为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色圈法，如以吐温为底物，尼罗蓝（Nileblue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。最常使用的方法是把恶秦染料中的维多利亚蓝和脂类底物混合，制成维多利亚蓝乳脂琼脂培养基平板，起始培养基调为中性，当土壤样品的悬浊液分离在平板上，具有脂解能力的菌落产生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，阳性解脂反应能显示粉红到蓝色的变化。如培养基起始pH为碱性，则阳性解脂反应从咖啡色到蓝绿色，能使脂类底物和解脂后的脂肪酸区别开来。后来又由Fryer等研究出一种改良的双层法，先在平皿内倒一层营养琼脂，把一张棉纸圆片在被维多利亚蓝染了色的乳脂中浸湿，铺在已凝固的琼脂表面，然后覆盖一薄层含样品的营养琼脂，保温培养，解脂菌落就可以在棉纸中产生蓝带。分解解脂细菌的培养基（％）为：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、琼脂2.0、大豆油5.0、维多利亚蓝4mg。分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可以用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基中，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落。培养基平板由两层组成，底层含明胶1.2％，酵母汁0.1％，蛋白胨0.4％，琼脂1.5％，待凝固后在其上覆盖一层琼脂，琼脂含量为0.7％，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氢钾缓冲液配制，配制浓度为0.083mol/L的吲羟乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上层琼脂中倒平板。通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙醇的菌株。在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。3.生长圈法生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。  同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工具菌用相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。4.抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。通常抗生素的筛选要投入极大的人力、财力和时间。据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的生产菌。因此设计一个准确、迅速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已经得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。在青霉素菌种选育中，还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株，做法如下：将产黄青霉孢子进行诱变处理，致死率约为99％。分离于琼脂平板上，控制孢子浓度，使长成独立菌落，一直培养到青霉素产量达到顶峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中，铺张于菌落平板表面，凝固后，培养17～20h。测量抑菌圈大小，根据有效指标（抑菌圈直径于菌落直径之比）选出高产突变株。由于现有抗生素种类多样，得到新的抗生素越来越困难。人们除了从一些特殊的地方如极端环境中采样分离抗生素的产生菌，也采用一些特殊的筛选方法，以期从普通土样中分离筛选倒新的微生物及新的抗生素。除上述的抑菌圈外，稀释法、扩散法、生物自显影法等也不同程度的得到应用。在这些方法中，检验菌的选择十分重要，直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素的活性和抗菌谱。如在筛选抗细菌抗生素时，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为检验菌来检验抗生素的抗性。采用联合检验菌，如枯草杆菌和绿色产色链霉菌活巴氏梭菌，可分离出抗菌活性低、对其他试验菌活性高的新抗生素，如黄色霉素族的抗生素，而这些抗生素在单独使用枯草杆菌时无法检出。海洋是新抗生素的重要来源。许多海洋生物体内都含有微生物，这些微生物为宿主抵御病害起着关键作用。因此，从鱼组织和虾消化道里分离筛选抗癌药物和抗炎症药物是一个有效地途径。已从水母体内筛到一种名为salinamide的抗生素，一种抗真菌抗生素istatin也从海洋生物体中分离出。在筛选抗霉菌抗生素时，需根据其特点进行筛选，因霉菌与哺乳动物细胞性质相似，为减少药物对人体的副作用，需挑选对霉菌有抗性但对人体安全的抗生素。由于哺乳动物不含几丁质，因此可先筛选抑制几丁质合成酶的生理活性物质，再从中筛选所需抗生素。三国霉素和多氧菌素就是通过该方法筛选得到的。抗病毒抗生素及抗肿瘤药物的筛选则可通过敏感细菌培养平板的噬菌斑来判断。采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，而且还能筛选某些酶类。四）组织分离法组织分离法是由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。如从患恶苗病的水稻组织中分离赤霉素，从根瘤中分离根瘤菌及从各种食用菌的子实体中分离孢子等。1.对一般有病组织的分离方法切除小块含菌组织，用干净水洗去组织表面污物。以10％漂白粉或0.1％升汞浸泡2～5分钟进行表面消毒，无菌水冲洗。将消毒后的组织移到平皿培养基上，置于适宜温度（25～26℃）培养一定时间，即可在组织周围四÷长出微生物。用肉眼或显微镜观察菌落，基本确认后挑入斜面培养基中培养。由这种方法挑选的菌株往往不纯，必须在琼脂平板上再分离纯化，然后挑取单个菌落于斜面，进一步筛选。从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌：取新鲜健壮的根瘤，经漂白粉或升汞溶液等进行表面消毒后，用无菌镊子将根瘤压破，取出汁液少许与分离培养基混合倒入平皿中，摊平，培养后在平板上长出菌落，经镜检观察后确认典型菌落，移入斜面。2.食用菌孢子分离法食用菌的孢子分离法通常有两种，即多孢子分离和单孢子分离。多孢子分离有混杂现象，不易筛选到优良稳定的菌株。因此，从育种角度最好采用单孢子分离。两种方法的分离步骤、方法介绍如下：（1）多孢子分离法取产量高、朵大、健壮无病并即将成熟的初生和单生子实体，用清水洗净表面污物，对子实体外有膜保护着的菇类，如蘑菇、草菇，在0.1%～0.2%升汞溶液浸泡2～3min，用无菌水冲洗数次。对子实体无膜外露的平菇等，不适于用升汞溶液浸泡，要用75%的酒精进行表面消毒，再用无菌水冲洗。食用菌的孢子着生在子实体的腹面的菌褶上，成熟时会自动弹出来。孢子采集装置：用一条两端弯成钩的铁丝，一端钩着一块成熟的蚕豆大子实体，另一端挂在三角瓶的瓶口上。三角瓶内事先制备好马铃薯—蔗糖培养基平板。悬挂的子实体距离培养基平板2～3cm。适温培养1～2天，就有孢子陆续弹落于三角瓶底部的培养基上，经过4～5天，孢子萌芽成菌丝，及时将菌丝尖端接入到斜面培养基上培养，然后进行生产性能对比试验。（2）单孢子分离法取一条铁丝，弯曲成蚊香支架形状，放在已消毒的玻璃板上。将消毒后的子实体悬挂在支架上方，下方置一个已灭菌的去盖的培养皿，然后罩一个钟罩，周围缝隙用凡士林封好。将这套孢子收集器移到恒温室内培养1～2天，将有大量孢子弹到平皿上，收集孢子（图6.2）。以上操作全部在超净台或无菌室内进行。将收集到的孢子用稀释法在马铃薯—蔗糖培养基平板上进行单孢子分离，培养后把单孢子长出的菌落移接到斜面上，进行生产性能比较试验。（五）单细胞或单孢子分离法采用特殊的仪器设备进行单细胞或单孢子的分离。具体方法有多种，现主要介绍柠檬酸产生菌采用的小滴分离纯化方法。操作如下：将待纯化的孢子悬液稀释约为1500ml-1，用校正口径的滴管（每毫升400滴）吸取孢子并均匀滴于无菌干燥盖玻片上，将其小心翻转于凹玻片的孔穴上，穴内加一滴已灭菌的培养液，盖玻片和载玻片用凡士林密封。显微镜下观察每个小滴，将只有一个孢子的小滴位置作好记录，恒温培养，挑取单菌落于斜面。除用凹玻片，还可用滤纸进行单细胞或单孢子分离。具体作法如下：取与皿内径大小一致的滤纸3～4层，浸在培养液中，取出放在空皿内，在滤纸上滴几滴甘油以防干燥，盖好皿盖，灭菌。将稀释为1500ml-1的孢子悬液用上述滴管滴在滤纸上，每皿约点20点滴左右，经恒温培养，每滴约出现10个菌落，将单菌落移接于斜面上。该方法能够得到单细胞或单孢子，较为精确，但操作时要细，否则不易得到理想结果。（六）特殊菌类——环保降解菌的分离自然界存在着大量废物及污染物，如多环芳烃（PAHs）、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃等。在分离筛选这类物质的降解微生物由于该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养。不能利用该物质的微生物由于得不到营养被淘汰，能分解该物质的微生物则正常生长。经过几个月的连续培养后，将富集培养液划线或涂布于分离平板上，便能筛选到所需的环保降解菌株。分离平板可采用该污染物为底物的鉴别培养基，通过水解圈变色圈进一步提高筛选效率。采用该方法分离苯胺、DDT、甲基对硫磷（MP）石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。如王倩如等人从经甲胺磷农药废水长期驯化的活性污泥中，筛选到能高效降解甲胺磷农药的蜡状芽孢杆菌（Bacilluscrerus）和嗜中温假单孢菌（Pseudomonasmesophilica），两株混合菌对有机磷的去除率达99.7%。在筛选环保降解菌时需注意，某些有毒污染物由于本身对微生物的生长有抑制作用，如果直接在培养基中加入该物质连续富集培养，可能效果不佳。这时就需根据不同的情况设计更合理的筛选模型。如Harris在分离以氯化物为氮源的细菌时，把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的HCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到分解氰化物的菌株。由于塑料工业的发展，环境中到处都有各种高分子包装废弃物，这些污染物多为不溶于水的高分子化合物，获得其降解菌株较为困难。通常采用富集法进行筛选，如日本的小野胜道教授以低浓度聚乙烯作为富集培养基对土壤微生物进行驯化，分离到了三种能降解聚乙烯的细菌。在淀粉塑料的降解试验中，采用加富土壤淹埋法，筛选到的降解微生物主要是霉菌与放线菌。这可能是因为丝状体更容易深入共混物内部生长。尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均匀，由于聚乙烯的流动性好，因而在吹塑过程中膜表面的聚乙烯含量偏高，使细菌在初期很难降解这类共混物，所以在降解菌的研究方面应着重考虑霉菌与放线菌。除驯化培养进行降解菌的筛选外，还可采用阶段式筛选法。如在分离聚乙二醇降解菌时，可先筛选能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇的微生物，再从中筛选能降解聚乙二醇的菌株，也能达到较好的效果。除寻找能够降解废旧塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代现有塑料。目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纤维素类生物降解塑料等。有些生物降解塑料是以简单的物理共混工艺，将淀粉填充到聚乙烯等树脂内，淀粉可以被微生物分解，但树脂分子骨架在很长时间内仍分解不了，反而为废弃塑料的回收增加了困难。而一些聚脂类高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羟基丁酯（PHB）相类似的结构，无毒，且能在酸、碱和微生物条件下完全降解，同时具有良好的塑性，用途宽广的多。用微生物发酵法生产的聚β-羟基脂肪酸（polyhydroxyalkanoicacid,PHAs）也成为研究生物降解塑料的热点，其中利用真氧产碱杆菌（Alcaligtneseutrophus）合成PHB的研究最多。另外，还有固氮菌（Azotobacter）、假单胞菌（Pseudomonas）、生丝微菌（HyphomicrobiumX）、菌宿根瘤菌（Rhizobiummeliloti）、嗜盐杆菌（Halobacteria）等。目前人们已经克隆到PHAs合成途径的关键酶基因，包括：phbA(β酮硫裂解酶基因)、phbB(依赖NADPH的乙酰CoA还原基因)、phbC（PHB合成酶基因）。许多实验室已在进行酶基因导入E.coli的工作，期望利用E.coli大批量合成PHB。总之，利用廉价碳源的高产菌株的发现与选育是降解塑料领域中最有意义的研究之一。生物谷网站http://www.bioon.com二、通过控制培养和培养条件进行分离各种微生物对营养要求和培养条件是不同的，在分离筛选时若在这两个方面加以调节控制，就能获得更好的分离效果。1.培养基的营养成分各种微生物对碳源、氮源要求各异，有的对营养还有特殊的要求，事先了解被分离微生物的营养要求，从而设计一个合理快速的分离培养基，能够收到事半功倍的效果。放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源。在选择分离放线菌时，通常采用改良的HV琼脂培养基、土豆-胡萝卜水汁液培养基和淀粉琼脂培养基能取得较好的效果。但不同菌种对营养要求差别很大，如奴卡氏菌在有氧条件下用普通培养基即可分离到，而以色列放线菌则在有CO2存在且有适宜培养基的情况下才能正常生长繁殖。筛选水解酶产生菌时，通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分离，如以淀粉为碳源的培养基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分离培养基，可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培养基，可以鉴别蛋白酶的产生菌。纯种分离时，把以上琼脂平板置于适宜的温度培养一定的时间，如具有产生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根据圈的大小可初步判断酶活力强弱。测定水解圈直径与菌落直径之比，把比例大的菌落移入斜面保藏，供进一步筛选。2.培养基的pH细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱，霉菌和酵母菌要求偏酸。因此，分离培养基的pH应该调节到被分离微生物要求范围。这不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。例如，分离柠檬酸产生菌的黑曲霉，就是利用调节培养基的酸碱度获得成功的。其分离方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸10%～20%配成培养液，调节pH2.0～2.5，以一定量的培养基和土样均匀混合，用毛细吸管点种在平皿内事先覆盖的无菌滤纸上（2～3层），于30℃培养，这样可以分离到产生柠檬酸的黑曲霉。分离碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时，可以把培养基调到pH9～11，在此范围内不宜生长的微生物被抑制，这对分离本身起到浓缩作用。大多数水解酶的生长最适pH基本相近，而酶的作用pH未必与产酶pH相同。培养基的pH要结合营养成分和培养条件来考虑。因为微生物在生长繁殖过程中，由于代谢作用会产生酸性或碱性产物，pH发生变化，微生物生长受到抑制。一般培养基中碳氮比（C/N）高者，培养后倾向于酸性，反之则倾向于碱性。无机盐的性质也会影响pH变化，（NH4）2SO4是生理酸性无机氮源，其中NH4+被菌体利用，留下SO42—，培养液变成酸性。而NaNO3是生理碱性氮源，其中NO3—被菌体分解利用后，剩余Na+，使培养液变成碱性。如发酵过程缺氧，则代谢向有机酸合成方向进行，pH下降。为了维持培养基的ph，一般要加磷酸盐，如K2HPO4、KH2PO4，使培养基具有一定的缓冲能力。如果培养液中的酸碱变化很大，磷酸盐的缓冲容量不足以调节pH变化，则可适当加入碳酸钙，以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类，使培养基的pH能保持在恒定的范围内。此外，在分离霉菌时，加几滴乳酸不仅可以维持一定酸碱度，而且可以抑制细菌的生长。3.排除不需要的菌类采取调节pH的方法来抑制非目的微生物的生长，虽然能起到一定的作用，但并不是对所有的菌类都有效。有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长，而个别的霉菌，也同样可以在中性或偏碱的培养基中生长。为了更有效地抑制非目的微生物的生长，要加入一些专一性的抑制剂。（1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50U/ml制霉菌素，可以抑制霉菌和酵母菌的生长。（2）分离放线菌时，在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长，还能激活放线菌孢子的萌发。加入氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。（3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml，可以抑制细菌和放线菌生长。（4）分离根霉和毛霉时，由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落，通常在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。一般用于分离单一目的微生物的培养基中均含有抑制其他微生物的抑制剂，这些专用的抑制剂在小型实验室配制较麻烦，现已有成品供应，只要直接加入基础培养基即可。如氨苄西林，主要用于分离亲水气单孢菌。4.控制培养温度控制培养温度，也是一种获得目的微生物的有效措施。各类微生物生长温度不同，从大范围来看，可分三大类：一类是高温微生物，最适温度在50～60℃。如果要分离这类菌可将分离培养基置于50～60℃温度下培养，能抑制一些嗜冷、中性微生物生长，可以有效地分离到高温菌类。第二类是中温微生物，它们的最适生长温度是20～40℃，超过50℃，就停止生长。这类微生物最为常见，、数量都占首位。工业发酵微生物绝大多数都属于此类。其中不同类群微生物对温度又有所差别，一般细菌、放线菌最适温度为25～37℃，霉菌和酵母最适温度为20～28℃。第三类为低温微生物，它们的最适温度为15℃或更低。当从样品中分离各种菌类时，分别置于自身最适温度下培养也可大体上抑制另一些微生物的生长。当分离某些特殊产物的微生物时，对温度的选择还需考虑某些内在的关系，如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时，由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高，其凝固点越低，即细胞在较低温度下仍能表现出活力，因此在低于正常温度10℃下分离效果最好。三、厌气菌的分离好气菌要在有氧条件下培养，嫌气菌要在厌氧状况下才能生长。工业发酵所用菌种为厌气菌的有丙酮丁醇的梭状芽孢杆菌，白酒增香用的丁酸菌、己酸菌及用于环境污水处理和水产养殖用的光合菌、反硝化菌、脱氮排硫杆菌等。它们生长于水底层及沉积物中，要从样品中分离这类菌，需采取厌气培养法，否则菌体因接触氧气而死亡。因此，培养过程中要除去氧气，现介绍如下几种方法：    （一）加还原剂分离培养基内加入还原剂，如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充CO2或N2也可），于室温培养。      （二）焦性没食子酸法焦性没食子酸和NaOH互相反应除去氧气。操作时，先将焦性没食子酸放在容器中，把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内，然后加入NaOH溶液，立即盖上盖子，并用石蜡或凡士林密封，放到室温下培养。要除去100ml空气中的氧气需要焦性没食子酸固体1g和10%NaOH溶液10ml。    （三）平皿厌气培养法取无菌培养皿一套，在皿盖内    到上分离培养基，凝固后，皿底一侧放焦性没食子酸固体，另一侧放10%NaOH溶液，使二者不相接触。准备完毕，在凝固的琼脂平板上迅速把含厌氧菌样品进行划线，然后盖上皿盖并密封，摇动平皿使焦性没食子酸固体和NaOH溶液混合，发生化学反应，除去皿内的氧气，置适宜温度下进行培养。